空间转录组学在组织缺血再灌注损伤研究中的应用

Application of spatial transcriptomics in the study of tissue ischemia-reperfusion injury

摘要

缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury，IRI）是临床器官移植、心肌梗死再灌注治疗、缺血性脑卒中血管再通、肝切除及肾切除等过程中普遍存在的共性病理生理问题，其病理机制以缺血阶段的代谢紊乱为基础，在血流恢复后的再灌注阶段被触发并显著放大，严重影响靶器官功能恢复及患者预后。尽管数十年来围绕IRI的机制研究取得了大量成果，但临床上仍缺乏有效的靶向干预药物，尤其是针对缺血再灌注不同阶段、不同空间区域的精准治疗策略尚属空白。当前，对IRI的组织异质性、区域依赖性损伤模式及细胞间相互作用复杂性的关注，正在成为该领域的研究热点。空间转录组学能够在保留组织空间结构的前提下，同时获取基因表达谱及其空间坐标信息，为疾病机制解析带来了全新视角。近年来，空间转录组学也开始被引入IRI研究，在脑、心、肝、肾、肺等靶器官的IRI模型中获得了重要发现，初步揭示了IRI的时空异质性规律。本文旨在梳理空间转录组学技术在IRI研究中的应用现状，从技术方法学、各靶器官的研究进展、机制发现与临床应用转化等维度进行全面分析，并对该领域未来的发展方向提出展望。

Abstract

Ischemia-reperfusion injury （IRI） is a common pathophysiological problem in the process of clinical organ transplantation， myocardial infarction reperfusion therapy， ischemic stroke vascular recanalization， hepatectomy and nephrectomy. Its pathological mechanism is based on the metabolic disorder in the ischemic stage， which is triggered and significantly amplified in the reperfusion stage after blood flow recovery， seriously affecting the recovery of target organ function and the prognosis of patients. Although a lot of achievements have been made in the study of the mechanism of IRI for decades， there is still a lack of effective targeted intervention drugs in clinical practice. Especially the precise treatment strategies for different stages and different spatial regions of ischemia-reperfusion are still blank. Currently， the attention to the tissue heterogeneity， region-dependent damage pattern and the complexity of intercellular interaction of IRI is becoming the frontier direction in this field. Spatial transcriptomics can simultaneously obtain gene expression profiles and their spatial coordinate information on the premise of retaining the spatial structure of the tissue， which brings a new perspective for the analysis of disease mechanisms. In recent years， spatial transcriptomics has also been introduced into IRI research， and important discoveries have been made in IRI models of target organs such as brain， heart， liver， kidney and lung， which preliminarily reveal the temporal and spatial heterogeneity of IRI. This review aims to systematically summarize the application status of spatial transcriptomics technology in IRI research， comprehensively analyze the technical methodology， research progress of each target organ， mechanism discovery and clinical application transformation， and put forward the future development direction in this field.

Graphical abstract

关键词

组织缺血再灌注损伤 / 空间转录组学 / 时空异质性 / 炎症反应 / 细胞互作

Key words

Tissue ischemia-reperfusion injury / Spatial transcriptomics / Spatiotemporal heterogeneity / Inflammatory response / Cell-cell interaction

缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury，IRI）是指当组织器官因血流中断而处于缺血缺氧状态时，细胞能量代谢障碍、氧化应激失衡及炎症因子蓄积会率先启动损伤级联反应；而当血流恢复后，这一过程非但未能终止，反而会通过再灌注诱发钙超载、线粒体功能障碍及免疫细胞过度激活，进一步加剧组织坏死与功能损伤^［1］。上述复杂的病理过程并非均匀分布于整个受损组织，而是呈现出显著的区域异质性，这为解析IRI的分子机制带来了巨大挑战。

空间转录组学（Spatial transcriptomics，ST）是一项能够在保留组织空间结构完整性的前提下，同时获得细胞基因表达谱与精确空间位置信息的新兴技术。其核心特征包括近单细胞级别的高空间分辨率、全转录组覆盖能力、组织原位分析以及多模态整合潜力。该技术已被广泛应用于发育生物学^［2］、肿瘤微环境^［3-4］、神经科学^［5］及免疫学等领域，尤其在揭示组织微环境空间异质性方面展现出独特优势，不仅能够精准定位稀有细胞亚群、描绘细胞间配体-受体相互作用的空间网络，还能识别常规混合样本分析中难以发现的区域特异性分子事件。对于IRI而言，其缺血核心区、边缘区（半暗带）及远端区在细胞损伤程度与分子特征上存在显著的区域依赖性差异，而ST恰好能够精确定位这些区域的基因表达谱差异，识别损伤前沿的分子梯度，解析免疫细胞浸润的空间路径与炎症生态位，揭示细胞死亡信号从核心区向边缘区的空间传播规律，并通过配体-受体的空间共定位分析推断驱动组织纤维化或修复过程的关键细胞互作网络^［6］。因此，该技术已成为解析IRI区域依赖性分子机制的理想工具。基于此，本文梳理了ST技术方法学及其在各组织IRI研究中的应用现状，着重阐述了ST在描绘损伤前沿分子梯度和区域特异性细胞互作网络中的关键技术价值以期为面向缺血核心区、边缘区（半暗带区域）及远端区的差异化治疗提供基于空间分子坐标的精确干预靶点。

1 空间转录组学（ST）技术方法学概述

ST作为一门融合基因表达分析与空间位置信息的新兴技术，能够在完整保留组织原有空间结构的基础上，精准解析细胞或基因转录本（mRNA）在组织内的分布模式，进而深入揭示基因表达与细胞的空间定位及组织微环境之间的内在关联。根据原理的不同，ST技术主要分为基于下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）和基于成像^［7-8］技术两大类。

1.1　基于下一代测序（NGS）的空间转录组学（ST）技术

基于NGS的空间转录组学方法，其核心原理源于单细胞RNA测序技术的延伸与突破：通过带有空间条形码的芯片阵列捕获组织中的mRNA，经反转录及测序后，通过解析序列中的空间条形码信息，即可将基因表达数据精准映射回其在组织内的原始位置^［9］。2016年，Ståhl P L等^［10］首次开发出基于NGS的ST方法，实现了全转录组水平的基因表达分析，但其局限性在于分辨率仅能达到数百微米，难以满足对重要组织特征的检测需求。基于此，10x Genomics公司推出的改进版Visium技术将分辨率提升至55 μm，可在单次实验中实现全转录组覆盖，但仍未完全达到单细胞分辨率水平。另一种基于NGS的技术Slide-seq，则通过10 μm的DNA条形码微珠捕获mRNA^［11］，虽具备近单细胞水平的分辨率，但其mRNA捕获效率较低，在一定程度上限制了对低丰度转录本的检测能力。Slide-seqV2通过优化文库生成、微珠合成及阵列索引，将mRNA捕获效率提升至Slide-seq的10倍^［12］。与Slide-seq原理类似，HDST借助2 μm高密度条形码微珠阵列及多轮荧光解码策略，将分辨率较传统ST技术提升1 400倍，可实现组织原位转录本的高分辨率空间定位；但该技术存在单个条形码转录本捕获量较低、需经14轮荧光杂交循环完成解码（总处理时间约3 h）的局限，流程复杂度与耗时性相对较高^［13］。DBiT-seq技术利用微流控通道，可对组织内mRNA与蛋白质进行高分辨率空间定位，但无法直接解析单个细胞^［14］。Stereo-seq技术基于DNA纳米球图案化阵列，实现了亚细胞定位及超大视野组织观察；但低丰度基因可能因捕获限制被遗漏^［15］。Seq-Scope技术基于Illumina测序平台的固相扩增，实现了亚微米级分辨率，mRNA捕获能力与单细胞RNA测序（scRNA-seq）水平相当，但受样本处理限制，且大规模样本分析的成本仍较高^［16］。而Pixel-seq技术结合Polony凝胶的高分辨率特性，在实现亚细胞级分辨率的同时，降低了制造成本与时间成本^［17］。

1.2　基于成像的空间转录组学（ST）技术

基于成像的ST技术主要通过荧光显微镜对与探针结合后的mRNA进行原位成像。依据检测原理，可进一步细分为原位测序（In situ sequencing，ISS）和原位杂交（In situ hybridization，ISH）。

1.2.1　原位测序（ISS）相关技术

基于ISS的方法利用带有条形码的锁式探针捕获mRNA后，经逆转录反应生成cDNA，通过滚环扩增技术实现信号放大后进行测序，再将成像系统采集的空间坐标信息与解码获得的基因特异性条形码进行关联分析，即可读取组织内转录本序列。Ke R等^［18］首次在人乳腺癌组织中实现了小RNA片段的原位测序。在此基础上，STARmap技术整合水凝胶组织化学，并利用SNAIL技术，实现了毫米级厚组织块的三维测序^［19］。FISSEQ技术通过随机引物逆转录与全转录组原位测序，可完成非靶向的亚细胞RNA分析^［20］。但其局限性也较为明显，主要体现在高丰度RNA的干扰，以及非靶向扩增产生的高密度扩增产物易导致光学拥挤。osmFISH技术则采用非条形码循环杂交策略，有效解决了这一问题^［21］。

1.2.2　原位杂交（ISH）相关技术

基于ISH的方法以传统荧光原位杂交技术为基础，通过互补探针与目标序列的特异性杂交，实现靶基因在组织内空间位置及表达分布的精准检测。Raj A等^［22］开发的单分子荧光原位杂交（Single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）技术，通过多条荧光标记的短DNA探针与目标RNA杂交，首次在单细胞水平实现了单个RNA分子的原位可视化与定量分析，但该方法受限于单次检测的基因数量，难以满足高表达基因的分析需求。而多重抗误差荧光原位杂交（Multiplex error-resistant fluorescent in situ hybridization，MERFISH）技术对连续几轮杂交进行成像，实现了单细胞内数百至数千个基因的高通量空间定位^［23］。另一种具有代表性的技术是顺序荧光原位杂交（Sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH），其通过时间条码编码和多轮荧光杂交，能够实现亚细胞级的空间分辨率，精准捕捉转录本的原位分布特征，但该技术存在探针设计复杂度高、检测通量有限的不足，难以覆盖全转录组水平的分析需求^［24］。

2 空间转录组学（ST）在各组织缺血再灌注损伤研究中的应用

不同器官因结构功能差异，其ST特征既存在跨器官的共性规律，亦展现出显著的器官特异性。在共性层面，体现为基因表达的空间关联性与病理异质性的普遍存在：特定基因在器官的解剖分区或功能亚结构中选择性富集，其表达模式与该区域的生理功能形成精准适配；而在病理状态下，基因表达的区域异质性会进一步加剧，成为疾病进程的重要分子标志。特异性层面则源于各器官在解剖复杂度、功能分工及疾病机制上的独特性，例如脑组织的细胞类型多样性、肝脏的代谢分区、肾脏的肾小管分段等，均赋予其专属的ST特征。这些共性与特异性特征共同为解析器官生理功能、揭示疾病微环境的分子机制及筛选精准治疗靶点提供了全新视角，推动生命科学研究从传统的整体基因表达分析向空间维度的精准调控解析这一范式转变。

ST技术在IRI方面的研究已取得显著进展，涉及心脏、脑、肾脏、肝脏和肺等多个器官系统，以心脏IRI为例，该技术解析了其区域依赖性损伤模式：与对照组相比，缺血核心区和边缘区均出现了正常心肌功能被抑制的现象，而缺血核心区的损伤以炎症响应与凋亡程序为主导，边缘区的损伤以纤维化与心脏重构相关基因激活为特征（图1）。然而，不同研究所采用的技术平台（如Visium、MERFISH等）在分辨率、检测通量及组织适用性方面存在差异（表1），因此在选择技术时需依据具体科学问题审慎权衡。

2.1　心脏缺血再灌注损伤（IRI）

在心肌梗死（Myocardial infarction，MI）的病理进程中，心脏缺血会触发失控的炎症级联反应，进而诱发MI区域扩大、心脏重塑及心力衰竭^［25-26］，使其成为全球心血管疾病主要死亡原因之一。研究表明，ST技术将MI后的心脏组织划分为缺血区（Ischemic zone，IZ）、边缘区（Border zone，BZ）和远端区（Remote zone，RZ），这些区域在细胞组成、细胞间互作模式及多组学特征（如表观基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等）上均存在显著差异；同时，这些生物学特征会随病程进展呈现动态演变趋势^［27］。

2.1.1　空间转录组学（ST）技术揭示心肌细胞亚群的区域特异性分布特征主导心肌梗死（MI）后的无菌性炎症

传统观点认为，MI后的无菌性炎症主要由髓系细胞主导^［28］，而Ninh V K等^［29］利用Visium技术对小鼠和人类MI心脏进行ST分析，定位了BZ干扰素诱导细胞（IFN-induced cell cluster，IFNIC）簇的空间分布；结合心肌细胞（Cardiomyocytes，CMs）特异性Irf3敲除小鼠模型，证实CMs是Ⅰ型干扰素（Interferons，IFN）反应的主要启动者。进一步通过RNA MERFISH揭示，IFNIC中80%的Ⅰ型IFN来源于CMs，且Ifna2与心肌损伤标志物Nppa在BZ CMs中共表达。此外，DNA MERFISH证实BZ CMs核膜破裂会导致染色体DNA扩散至细胞质，且核外DNA区域与表达IFNAR的细胞高度重合，证实核外DNA被cGAS识别后可激活STING-IRF3通路，这一发现挑战了传统认知。Calcagno D M等^［30］同样采用Visium技术分析小鼠MI心脏，定位了BZ中BZ1 CM（Nppa⁺Xirp2⁻）和BZ2 CM（Nppa⁺Xirp2⁺）亚群的空间分布；mFISH进一步显示，BZ2的标记基因Xirp2仅在IZ边缘单层CMs中高表达，揭示了CMs亚群的区域特异性分布。Litviňuková M等^［31］通过smFISH在成人心脏中鉴定出5种心房（aCM1～5）与5种心室（vCM1～5）CM亚型，各亚型呈现明确的空间区域分布，如右心房aCM2富集铁稳态调控基因HAMP，心室vCM3则高表达ANKRD1、FHL1等应激响应相关基因。

2.1.2　空间转录组学（ST）技术揭示Gelsolin调控心室重塑的空间机制

在MI后的心室重塑过程中，细胞骨架发挥着基础性的结构与功能调节作用，其动态平衡的维持是心脏正常生理功能的关键。作为调控细胞骨架动态重构的关键因子，Gelsolin已被证实与MI后心室重塑的病理进程及心力衰竭的发生发展密切相关^［32］。Wang W等^［33］利用Visium技术，解析了Gsn^⁻/⁻小鼠对MI后早期（48 h）和晚期（4 w）心脏不同区域细胞类型分布、基因表达模式及配体-受体互作的影响，首次从空间分子特征层面揭示，Gelsolin可通过非心肌细胞（单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞）的骨架动态调控，驱动心室重塑。

2.1.3　空间转录组学（ST）技术解析心肌缺血再灌注损伤（IRI）的免疫浸润空间机制

为尽早恢复梗死相关血管的血流灌注、减少心肌坏死面积并保护心功能，临床常采用溶栓、介入手术等方法实现再通。然而，血流的突然恢复会导致更严重的结构损伤和功能障碍，即心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）^［34］。ST技术为解析MIRI的区域特异性机制提供了新视角：Lin W等^［35］通过Visium技术发现，MIRI后，Nppb（编码公认的心脏应激标志物BNP^［36］）在梗死区高表达；在麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill， SBP）组中，Npr3的表达范围从心内膜延伸至梗死区，而在I/R组中无此现象，明确了上述基因与缺血损伤区域的空间关联。此外，通过定位成纤维细胞（标志物Vim）和肌成纤维细胞（标志物Acta2）的空间分布，发现I/R组梗死区及交界区Acta2的表达更高，提示肌成纤维细胞在此区域活化增多，可能参与纤维化。Wünnemann F等^［37］首次从空间维度证实，免疫细胞除经梗死边界区与心外膜区浸润心肌外，亦存在心内膜浸润路线，修正了传统认知。结合Molecular Cartography与SeqIF技术发现：I/R组小鼠心内膜区CCR2⁺单核/巨噬细胞（Mo/Mφ）的RNA斑点密度较对照组显著增加，与心内膜细胞标志物Pecam1的共定位比例达35%，且严格局限于心内膜IZ（即心内膜层及邻近2～3层Ankrd1⁺受损心肌细胞区域），RZ心内膜无此特征，直接证实I/R后免疫细胞优先通过心内膜接触并浸润梗死心肌。深度视觉蛋白质组学（Deep Visual Proteomics，DVP）进一步揭示：血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）仅在IZ心内膜细胞的心肌交界凹陷区（光滑区未见此变化）转录本及蛋白质水平上调，RZ心内膜及其他血管内皮细胞无变化。临床数据显示，心内膜细胞中免疫趋化相关基因（如CCL2、CXCL12）表达较健康供体显著上调。进一步证实心内膜在人类I/R中扮演着炎症启动者角色，为临床转化提供了依据。

2.2　肾脏缺血再灌注损伤（IRI）

2.2.1　空间转录组学（ST）技术解析免疫-实质细胞互作的空间机制

在肾脏缺血再灌注损伤（Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）中，肾小管上皮细胞（尤其是近端小管细胞）作为肾脏内代谢活性旺盛且对缺血高度敏感的细胞类型，其损伤及异常应答构成了核心病理环节^［38］。针对这一核心环节，多项研究借助ST技术揭示了其深层机制：Polonsky M等^［39］利用seqFISH技术，系统解析了小鼠IRI后的细胞组成及空间重构特征，发现受损近端小管细胞（Proximal tubule cells，PTs）可通过Clcf1-Crlf1信号轴与成纤维细胞互作，驱动纤维化微环境形成。Dixon E E等^［40］则在雌性小鼠双侧IRI模型中采用Visium技术，探究不同时间点（4 h、12 h、2 d、6 w）肾脏组织的空间基因表达模式，揭示了受损PTs与巨噬细胞、T细胞的持续性互作机制，以及急性肾损伤（Acute kidney injury，AKI）向慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）转化的空间分子调控机制。Melo Ferreira R等^［41］借助Visium技术研究发现，在小鼠IRI模型的髓质外条纹区近端小管S3段［Proximal tubule segment S3 in outer stripe，PT（S3-OS）］中，存在总基因表达水平降低而Atf3等损伤相关基因上调的特异性区域；中性粒细胞可特异性浸润该区域并与PT（S3-OS）共定位。这一发现揭示了Atf3介导的上皮细胞与免疫细胞间的时空互作机制。

此前研究仅证实Cmpk1在单核细胞中高表达，Zhang H等^［42］通过ST分析发现该基因在肾组织管间质单核细胞中显著富集，且IRI组表达高于对照组；免疫荧光证实了IRI肾组织中Cmpk1与单核细胞标志物CD68共定位。这一发现为单核细胞代谢异常优先导致肾小管损伤提供了关键空间证据：管间质是单核细胞与肾小管细胞直接接触的区域，Cmpk1高表达的管间质单核细胞可经该界面直接释放促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β）及活性氧（Reactive oxygen species， ROS）；或通过线粒体功能障碍、细胞焦亡等途径，作用于邻近肾小管细胞，引发肾小管坏死、脱落等病理改变。该结果揭示了IRI中免疫细胞-实质细胞损伤的空间病理关联，进一步完善了对肾IRI致病机制的认知。

2.2.2　空间转录组学（ST）技术解析铁死亡的空间分布与调控机制

已有研究证实，谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4，GPX4）活性受损可引发铁死亡依赖性肾损伤^［43］。然而，关于肾脏中GPX4介导的铁死亡具体空间分布特征，以及I/R损伤过程中导致GPX4表达下调的分子机制，目前尚未完全阐明。针对这些关键科学问题，两项研究通过ST技术提供了重要见解：Hong Y等^［44］利用Visium分析发现，PT的铁死亡活性显著高于其他细胞类型，从空间维度证实PT是AKI中对铁死亡最敏感的细胞。关键基因（FTL、FTH1、GPX4）在AKI患者的PT区域呈现从中心向周边扩散的表达模式，而健康人群无此特征；其中GPX4与铁死亡活性的空间共定位最为紧密，直接证实其在驱动铁死亡扩散中的作用。Chu L K等^［45］进一步揭示，Gpx4在小鼠肾脏皮质-外髓交界处呈特异性高表达，且I/R后该区域铁死亡活性显著增强；Otud5与Gpx4在该区域的mRNA存在共定位，而缺氧/复氧后两者共定位信号减弱。此外，I/R后自噬相关基因在Otud5低表达区呈高表达，且与铁死亡标志物4-HNE空间重叠。上述发现表明，I/R可通过激活自噬促进OTUD5降解及GPX4失活，进而导致肾脏皮质-外髓交界处铁死亡的区域特异性调控。

2.2.3　空间转录组学（ST）技术揭示肾浸润巨噬细胞的空间分布与动态变化

在肾脏疾病的病理进程中，浸润细胞在肾损伤的发生与进展中扮演关键角色。肾浸润巨噬细胞（Kidney-infiltrating macrophages，KIM）作为再灌注后由外周循环迁移至肾脏组织的巨噬细胞群体，与肾脏损伤的进展、修复及免疫调节密切相关^［46］，但其异质性及动态变化规律仍有待阐明。针对这一问题，Melkonian A L等^［47］利用10x Genomics Chromium技术，系统分析了小鼠肾脏双侧缺血再灌注损伤后不同时间点（静止期、损伤后1 d、6 d、28 d）KIM各亚群的空间分布变化。Arg1-KIMs持续定位于皮质S1/S2段，Ly6c-KIMs和Ace-KIMs则分布于皮质及皮髓质，同时还观察到增殖性巨噬细胞随时间推移发生的迁移现象。这些发现不仅反映了肾脏损伤后不同微环境对免疫细胞的招募与调控，也提示AKI的发病机制可能与这些细胞亚群的异常调控有关。

2.3　肝脏缺血再灌注损伤（IRI）

2.3.1　空间转录组学（ST）技术解析肝脏缺血再灌注损伤（IRI）的区域特异性

肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝移植和肝切除术中常见的并发症，长期影响肝移植的成功率。肝脏具有复杂且高度分区的结构，其基本单位肝小叶根据氧供应可分为门管周区（1区）、中间区（2区）和中央静脉周围区（3区）^［48］。已有研究证实，HIRI存在显著的区域特异性，主要累及3区，其机制可能与缺血阶段肝血流量下降密切相关^［49］。Xin J等^［48］通过GeoMx DSP技术分析IRI后肝脏，明确了不同区域的分子与细胞响应差异：3区特异性富集急性炎症反应、未折叠蛋白反应等损伤相关通路，且相关基因表达显著上调；1区则主要富集类固醇代谢通路，揭示了HIRI后区域间分子变化的异质性。此外，IRI导致肝细胞比例下降而内皮细胞比例增加，其中促炎M1型巨噬细胞在3区的浸润显著增多、抗炎M2型巨噬细胞减少，进一步印证了3区炎症反应增强与损伤的关联性。

为明确基因表达模式与组织损伤区域的空间关联，揭示病理过程的区域特异性机制，Chen S等^［50］通过Visium技术分析髓系细胞特异性Mas1敲除（Mas1^M-KO）小鼠及野生型对照（Mas1^f/f）小鼠的肝脏组织，发现：Mas1^M-KO小鼠肝脏中凋亡信号通路特异性富集于坏死区及其周围，而非全局分布；而Mas1^f/f小鼠损伤区凋亡信号较弱，且修复基因Mertk的表达与凋亡信号呈空间负相关，提示MAS信号可通过局部调控抑制凋亡。Visium技术与细胞类型分解算法（spacexr）的分析显示，中性粒细胞主要集中于坏死核心区，而巨噬细胞（库普弗细胞、单核来源巨噬细胞）围绕坏死区呈环形分布；进一步分析Mertk表达发现，其具有严格的空间特异性：对照小鼠中，Mertk在坏死区周围的巨噬细胞中高表达，而Mas1^M-KO小鼠同一位置巨噬细胞的Mertk表达显著下调，且该区域与中性粒细胞积累区完全重叠。上述发现揭示，HIRI中巨噬细胞胞葬作用受损源于坏死区周围Mertk局部表达不足，而非全局下调，导致衰老中性粒细胞清除受阻，加剧局部炎症。该研究阐明了Mas1调控HIRI的空间特异性机制，为后续针对MAS/MERTK轴的精准干预，如局部激活坏死区周围巨噬细胞的Mertk表达，提供了空间维度的靶点定位与理论依据。

2.4　脑缺血再灌注损伤（IRI）

大脑中细胞的空间分布与其功能密切相关，多数神经系统疾病的发生发展均涉及特定脑区内细胞组成及相互作用的动态变化。ST技术能够在保留组织空间结构的前提下，全面解析脑缺血后缺血核心、半暗带及周围组织之间的分子异质性，进而系统揭示脑缺血后神经元、胶质细胞及血管内皮细胞等关键细胞类型的动态演变及其空间互作，为缺血性脑卒中的精准诊断与区域化治疗提供重要依据。

2.4.1　空间转录组学（ST）技术揭示小胶质细胞空间异质性

急性缺血性脑卒中（Acute ischemic stroke，AIS）后，缺血核心和半暗带的损伤程度直接影响患者预后。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，能快速响应缺血并启动早期免疫反应^［51］。传统观点将其分为M1型（分泌破坏性促炎因子）与M2型（通过吞噬作用抑制促炎反应）^［52］。但这二分法范式被缺血核心相关小胶质细胞（Ischemic core-associated microglia，ICAM）和缺血半暗带相关小胶质细胞（Ischemic penumbra-associated microglia，IPAM）的发现否定。Li H等^［53］采用Visium技术，对假手术组及大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型组小鼠的脑切片进行研究发现，缺血后12 h，ICAM标记基因集中于缺血核心区，IPAM标记基因定位于缺血半暗带，揭示了小胶质细胞亚簇的空间异质性；进一步检测显示，M2标记基因（Mrc1、Arg1）主要在巨噬细胞中表达，而非小胶质细胞，颠覆了传统认知。最近，Ma Y等^［54］在AIS研究中，将ST技术作为解析小胶质细胞中Lilrb4调控CD8⁺ T细胞介导免疫反应的核心工具。在tMCAO模型小鼠中，该技术显示：免疫调控关键基因Lilrb4在缺血半球的表达富集于半暗带区域。鉴于半暗带区域是缺血后可挽救的关键病理区域，其分子机制直接影响脑梗死体积与神经功能预后，该发现为探索Lilrb4的神经保护作用提供了明确的靶向方向。

2.4.2　空间转录组学（ST）技术揭示缺血对非神经细胞的空间分子特征影响

在非神经细胞中，缺血同样会改变其分子特征与空间分布。Han B等^［55］利用相同技术，结合Allen小鼠脑图谱，将检测位点划分为缺血核心区（Ischemic core area，ICA）、梗死周围近区（Proximal region of the peri-infarct area，PIA_P）和梗死周围远区（Distal region of the peri-infarct area，PIA_D）等区域，结果显示，PIA_P区域富集了大量与炎症和免疫相关的差异表达基因（如Lgals9、C1qa），而PIA_D区域则富集神经元功能相关基因（如参与突触信号、认知的基因），揭示了缺血损伤对不同区域分子功能的差异化影响。

2.4.3　空间转录组学（ST）技术解析血脑屏障破坏的空间分子特征

目前，再灌注治疗是AIS的标准治疗方法，但其引发的多种并发症会影响患者预后。更关键的是，即使实现血管再通，仍有超过半数患者存在无效再灌注现象。Hansen L M B等^［56］为探究AIS再灌注后血脑屏障破坏和血管张力异常的机制，对雄性小鼠进行MCAO 60 min后再灌注24 h，通过Visium技术分析脑实质内皮细胞（Endothelial cells，ECs）和壁细胞（Mural cells，MCs）的早期空间基因表达变化。结果显示，ECs中Cldn5下调、肌动蛋白细胞骨架黏附改变及促炎因子IL-6高表达，共同损害血脑屏障完整性。此外，细胞内钙信号相关分子表达降低，可能引发血管平滑肌功能异常，加剧血管张力丧失；MCs中Grm5下调与Nfatc3和Stat3上调亦提示血管张力降低。上述发现为开发缺血再灌注异常的治疗策略提供了潜在靶点。

2.5　肺缺血再灌注损伤（IRI）

2.5.1　空间转录组学（ST）技术解析Cd177⁺中性粒细胞在肺缺血再灌注损伤（IRI）中的致病机制

肺移植是治疗终末期肺疾病的唯一有效方法，然而肺移植患者的生存率显著低于其他实体器官移植患者，其中由肺缺血再灌注损伤（Lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）介导的原发性移植物功能障碍（Primary graft dysfunction，PGD）是导致肺移植患者早期死亡的主要因素^［57］。中性粒细胞在PGD的发生发展中起关键作用，但现有研究多聚焦于中性粒细胞向损伤肺组织的招募机制，对其到达损伤部位后的亚型异质性、激活效应及分子调控机制的探索仍不充分^［58］。Wu J等^［59］通过Stereo-seq技术分析小鼠IRI肺组织切片，明确了Cd177⁺中性粒细胞在损伤区域的空间定位与功能。结果显示，Cd177富集于免疫浸润区，与Ltf、Pglyrp1等炎症相关基因共定位，提示其参与局部炎症反应；通路分析进一步表明，Cd177⁺中性粒细胞中急性期反应信号通路显著富集，IL-1和TNF-α相关基因表达上调，与scRNA-seq中LAN3亚型的特性一致，证实其处于功能性激活状态；此外，免疫荧光显示Cd177与Cit-H3（中性粒细胞胞外陷阱结构标志物）及Ly6G在损伤区域共定位，明确其通过中性粒细胞胞外陷阱形成参与肺损伤的病理过程。

3 小结与展望

近年来，ST技术的突破性进展显著深化了人们对不同组织器官在细胞及分子层面的时空特异性认知。该技术凭借原位捕获基因表达信息的独特优势，可精准绘制组织的时空转录图谱，其核心价值体现在以下方面：基于ST的研究成果能够深度解析疾病的区域特异性机制，如揭示肾脏PT（S3-OS）损伤相关基因的特异性上调模式，为理解器官IRI的复杂病理提供空间维度证据。同时，该技术可直观揭示细胞互作的时空网络，如在肾脏IRI中受损PT与巨噬细胞的持续性互作机制，从而阐明免疫浸润与组织损伤之间的动态关联。借助ST，已成功筛选出与IRI发生发展及预后密切相关的生物标志物。例如，在LIRI研究中发现的Cd177⁺中性粒细胞已被证实可作为预测PGD的新型生物标志物，为优化再灌注治疗时间窗判断和精准评估患者预后提供分子依据，其临床转化价值与应用前景值得进一步探索。此外，该技术挖掘的潜在治疗靶点，为IRI的药物研发提供了新方向：以HIRI为例，研究发现雷公藤红素可能通过激活HIF1α信号通路发挥保护作用。未来可通过体外细胞实验、动物模型验证及临床研究，对这些靶点进行系统验证与评估，推动针对IRI的新型治疗药物研发。

尽管如此，当前ST技术在实际应用中仍面临多重挑战。在技术分辨率层面，当前IRI研究中应用最广泛的10x Genomics Visium技术，其分辨率尚无法满足对低丰度转录本的检测需求。这一局限使得细胞内分子动态变化及细胞间精细互作机制的解析不够精准。因此，未来需进一步推进技术研发与改进，突破单细胞乃至亚细胞水平的基因表达解析瓶颈。这不仅能更深入揭示IRI的分子机制，还能为组织三维重建提供关键技术支撑。样本类型兼容性是另一核心制约因素。目前主流技术对新鲜冷冻组织依赖度高，而能兼容石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本的技术（如FISSEQ）相对有限。由于FFPE是生物医学实验室常规采用的样本保存形式，这种技术适配性的不足，显著限制了ST在临床病理样本中的应用广度与深度。此外，测序的成本、数据分析与解读的复杂性等问题，也在一定程度上制约着该技术向更广泛研究场景的普及与转化。

未来，推动ST与蛋白质组学、代谢组学等其他组学技术的交叉融合，将成为解析IRI机制的重要方向。这种多组学整合策略可突破单一组学的局限，从基因、蛋白质、代谢物等多个层面构建完整的分子调控网络，进而全面揭示IRI的复杂机制。例如，ST与蛋白质组学的结合，不仅能精准定位基因表达的空间分布模式，还可进一步解析翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化等）在组织内的区域特异性特征，从而阐明这些修饰过程在IRI中的具体功能及调控逻辑，为深入理解损伤机制提供更立体的视角。

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基金资助

江西省自然科学基金杰出青年项目(20232ACB216002)

江西省自然科学基金重点项目(20252BAC250077)

赣州市科技计划项目(2023PCG17812)