木犀草素功能性脂质体制备处方工艺优化及其对Hep3B细胞的影响

Optimization of the preparation process for functional liposomes containing luteolin and their effects on Hep3B cells

摘要

目的 优化转铁蛋白修饰的木犀草素（Luteolin，LUT）功能性脂质体的制备工艺，并考察其对Hep3B细胞的影响。 方法 采用薄膜分散法制备转铁蛋白修饰的木犀草素脂质体（Transferrin-modified luteolin-loaded liposomes，TF-LUT@LIP），以包封率为指标，通过单因素考察和响应面优化法优选最佳制备工艺，并通过CCK-8法和细胞摄取试验考察其对Hep3B细胞活性及摄取情况的影响。 结果 最佳处方制备工艺条件为：胆脂比为1∶6.906，药脂比为1∶21.267，超声破碎功率为38％（总功率为650 W），水化温度为50 ℃，响应面法优化后的木犀草素脂质体平均包封率为96.94％；且当靶向分子投入量为3％时，所制备的TF-LUT@LIP包封率达（95.31±0.03）%，平均粒径为（184.53±0.61） nm，电位为（-23.800±0.500） mV，形态圆整，稳定性良好；TF-LUT@LIP对Hep3B细胞的抑制作用强于游离LUT，并呈浓度依赖性，且与非靶向脂质体相比，TF-LUT@LIP的摄取行为更明显。 结论 按照最优制备工艺制备的TF-LUT@LIP包封率高、形态规整、粒径均匀，且对Hep3B细胞的抑制作用明显，细胞摄取行为良好。

Abstract

Objective To optimize the preparation process of transferrin modified functional liposomes of magnolol and to investigate their effects on Hep3B cells. Methods Transferrin-modified luteolin-loaded liposomes（TF-LUT@LIP） was synthesized using the thin-film dispersion method. The encapsulation efficiency served as the evaluation criterion. Optimal preparation conditions were determined through single-factor experiments and response surface optimization. The effects on Hep3B cell viability and uptake were assessed via CCK-8 assays and cellular uptake experiments. Results The optimal formulation preparation conditions are as follows： bile-to-lipid ratio of 1∶6.906， drug-to-lipid ratio of 1∶21.267， ultrasonication power of 38% （total power 650 W）， and hydration temperature of 50 ℃. The response surface methodology-optimized luteolin liposomes achieved an average encapsulation efficiency of 96.94%. When the target molecule loading was 3%， the prepared TF-LUT@LIP exhibited （95.31±0.03）%， an average particle size of （184.53±0.61） nm， a zeta potential of （-23.800±0.500） mV， and excellent stability. TF-LUT@LIP exhibited stronger concentration-dependent inhibitory effects on Hep3B cells than free luteolin （LUT）. Compared to non-targeted liposomes， TF-LUT@LIP demonstrated significantly enhanced uptake behavior. Conclusion TF-LUT@LIP prepared via the optimal synthesis process exhibits high encapsulation efficiency， uniform morphology， and consistent particle size distribution. It demonstrates significant inhibitory effects on Hep3B cells and exhibits favorable cellular uptake behavior.

Graphical abstract

关键词

木犀草素 / 转铁蛋白 / 脂质体 / 响应面优化 / Hep3B细胞

Key words

Luteolin / Transferrin / Liposomes / Response surface optimization / Hep3B cells

木犀草素（Luteolin，LUT）属于天然黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及肝脏保护等多重药理作用^［1-3］。虽然木犀草素具有显著的药理活性，但其临床应用受到水溶性差和生物利用度低的限制^［4］。此外，木犀草素还缺乏靶向病灶组织的能力，若为提高疗效而增加给药剂量，药物易在非靶组织中分布蓄积，进而引发潜在的脱靶毒性^［5］。为克服木犀草素的临床应用局限性，近年来文献报道了多种新型剂型或给药系统，所涉及的制剂技术主要包括：固体分散体、微粒给药系统（如聚合物胶束、脂质体、纳米乳、微乳）、包合物、磷脂复合物、水凝胶及微针等^［6-9］。脂质体由磷脂等天然成分组成，结构与细胞膜相似，通常被认为具有良好的生物相容性和生物可降解性^［10］。相较于其他递送系统，脂质体可将亲水性药物包封于内部水相，疏水性药物镶嵌于双分子层中，能够实现对不同性质药物的有效包载^［11］。不仅如此，通过使用多肽、抗体、糖、配体和核酸适配体对脂质体表面进行修饰，可使脂质体获得主动识别并结合靶细胞表面特异性受体的功能，实现药物的靶向递送，从而提高靶部位的药物浓度^［12-13］。研究表明，采用转铁蛋白修饰的雷公藤甲素脂质体，能够靶向肝癌细胞表面过表达的转铁蛋白受体，从而显著增强其体内抗肿瘤作用，提示该制剂在肝细胞癌治疗中具有应用潜力^［14］。本文采用薄膜分散法制备转铁蛋白修饰的木犀草素脂质体（Transferrin-modified luteolin-loaded liposomes，TF-LUT@LIP），通过单因素试验结合Box-Behnken设计-响应面法优化其制备工艺，并利用CCK-8法和细胞摄取试验分别评估该脂质体对Hep3B细胞活力及细胞摄取能力的影响，以期为木犀草素的进一步开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验试剂

木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院）；木犀草素（安徽泽升科技有限公司）；胆固醇（广州硕谱生物科技有限公司）；大豆卵磷脂（上海麦克林生化科技股份有限公司）；DSPE-MPEG2000和DSPE-PEG2000-FITC，均购自艾伟拓（上海）医药科技有限公司；DSPE-PEG2000-Transferrin（西安瑞禧生物有限公司）；氯仿（西陇科学有限公司）；甲醇（霍尼韦尔贸易有限公司）；DMEM高糖培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胎牛血清（新西兰，NEWZERUM公司）。

1.1.2　主要仪器

分析天平（瑞士，梅特勒-托利多，型号：ME104E）；旋转蒸发仪（上海一恒科学仪器有限公司，型号：R-1001-VN）；高效液相色谱仪（美国，安捷伦科技有限公司，型号：1260Ⅱ）；激光纳米粒度与Zeta电位分析仪（英国，Malvern公司，型号：Nano ZS90）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：JY92-IIN）；激光共聚焦显微镜（卡尔·蔡司股份公司，型号：LSM900+AIRYSCAN）；细胞培养箱（冰山松洋生物科技有限公司，型号：MCO-170）；超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司，型号：ZHJH-C1112B）；酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，型号：Multiskan FC）；大容量台式高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司，型号：STIR PLUS）。

1.2　实验方法

1.2.1　色谱条件

本实验采用Proshell HPH-C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇-0.3%磷酸水溶液（60∶40，V/V）作为流动相，设置柱温为35 ℃，检测波长为350 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

1.2.2　溶液的制备

⑴对照品溶液：精密称取木犀草素标准品2.5 mg，用甲醇溶解并定容，制成浓度为100 μg/mL的储备液；⑵供试品溶液：精密量取木犀草素脂质体溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇破乳后定容至刻度，摇匀；⑶空白脂质体溶液：取空白脂质体样品，采用与供试品溶液相同的方法处理制得。

1.2.3　方法学考察

⑴绘制标准曲线：精密吸取对照品溶液，用甲醇稀释成质量浓度分别为2.00、5.00、10.00、20.00、40.00、50.00 μg/mL的木犀草素溶液。以峰面积为Y轴、质量浓度为X轴，绘制标准曲线；⑵专属性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液与空白脂质体溶液，按1.2.1项下色谱条件进样检测，记录各溶液的HPLC图谱；⑶精密度试验：取对照品溶液，用甲醇分别稀释为低（5 μg/mL）、中（10 μg/mL）、低（20 μg/mL）3个浓度溶液，连续进样6次，记录峰面积并计算其相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）；⑷重复性试验：按1.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件进样检测，测定每份供试品溶液中木犀草素的含量并计算其RSD；⑸稳定性试验：取供试品溶液，在室温下分别放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后按1.2.1项下色谱条件进样检测，记录其峰面积并计算其RSD。

1.2.4　脂质体制备

木犀草素脂质体（LUT@LIP）：采用薄膜分散法^［15-16］制备，具体步骤如下：按一定比例称取大豆卵磷脂、胆固醇及木犀草素溶解于适量氯仿-甲醇（2∶1）溶剂中，待完全溶解后进行减压蒸发，直至茄形瓶内壁形成均匀的脂质薄膜，加入20 mL超纯水，充分振摇使薄膜水化脱落并进行超声处理，即得木犀草素脂质体溶液，于4 ℃条件下保存备用。同法制备不含药物的空白脂质体。

TF-LUT@LIP：采用薄膜分散法制备，将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-MPEG2000、DSPE-PEG2000-Transferrin及木犀草素，溶解于适量氯仿-甲醇（2∶1）溶剂中，完全溶解后参照LUT@LIP的后续步骤制备。

1.2.5　包封率测定

采用膜过滤法^［17-18］。取1.0 mL木犀草素脂质体溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，精密吸取0.4 mL续滤液，加甲醇超声破乳后定容至10 mL，HPLC测定后，记录其浓度记为C₁，即为包封于脂质体中的药物含量；另精密吸取木犀草素脂质体溶液0.4 mL，加甲醇超声破乳后定容至10 mL，HPLC测定，其浓度记为C₂，即为总的药物含量。按以下公式计算包封率：

\mathrm{包封}\mathrm{率}(EE\mathrm{\%})=\frac{C_{\mathrm{1}}}{C_{\mathrm{2}}}\times \mathrm{100}\%

1.2.6　单因素试验

考察以下因素对脂质体包封率的影响：胆脂比（胆固醇∶大豆卵磷脂）质量比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10；药脂比（木犀草素∶大豆卵磷脂）质量比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；超声功率分别为20%、30%、40%、50%（总功率为650 W）；水化温度分别为30、40、50、60 ℃。筛选出3个影响显著的因素进行进一步分析。

1.2.7　响应面优化

使用Design Expert软件，采用Box-Behnken设计，选取1.2.6中对包封率影响显著的胆脂比（A）、药脂比（B）和超声功率（C）作为影响因素，以木犀草素包封率作为评价指标，采用响应面法优化木犀草素脂质体制备工艺，以探索出最佳制备参数，因素水平见表1。

1.2.8　靶向分子投入量考察

按照“1.2.7”中的最佳配方制备脂质体，设置DSPE-PEG2000-TF的添加量分别为2%、3%、4%、5%，测定各脂质体的包封率，考察不同添加量对包封率的影响。

1.2.9　粒径、Zeta电位及形态分析

粒径和Zeta电位：采用Nano ZS90激光纳米粒度与Zeta电位分析仪于室温条件下对样品的平均粒径与表面Zeta电位进行测量，每个样品重复测定3次。形态：取稀释后的样品液20 μL，滴加于覆有碳支持膜的铜网上，静置3～5 min；用滤纸从边缘吸除多余液体。随后滴加2%磷钨酸溶液负染1～2 min，再次吸除染液，室温自然干燥后，即可进行透射电镜观察。

1.2.10　贮藏稳定性考察

对TF-LUT@LIP定期检测包封率，为期4周，取适量脂质体溶液于4 ℃放置0、7、14、28 d后，测定其包封率，考察TF-LUT@LIP的贮藏稳定性。

1.2.11　体外细胞毒性实验

采用CCK-8法考察游离木犀草素（LUT）、LUT@LIP、TF-LUT@LIP的体外细胞毒性。将Hep3B细胞以6×10³个/孔接种于96孔板，细胞贴壁后，更换含药培养基，加入不同浓度（0、10、20、40、80、160 μmol/L）的LUT、LUT@LIP、TF-LUT@LIP溶液，每组设6个复孔，培养24 h。弃去培养液，每孔加入10% CCK-8工作液100 μL，避光孵育后，于450 nm处测定吸光度（A）。最后计算细胞存活率，细胞存活率（%）=［（A₁-A₂）/（A₃-A₂）］×100%（A₁为实验孔吸光度，A₂为空白孔吸光度，A₃为对照孔吸光度）。

1.2.12　细胞摄取试验

以DSPE-PEG2000-FITC为荧光探针，按照“1.2.4”方法制备FITC标记的木犀草素脂质体（FITC-LUT@LIP）和FITC标记转铁蛋白修饰的木犀草素脂质体（FITC-TF-LUT@LIP）溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。将Hep3B细胞接种于24孔培养板（先放置细胞爬片）中，以1.5×10⁴个/孔，培养24 h后，弃掉原培养基，分别加入含有FITC-LUT@LIP和FITC-TF-LUT@LIP的培养基，继续孵育12 h。吸除培养基，用PBS轻轻洗涤3次，以4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗涤3遍，取出细胞爬片，用含DAPI封片剂进行封片，通过激光共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。

1.3　统计学处理

所有试验平行测定3次，数据以\overline{x}±s表示，采用Design Expert13.0设计响应面试验，使用GraphPad Prism 8统计软件进行数据分析，多组均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　方法学考察

⑴标准曲线：以木犀草素浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，所得回归方程为Y=37.696X-8.467 2，相关系数R²=0.999 9，表明木犀草素在2～50 μg/mL的质量浓度范围内线性关系良好；⑵专属性试验：由图1可见，木犀草素对照品在2.9 min处出现特征色谱峰，峰形对称、分离度良好；木犀草素脂质体供试品溶液中，药物峰保留时间与对照品一致，无拖尾、重叠现象；且空白脂质体溶液在木犀草素特征保留时间处无杂峰干扰；⑶精密度试验：3个浓度峰面积RSD值分别为0.07%、0.18%、0.38%，表明该方法精密度良好；⑷重复性试验：6份平行制备的供试品溶液含量测定结果的RSD值为2.19%，表明本方法的重复性良好；⑸稳定性试验：供试品溶液于室温下放置24 h内的RSD为0.40%，表明其在室温下24 h内稳定性良好。

2.2　单因素试验

2.2.1　胆脂比对木犀草素脂质体包封率的影响

结果如表2所示，胆脂比从1∶4增至1∶10，包封率先升高后降低，在胆脂比为1∶6时达到峰值。

2.2.2　药脂比对木犀草素脂质体包封率的影响

结果如表3所示，药脂比从1∶5增至1∶25，包封率先升高后降低，在药脂比为1∶20时达到峰值。

2.2.3　超声功率对木犀草素脂质体包封率的影响

结果如表4所示，随着超声功率的逐步提升，脂质体包封率从（57.38±0.09）%升高至（74.50±0.27）%再降低至（68.61±0.81）%，其中超声功率为40%（260 W）时，包封率较高。

2.2.4　水化温度对木犀草素脂质体包封率的影响

结果如表5所示，随着水化温度的逐步升高，脂质体包封率呈现先升高后降低的变化趋势，但总体趋势变化不大，当水化温度为50 ℃时，包封率较高。

2.3　响应面优化

2.3.1　实验设计与结果

使用Design Expert软件，选取胆脂比（A）、药脂比（B）和超声功率（C）作为影响三因素，响应面设计结果见表6。

2.3.2　数据处理与分析

使用Design-Expert分析表7，经二次回归拟合得到包封率（Y）的预测模型如下：Y=92.54+10.63 A+3.42 B+0.29 C+4.09 AB-0.89 AC-2.67 BC-14.75 A²-4.51 B²-5.40×C²（R²=0.98，F=45.71，失拟项F=1.31，P=0.39）。方差分析显示，回归模型整体P<0.000 1，具有高度显著性；失拟项P=0.39>0.05，说明所选模型合理且拟合效果良好；此外，变异系数CV为2.93%，小于10%，说明实验数据变异较小，预测值与实际值之间相关性较高，模型能够较好地反映实际过程。其中一次项A、B，二次项A²、B²、C²以及交互项AB显著影响木犀草素脂质体包封率（P<0.05），一次项C和交互项AC、BC不显著。由F值大小可知，各因素对木犀草素脂质体包封率的影响作用贡献大小为：胆脂比（A）＞药脂比（B）＞超声功率（C），两两因素对综合评分影响的效应面曲面图见图2。

2.3.3　最佳工艺预测与验证

按软件计算分析得出的最佳处方制备工艺条件为：胆脂比为1∶6.906，药脂比为1∶21.267，超声破碎功率为38%，预测木犀草素理论包封率96.01%，工艺验证结果见表8。

2.4　靶向分子投入量考察

按照“2.3.3”项下最佳处方工艺制备脂质体，分别加入占磷脂总质量2%、3%、4%、5%的靶向材料DSPE-PEG2000-TF，探究靶向分子投入量对脂质体的影响。结果显示，靶向分子投入量为3%时，脂质体包封率达（95.31±0.03）%，高于靶向分子投入量为2%［（92.56±3.63）%］、4%［（94.85±0.50）%］及5%［（94.46±0.93）%］时，且此时外观性状最优。因此，确定3%为靶向分子的最佳投入量。

2.5　粒径、Zeta电位及形态分析

2.5.1　粒径、Zeta电位

采用粒度测定仪测定TF-LUT@LIP的粒径分布和Zeta电位。粒径呈正态分布，如图3A所示，TF-LUT@Lips粒径呈正态分布，均一性良好，粒径为（184.53±0.61） nm，多分散系数（Polydispersity index，PDI）为0.260±0.010；由图3B可见，Zeta电位为（-23.800±0.500） mV，表明该脂质体表面带负电荷。

2.5.2　形态分析

置于透射电镜下观察样品的微观形态，结果见图4，脂质体形态圆整，大小均匀。

2.6　贮藏稳定性考察

TF-LUT@LIP经4 ℃、避光贮藏4周后，包封率保持稳定，各贮藏时间点包封率均维持在93%～96%，无明显下降趋势，证实该脂质体制剂具备良好的贮藏稳定性。

2.7　体外细胞毒性实验

体外细胞毒性实验结果如图5所示，LUT、LUT@LIP和TF-LUT@LIP均呈浓度依赖性抑制Hep3B细胞活性。当药物浓度超过40 μmol/L时，与LUT组相比，TF-LUT@LIP组表现出显著的抗增殖效果。IC50定量分析进一步证实，TF-LUT@LIP对Hep3B细胞的IC50值为（39.54±2.90） μmol/L，较游离LUT（113.73±8.33） μmol/L降低约65.2%，较LUT@LIP（66.57±4.19） μmol/L降低约40.6%，表明转铁蛋白修饰的脂质体递送系统可显著增强木犀草素对Hep3B细胞的体外抗肿瘤活性。

2.8　细胞摄取实验

使用激光共聚焦显微镜Hep3B细胞对FITC-LUT@LIP和FITC-TF-LUT@LIP的摄取情况，结果如图6所示，共孵育12 h后，FITC-TF-LUT@LIP的绿色荧光强度比FITC-LUT@LIP组显著提高（P<0.05），说明Hep3B细胞对转铁蛋白靶向的脂质体摄取效率高于非靶向脂质体。

3 讨论

处方前研究是制剂处方工艺开发的重要前提，为后续处方工艺设计和质量控制提供重要依据^［19］。本研究采用HPLC对LUT进行含量测定，并从线性关系、专属性、精密度、重复性及稳定性等方面对方法进行了验证，结果显示该方法在2～50 μg/mL范围内线性关系良好（R²=0.999 9），特征色谱峰保留时间稳定、峰形对称，无杂峰干扰，且精密度、重复性、稳定性均符合分析要求，因此，该方法可为后续LUT@LIP的处方优化与质量评价提供可靠的分析手段。

在脂质体的制备处方工艺方面，本研究以包封率为主要评价指标，考察了胆脂比、药脂比、超声功率、水化温度等因素对脂质体性能的影响，结果表明，药物、卵磷脂及胆固醇的比例对脂质体结构形成与物理性质具有决定性作用。适量胆固醇可插入大豆卵磷脂双分子层，填补磷脂分子间的间隙，增强膜结构的致密性与稳定性，减少包封药物的渗漏，而随着胆固醇占比减少，磷脂双分子层排列松散，膜结构致密性不足，导致包封率处于较低水平^［20］。研究发现，适度的超声处理可产生足够的空化效应和剪切力，促进脂质膜充分水合、分散并形成结构完整的脂质体，有利于药物包载^［21］。本研究在单因素实验基础上，选用Box-Behnken响应面法对影响较大的3个因素（胆脂比、药脂比和超声功率）进行进一步优化，利用回归分析确定最佳制备处方：胆脂比1∶6.906、药脂比1∶21.267、超声功率38%，实测包封率达96.94%，与预测值偏差仅0.97%，说明模型拟合度高、工艺稳定性好。优化后的TF-LUT@LIP粒径为（184.53±0.61） nm，PDI<0.3，Zeta电位为（-23.800±0.500） mV，这类表面带负电荷的脂质体能够在脂质体之间产生足够的静电斥力，有效防止粒子聚集，同时减少血清蛋白的吸附，进而降低网状内皮系统（RES）对脂质体的识别和非特异性吞噬，通过逃避RES的快速清除，脂质体获得更长的血液循环时间，为其通过表面配体介导的主动靶向在病灶部位蓄积创造了有利条件^［10］。

体外功能评价是验证靶向脂质体抗肿瘤效果的关键环节。本研究细胞毒性实验结果显示，游离LUT、LUT@LIP和TF-LUT@LIP均呈浓度依赖性抑制Hep3B细胞增殖，但TF-LUT@LIP的抑制作用最为显著。游离LUT主要通过被动扩散进入细胞，受其水溶性差、膜通透性有限等因素制约，胞内药物累积浓度较低；LUT@LIP通过脂质体包载，可借助纳米尺度的被动内吞作用提高药物递送效率；而TF-LUT@LIP在被动内吞基础上，增加了TFR介导的主动靶向识别和内吞途径。本研究细胞摄取实验显示，FITC-TF-LUT@LIP组细胞内呈现强烈的绿色荧光，证实转铁蛋白修饰可显著提升脂质体在Hep3B细胞内的摄取效率，进一步验证了靶向修饰策略在增强脂质体抗肝癌细胞增殖方面的有效性。

综上所述，本研究通过薄膜分散法成功制备了TF-LUT@LIP，经工艺优化后获得了高包封率、较小粒径的阴离子脂质体，有效解决了木犀草素水溶性差、靶向性不足的核心问题，为天然药物靶向治疗肝癌提供了新的设计思路。

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基金资助

江西省国际科技合作项目(20232BBH80011)

赣州市科技计划项目(2024RC05)