免疫荧光染色法在下呼吸道真菌感染诊断中的临床价值

The clinical value of immunofluorescence staining in the diagnosis of lower respiratory tract fungal infections

摘要

目的 评估免疫荧光染色法在下呼吸道真菌感染诊断中的临床价值。 方法 选取2020年1月1日至2024年12月31日在赣南医科大学第一附属医院临床确诊肺部真菌感染的住院患者2 224例，回顾性分析患者肺泡灌洗液经免疫荧光染色法、革兰氏染色法的检测结果，分别计算2种检测方法的检出率、准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等诊断指标。 结果 共获得肺泡灌洗液样本2 224份，其中采用免疫荧光染色法检测的样本为911份，其检出率为25.47%，准确度为51.37%，灵敏度为25.75%，特异度为74.79%，阳性预测值为48.28%，阴性预测值为52.43%；采用革兰氏染色法检测的样本为1 313份，其检出率为4.95%，准确度为55.67%，灵敏度为6.11%，特异度为95.99%，阳性预测值为55.38%，阴性预测值为55.69%。肺泡灌洗液样本采用免疫荧光染色法检测的检出率、灵敏度高于革兰氏染色法，准确度、特异度低于革兰氏染色法，差异均有统计学意义（P<0.05）；阳性预测值、阴性预测值低于革兰氏染色法，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 肺泡灌洗液免疫荧光染色法能快速而准确地判断真菌，漏诊风险低，在确诊下呼吸道真菌感染中有重要的临床价值。

Abstract

Objective : To evaluate the clinical value of immunofluorescence staining in the diagnosis of lower respiratory tract fungal infections. Methods Data of 2 224 inpatients with clinically confirmed pulmonary fungal infections in the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University between January 1， 2020， and December 31， 2024 were selected. The detection results of alveolar lavage fluid by immunofluorescence staining and Gram staining were retrospectively analyzed. The detection rate， accuracy， sensitivity， specificity， positive predictive value， and negative predictive value of the two detection methods were calculated respectively. Results A total of 2 224 alveolar lavage fluid samples were obtained， among which 911 samples were stained by immunofluorescence staining， with a detection rate of 25.47%， accuracy of 51.37%， sensitivity of 25.75%， specificity of 74.79%， positive predictive value of 48.28%， and negative predictive value of 52.43%. A total of 1 313 samples were stained by Gram staining， with a detection rate of 4.95%， accuracy of 55.67%， sensitivity of 6.11%， specificity of 95.99%， positive predictive value of 55.38%， and negative predictive value of 55.69%. The detection rate and sensitivity of alveolar lavage fluid samples stained by immunofluorescence staining were higher than those stained by Gram staining， while the accuracy and specificity were not higher than those stained by Gram staining， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The positive and negative predictive values were lower than those of Gram staining， but there was no significant difference （P>0.05）. Conclusion Immunofluorescence staining of alveolar lavage fluid can quickly and accurately identify fungi with a low risk of missed diagnosis， and has important clinical value in the diagnosis of lower respiratory tract fungal infections.

关键词

下呼吸道真菌感染 / 免疫荧光染色法 / 革兰氏染色法

Key words

Lower respiratory tract fungal infection / Immunofluorescence staining method / Gram staining

近年来，由于社会老龄化、滥用抗生素、肿瘤化疗、使用免疫抑制剂、侵入性操作等，下呼吸道真菌感染的发病率和死亡率不断增长，引起了临床医师的广泛关注。及时、准确地明确下呼吸道感染是否合并真菌，有助于指导抗真菌的治疗，减少不必要的抗生素使用和药物不良反应，可缩短病程、降低病死率^［1］。目前确定下呼吸道病原菌的主要方法包括实验室检测（传统微生物学、血清学和分子生物学检测）和组织病理学检查，其中传统微生物学检查包括直接镜检和培养法。培养法常被视为确定病原菌的“金标准”，但其培养耗时长，难以为临床提供及时的诊断依据。免疫荧光染色法找真菌是一种新兴的直接镜检技术。近年来有研究^［2-3］将真菌免疫荧光染色法运用于浅表真菌病的诊断，证明其有重要临床价值。侵袭性真菌病真菌学检查指南^［4］也推荐行免疫荧光染色法确诊真菌病，但关于其在下呼吸道真菌感染诊断中的应用价值研究较少。基于此，本研究比较肺泡灌洗液免疫荧光染色法和革兰氏染色法在下呼吸道真菌感染中的临床诊断效能，以评估免疫荧光染色法在下呼吸道真菌感染中的临床价值。

1 资料与方法

1.1　一般资料

回顾性分析2020年1月1日至2024年12月31日赣南医科大学第一附属医院临床确诊肺部真菌感染的住院患者2 224例，其送检肺泡灌洗液样本2 224份，其中911份采用免疫荧光染色法检测，1 313份采用革兰氏染色法检测。纳入标准：⑴住院期间临床诊断为下呼吸道真菌感染的患者；⑵有送检肺泡灌洗液标本；⑶病例资料完整。排除标准：⑴无法耐受电子纤支镜检查患者；⑵入院前已接受过抗真菌治疗；⑶活动性肺结核未经治疗的患者；⑷可能影响实验结果的混杂因素。本研究获得研究对象的同意并签署知情同意书。

1.2　标本采集

肺泡灌洗液标本采集：肺泡灌洗液样本均经支气管镜下采集，方法如下：患者无纤支镜检查禁忌，经口入镜，用2%利多卡因对灌洗肺段做局部麻醉，对目标肺段注入0.9%生理盐水进行灌洗，单次注入20～50 mL，灌洗3～4次后随即负压回收（回收率40%～60%）。合格标本标准如下：灌洗回收率>40%；无大气道分泌物混入；细胞存活率>95%；红细胞<10%（创伤、出血等特殊因素除外），上皮细胞<3%；涂片示细胞形态完整，分布均匀。

1.3　检验方法

1.3.1　免疫荧光染色法

取待测肺泡灌洗液涂在载物片上，在样本上滴加1滴特敏增强荧光染色液，2 min加盖盖玻片，用吸水纸吸净多余染液。随后于荧光显微镜下直接镜检。检验结果判读：镜下观察到蓝绿色荧光标记的真菌菌丝或孢子为阳性，镜下未见真菌菌丝或孢子则为阴性。

1.3.2　革兰氏染色法

取待测肺泡灌洗液标本，涂片，加革兰氏染液染色，干燥后在普通光学显微镜下镜检，镜下观察到染成紫色的孢子、菌丝和假菌丝为阳性。

1.4　临床观察指标

下呼吸道真菌感染的诊断通过病案首页结果获取，其参照近年相关指南修订制定的分级诊断标准，分为确诊、临床诊断、拟诊和未确定4级^［5-6］。在本研究中根据患者病史、临床表现、体征、影像学检查及结合真菌培养或病理结果等作出相应诊断，将确诊、临床诊断、拟诊为“金标准”，统计肺泡灌洗液革兰氏染色法涂片和真菌免疫荧光染色法的结果。计算下列诊断效能指标：灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%；特异度=真阴性/（假阳性+真阴性）×100%；检出率=（真阳性+假阳性）/总例数×100%；准确度=（真阳性+真阴性）/总例数×100%；阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阳性）×100%；阴性预测值=真阴性（真阴性+假阴性）×100%。

1.5　统计学处理

采用R软件（4.3.1版本）进行数据分析。数据清洗和预处理包括缺失值检查和异常值识别，仅纳入金标准（临床诊断）和检测结果完整的病例进行分析。针对分类检测数据的特点，计算相关诊断指标如检出率、准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等评估诊断效能。计数资料以例数和率表示，组间采用卡方检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　肺泡灌洗液不同检验方法检测结果比较

肺泡灌洗液革兰氏染色法、免疫荧光染色法的检出率分别为4.95%、25.47%，2种方法检出率比较差异有统计学意义（P<0.000 1）。见表1。

2.2　肺泡灌洗液免疫荧光染色法与革兰氏染色法对真菌感染的诊断效能比较

以临床诊断为金标准，肺泡灌洗液免疫荧光染色法诊断结果与临床诊断结果比较见表2，革兰氏染色法诊断结果与临床确诊结果比较见表3。肺泡灌洗液免疫荧光染色法灵敏度高于革兰氏染色法，但准确度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均低于革兰氏染色法，其中准确度、灵敏度和特异度比较差异有统计学意义（P<0.05），阳性预测值和阴性预测值比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

2022年WHO首次将真菌列为重点病原体之一^［7］，引起研究人员的广泛关注。下呼吸道真菌感染起病隐匿，且缺乏特异性临床表现，常造成诊断延迟而预后不佳，给卫生保健系统造成了巨大的经济负担，对患者健康构成了严重威胁。因此，寻找快速而准确的方法诊断下呼吸道真菌感染对于患者的治疗和预后至关重要。

真菌直接镜检操作简便，适用多种临床样本（支气管肺泡灌洗液、痰液、尿、粪、分泌物、脑脊液、引流液），可快速报告结果，具有重要临床价值^［8］。目前常用于临床真菌镜检的方法有革兰氏染色法、氢氧化钾(Potassium hydroxide，KOH）湿片法、免疫荧光染色法、六铵银染色等。近年来，免疫荧光染色法因其高灵敏度和特异度在国内外广泛应用，其使用免疫染色制剂与真菌细胞壁中的几丁质和纤维素结合，在荧光显微镜下特定波长（350～450 mm）的紫外光下，菌丝或孢子呈现亮蓝色荧光，与暗色背景形成鲜明对比，结构显示清晰，易于识别，适用于各种疑似真菌感染的检查，且操作简单快速。其对曲霉菌、肺孢子菌、酵母样真菌等均有良好的着色效果，2017年欧洲临床微生物学和感染病学会、欧洲医学真菌学联盟和欧洲呼吸学会联合指南^［9］也强烈推荐对疑似侵袭性曲霉病患者肺泡灌洗液使用直接镜检（使用荧光增强剂）、组织病理和培养明确诊断。但有时因其镜下形态类似难以鉴别菌种类型，相关指南^［4］推荐多种染色方法联合检查以提高准确性；但因需使用荧光显微镜或加装荧光模块等昂贵设备而未能在临床广泛常规开展。

本研究通过比较肺泡灌洗液革兰氏染色法及真菌免疫荧光染色法的诊断效能，以分析其优势，旨在指导下呼吸道真菌感染的快速临床诊断。既往有研究^［10-11］将免疫荧光染色法用于浅表真菌的检测，结果表明免疫荧光染色法真菌的阳性检出率高于常规镜检，是一种灵敏度高、快速便捷的检测方法。王艳平等^［12］关于痰涂片免疫荧光法在呼吸道真菌感染的研究中，也提示其检出率、灵敏度高于革兰氏染色法。这与本研究肺泡灌洗液免疫荧光染色法的真菌检出率和灵敏度高于革兰氏染色法是一致的，可减少漏诊，有利于患者及早诊断和治疗，但也因其高灵敏度而无法排除定植菌，应结合临床病情和其他检测方法综合判断。值得注意的是，本研究免疫荧光染色法的准确度、特异度、阳性预测值和阴性预测值低于革兰氏染色法，这与既往研究^［13］不一致，其中阳性预测值和阴性预测值比较差异无统计学意义（P>0.05），考虑原因如下：⑴免疫荧光染色法操作简单，但在镜检过程中，取样时未混合均匀，压片后未用吸水滤纸吸去多余染液导致标本悬浮流动或污染，染色后未尽快读片致使试剂干涸而存在荧光淬灭现象，未使用适合波长段的滤光片等，都可能影响免疫荧光染色法结果的判读；⑵除了真菌之外，动脉壁、肺泡及细支气管上的弹性纤维、外源性的植物纤维、脂肪滴、寄生虫等经荧光染色后，同样会发出亮蓝色荧光，虽结合其形态特征不难区分^［14］，但仍可能导致假阳性结果；⑶试剂未常温保存以及阳光直射也可能影响试剂效果；⑷在暗色真菌中，因其细胞壁主要成分是葡聚糖，含有几丁质含量少，免疫染色制剂不易与之结合而造成假阴性^［15］；⑸本研究中采用革兰氏染色法检测的样本居多，这可能存在偏倚，从而影响研究结果。由此可见，免疫荧光染色法阳性可能确定或提示真菌感染，但阴性检测结果也不能完全排除真菌感染^［16］，需要结合宿主因素、临床表现和其他检查结果综合判断。

综上所述，免疫荧光染色法相较于革兰氏染色法，具有快速方便、高效直观的优势，提高了真菌的检出率，降低漏诊风险，为下呼吸道真菌感染的早期诊断提供了可靠依据。

参考文献

[1] 陈肖华，凌宙贵，唐贞明，等.比较3种采样方法在下呼吸道感染病原学诊断的价值［J］.临床肺科杂志，2017，22（4）：649-652.

[2] Yao Y， Shi L， Zhang C，et al.Application of fungal fluorescent staining in oral candidiasis：diagnostic analysis of 228 specimens［J］.BMC Microbiol，2019，19（1）：96.

[3] 潘露，杨波，黄佳，等.荧光染色法和传统KOH湿片法在甲真菌病诊断中的应用比较［J］.中国微生态学杂志，2022，34（2）：220-222.

[4] 中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会，中华医学会检验医学分会临床微生物学组，中华医学会微生物学和免疫学分会微生物学组.侵袭性真菌病真菌学检查指南［J］.中华检验医学杂志，2023，46（6）：541-557.

[5] 中华医学会儿科学分会，中华儿科杂志编辑委员会，陆权，等.儿童侵袭性肺部真菌感染临床实践专家共识（2022版）［J］.中华儿科杂志，2022，60（4）：274-282.

[6] Donnelly J P， Chen S C， Kauffman C A，et al.Revision and update of the consensus definitions of invasive fungal disease from the European organization for research and treatment of cancer and the mycoses study group education and research consortium［J］.Clin Infect Dis，2020，71（6）：1367-1376.

[7] World Health Organization. WHO fungalpriority pathogens list to guideresearch， deveiopment and publichealth action［EB/OL］.（2022-10-25）［2025-10-20］.

[8] 中国医药教育协会真菌病专业委员会，国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心（北京大学第一医院），国家血液疾病临床医学研究中心（北京大学人民医院）.侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识［J］.中华内科杂志，2022，61（2）：134-141.

[9] Ullmann A J， Aguado J M， Arikan-Akdagli S，et al.Diagnosis and management of Aspergillus diseases：executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline［J］.Clin Microbiol Infect，2018，24（）：e1-e38.

[10] 徐瑾，何咏，黄玲珍，等.荧光染色法、双重荧光染色法与KOH湿片法在甲真菌诊断中的比较研究［J］.中国真菌学杂志，2020，15（3）：167-169.

[11] 陈学超，于永翔，王建文，等.免疫荧光技术在皮肤活检组织真菌染色中的应用［J］.中国麻风皮肤病杂志，2022，38（2）：101-103.

[12] 王艳平，郑鹏，田敏，等.痰涂片荧光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的应用［J］.检验医学与临床，2023，20（4）：550-553.

[13] 刘鸿宇，周峻林.慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者应用痰真菌涂片与痰真菌免疫荧光染色检测法进行快速诊断的价值比较［J］.中国当代医药，2021，28（24）：192-194.

[14] 杨启文，倪语星，林丽开，等.临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识［J］.中华检验医学杂志，2019，42（7）：514-528.

[15] Shao J， Song Y， Zhou Y，et al.Diagnostic value of fluorescein-labeled chitinase staining in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues of fungal disease［J］.Med Mycol，2020，58（1）：66-70.

[16] 王腾勇.免疫荧光染色在侵袭性肺曲霉病（IPA）诊断中的价值研究［J］.现代诊断与治疗，2021，32（1）：46-47.

基金资助

赣州市科技计划项目(赣市科〔2018〕50号)