铜死亡在乳腺癌中的分子机制及临床应用研究进展

Research progress on the molecular mechanisms and clinical applications of cuproptosis in breast cancer

摘要

乳腺癌作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，因其高度的异质性和传统治疗手段面临的耐药与复发困境，亟需发掘新的治疗靶点和干预策略。铜死亡作为一种新近发现的、铜依赖性程序性细胞死亡方式，其核心机制涉及线粒体呼吸调控与三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循环代谢紊乱，主要通过过量铜离子介导的脂酰化蛋白异常聚集、铁硫簇蛋白稳定性丧失以及由此引发的蛋白质毒性应激，最终诱导细胞死亡。值得注意的是，乳腺癌细胞普遍存在铜离子异常富集的代谢特征，使其对铜死亡具有潜在敏感性。近年来，铜死亡相关基因在乳腺癌分子分型、早期诊断及预后评估中的临床价值日益凸显。本文综述了铜死亡的分子机制，重点阐述了铜死亡相关基因在乳腺癌发生发展及临床诊疗中的应用前景，并深入分析了靶向铜死亡的单一及联合治疗策略的研究进展。同时，本文针对当前研究中存在的关键问题与挑战进行剖析，并对未来研究方向进行展望，旨在为乳腺癌的基础研究与临床转化提供新视角和理论依据。

Abstract

As the most common malignant tumor among women worldwide， breast cancer， characterized by high heterogeneity and the dilemmas of drug resistance and recurrence faced by conventional therapeutic approaches， urgently requires the discovery of novel therapeutic targets and intervention strategies. Cuproptosis serves as a newly identified copper-dependent form of programmed cell death， with its core mechanism involving the regulation of mitochondrial respiration and metabolic disorders of the tricarboxylic acid cycle. It ultimately induces cell death primarily through copper ion overload-mediated abnormal aggregation of acylated proteins， loss of iron-sulfur cluster protein stability， and the consequent proteotoxic stress. Notably， breast cancer cells generally exhibit a metabolic feature of abnormal copper ion enrichment， rendering them potentially sensitive to cuproptosis. In recent years， the clinical value of cuproptosis-related genes in the molecular typing， early diagnosis， and prognostic evaluation of breast cancer has become increasingly prominent. This review systematically summarizes the molecular mechanisms of cuproptosis， focuses on elaborating the application prospects of cuproptosis-related genes in the occurrence， development， and clinical diagnosis and treatment of breast cancer， and conducts an in-depth analysis of the research progress in single and combined therapeutic strategies targeting cuproptosis. Meanwhile， this article analyzes the key issues and challenges existing in current research and fucusses on future research directions， aiming to provide new perspectives and theoretical basis for the basic research and clinical transformation of breast cancer.

Graphical abstract

关键词

乳腺肿瘤 / 铜死亡 / 生物标志物 / 联合治疗

Key words

Breast neoplasms / Cuproptosis / Biomarkers / Combination therapy

乳腺癌（Breast cancer，BC）作为全球女性最常见的恶性肿瘤，年新发病例数超过230万，占女性恶性肿瘤新发病例的24%以上^［1］。BC是一种高度异质性的疾病，根据免疫组织化学亚型和综合基因分析，BC可分为4种亚型，即Luminal A、Luminal B、HER2过表达型和三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）^［2］。目前，BC的临床治疗方法主要以放疗、化疗和手术治疗为主。然而，传统的放疗和化疗药物在BC治疗中疗效并不理想。一方面，由于放疗、化疗缺乏靶向性，对正常人体细胞产生不可避免的损害；另一方面，由于BC内在的高度异质性，导致临床治疗中面临耐药和复发等治疗难题^［3-4］。

BC细胞为满足其快速增殖的代谢需求，常表现出铜离子异常富集^［5-8］，这种铜离子的异常积累不仅促进了肿瘤的恶性进展，也成为连接铜代谢异常与BC病理进程的核心生物学枢纽^［9］。近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——铜死亡（Cuproptosis）于2022年首次被定义，其核心机制与线粒体呼吸及三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循环密切相关，通过铜离子过量介导的脂酰化蛋白异常聚集、铁硫簇蛋白降解及蛋白质毒性应激诱导细胞死亡^［10-11］。铜死亡相关基因（Cuproptosis-related genes，CRGs）的异常表达与BC发生、进展、亚型分化及临床治疗反应密切相关，使其成为BC早期诊断、治疗反应预测及预后评估的潜在生物标志物^［12-17］。鉴于BC临床治疗面临的困境以及铜死亡在BC中展现出的重要临床价值，本文旨在总结铜死亡的分子机制、铜死亡相关基因在BC临床诊疗中的应用价值，以及靶向铜死亡的相关治疗策略的研究进展，以期为BC（包括TNBC亚型）的临床前研究与临床治疗提供新的思路与方向。

1 铜死亡与乳腺癌

1.1　乳腺癌（BC）细胞中铜代谢异常

铜作为生物体内不可或缺的微量元素，参与细胞内的氧化还原反应、酶活性调控及细胞信号传导等多种关键生理过程^［18-19］。铜离子摄入、转运、储存和排出的精确调控共同构成了铜稳态。例如，细胞主要通过铜转运蛋白SLC31A1摄取铜离子^［20］，随后伴侣蛋白ATOX1等负责其在细胞内的转运^［21］，多余的铜离子则由金属硫蛋白MT等进行储存^［22］，而ATP7A和ATP7B等转运蛋白则负责将过量的铜离子排出细胞^［23］，从而共同确保细胞内铜环境的动态平衡。

铜稳态与BC的发生发展存在着双向且紧密的联系，而铜死亡作为铜离子过量引发的特异性细胞死亡方式，是连接铜代谢异常与BC病理进程的核心生物学枢纽。一方面，BC细胞为满足其快速增殖的代谢需求，会通过上调铜转运蛋白等方式主动摄取铜离子，导致肿瘤组织内铜离子含量显著高于正常组织^{［5-7，19］}，这种铜离子的异常富集为铜死亡的发生提供了必要的物质代谢基础。另一方面，BC细胞在适应过程中形成了复杂的铜离子富集耐受机制，如通过高表达ATP7A、SLC31A1等基因将过量铜离子泵出胞外^{［12，23］}，或通过重塑代谢通路抵抗蛋白质毒性应激^［24］，从而逃避铜死亡并获得生存优势。铜稳态的异常调控不仅与BC的发生发展密切相关，更直接介导了铜死亡的发生。

铜死亡的核心通路涉及线粒体呼吸链和TCA循环中的多个关键蛋白。上游调控因子FDX1兼具铜离子还原与蛋白质脂酰化调控功能^{［10，25］}；脂酰化相关酶（如LIAS、LIPT1）负责硫辛酸的合成与转移，为铜离子与脂酰化蛋白的结合创造条件^{［10，26］}；TCA循环关键限速酶（如DLAT、PDHA1和PDHB）是线粒体中蛋白质脂酰化的直接靶点^{［10，27］}。过量的铜离子与这些脂酰化蛋白（特别是DLAT）结合，诱导其异常聚集形成寡聚体，同时破坏铁硫簇蛋白，最终导致线粒体功能障碍、细胞代谢紊乱和氧化应激，从而杀死细胞^［10］。值得注意的是，TNBC作为临床上常见的BC恶性亚型，虽然对目前的临床治疗手段反应不佳且患者预后普遍更差，但其肿瘤组织中脂酰化蛋白丰度更高，使其对铜死亡诱导剂治疗响应更敏感^［28］。

1.2　乳腺癌（BC）细胞中铜死亡的易感性

铜死亡发生的分子机制与BC的发生发展有着紧密关联（图1）。

首先，在铜离子与脂酰化蛋白结合的起始环节，研究证实，铜离子可特异性结合BC细胞线粒体内TCA循环中的脂酰化蛋白（如DLAT、DLST），结合位点集中于蛋白的硫辛酸基团，该过程直接破坏蛋白的正常构象^［10］。TNBC中脂酰化相关基因（LIAS、LIPT1）表达显著上调，脂酰化蛋白丰度高于其他亚型，铜离子载体吡啶硫酮锌（Zinc pyrithione， ZnPT）可通过提升胞内铜离子浓度，强化铜离子与脂酰化蛋白的结合效率，进而诱导TNBC细胞发生铜死亡^［28］。在脂酰化蛋白寡聚环节，铜结合可诱导DLAT形成线粒体内不溶性寡聚体，且BC细胞中HSP70等分子伴侣蛋白表达下调，导致寡聚体无法有效清除，持续积累后直接阻断线粒体氧化磷酸化过程^［29］。在铁硫簇蛋白丢失环节，铜与TCA循环关键酶（如DLAT）的脂酰化修饰位点直接结合，诱导蛋白异常寡聚化^［10］。这种铜依赖性寡聚化会破坏铁硫簇蛋白的结构稳定性，导致其功能丧失^［30］。FDX1作为核心调控因子，其高表达可显著增强BC细胞对铜死亡的敏感性^［10］。在最终的蛋白质毒性应激环节中，脂酰化蛋白寡聚体积累与铁硫簇蛋白丢失可协同激活未折叠蛋白反应，进而引发氧化应激风暴与能量代谢崩溃^［10］。由于BC细胞蛋白质稳态系统存在先天性缺陷，对该毒性应激的耐受能力远低于正常细胞，最终导致BC细胞死亡^［31］。

2 铜死亡相关基因作为乳腺癌潜在生物标志物的临床价值

CRGs是指参与铜稳态调控、铜死亡信号通路及下游效应过程的一类基因。CRGs根据功能可分为两类：⑴促进铜死亡基因，如DLD（作为丙酮酸脱氢酶复合物的关键组分，参与TCA循环，其功能障碍可导致脂酰化蛋白积累，从而促进铜死亡）和LIPT1（编码硫辛酰基转移酶，催化硫辛酸向丙酮酸脱氢酶复合物E2亚基等蛋白的转移，是脂酰化过程的关键酶，强化铜死亡诱导）^［29］；⑵抑制铜死亡基因，如SLC31A1（介导铜离子跨膜转运，减少胞内铜积累）和ATP7A（促进铜离子外排，维持铜稳态）^［10］。这些CRGs通过调控铜稳态、线粒体代谢及免疫微环境等关键生物学过程，在BC的发生发展中呈现特异性表达模式。

2.1　铜死亡相关基因（CRGs）是乳腺癌（BC）临床诊断的生物标志物

CRGs在BC组织与正常乳腺组织中的表达差异及亚型特异性表达特征，为BC的早期筛查、病理分型及病灶鉴别提供了关键分子指标。SLC31A1作为介导铜离子跨膜转运的核心基因，在乳腺浸润性癌等亚型中呈显著高表达，其mRNA及蛋白水平的检测可有效鉴别正常乳腺组织与癌组织，且在铜死亡相关基因中表达差异最具显著性，是BC早期筛查的优先候选标志物，联合传统影像学检查可提高早期微小病灶的检出率^［12］。丙酮酸脱氢酶E1亚基α1（Pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）作为线粒体TCA循环的关键酶，同时参与铜死亡相关脂酰化蛋白调控，其表达水平与BC病理分级呈显著关联，高表达常伴随肿瘤分化程度降低。PDHA1可以作为病理活检的辅助指标，为评估肿瘤恶性程度提供辅助依据^［14］。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A（Cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）被证实与细胞对铜死亡的敏感性相关。CDKN2A在TNBC中存在过表达现象，且与基因启动子区DNA超甲基化密切相关，这种表观遗传调控介导的表达异常可作为鉴别TNBC与其他亚型的补充指标，提升亚型诊断的精准度^［32］。二氢脂酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）在Luminal A亚型中呈现出特异性的免疫细胞浸润关联特征（与肥大细胞正相关），且其高甲基化、低mRNA/蛋白表达的模式区别于其他BC亚型及其他癌种，可作为BC分子分型的特异性辅助标记，是BC预后评估、临床治疗指导及精准分型的潜在候选生物标志物^［33］。此外，ATP7B、DLAT等CRGs的表达谱与BC免疫浸润特征存在显著相关性，结合免疫组织化学检测其蛋白表达水平，有助于进一步明确肿瘤免疫微环境表型，为临床早期微小病灶的识别及病理诊断提供参考^［34］。

2.2　铜死亡相关基因（CRGs）是乳腺癌（BC）临床治疗的潜在靶点

CRGs通过调控肿瘤细胞代谢表型、免疫微环境及耐药相关信号通路，显著影响BC对不同治疗手段的反应性，为治疗方案优化及耐药逆转提供潜在靶点。在药物敏感性调控方面，FDX1作为铜死亡的核心介导基因，其低表达不仅降低肿瘤细胞对铜死亡诱导剂的敏感性，还与多种抗肿瘤药物耐药相关，基因富集分析证实，FDX1表达与免疫相关通路及免疫细胞浸润密切关联，其表达水平可作为药物敏感性评估的潜在指标^［16］。SLC31A1表达水平与免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达呈显著正相关，且其表达受LINC00511/miR-29c-3p调控轴及拷贝数变异调控，这些调控机制的异常可能诱导化疗耐药，使SLC31A1成为预测化疗敏感性的关键指标^［12］。CDKN2A和RAD23同系物B（RAD23 homolog B，RAD23B）等CRGs通过调节免疫细胞浸润及趋化因子分泌影响免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor，ICI）的疗效，其中RAD23B表达上调的患者对PD-1/PD-L1抑制剂的敏感性显著增加，而CDKN2A高表达的TNBC患者更易从免疫治疗中获益^{［32，35］}。DLD作为铜死亡关键基因之一，泛癌分析显示，DLD表达与Dasatinib及Neratinib等靶向药物的敏感性呈负相关，这一发现为BC化疗和靶向治疗的药物选择及疗效预测提供了潜在参考^［34］。在化疗中，SLC31A1在化疗无反应组中呈显著上调，且与紫杉醇等化疗药物的不良反应相关，下调SLC31A1表达可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，有望成为克服化疗耐药的新型干预靶点^{［12，36］}。

2.3　铜死亡相关基因（CRGs）是乳腺癌（BC）预后评估的良好指标

CRGs的表达水平及组合模式可有效反映BC患者的疾病进展风险，是重要的预后评估指标。SLC31A1高表达与乳腺浸润性癌患者的不良预后呈正相关，其表达量可独立预测患者术后复发风险，高表达患者的无复发生存期显著缩短，机制上可能与SLC31A1介导的铜离子异常积累促进肿瘤增殖相关^［12］。PDHA1作为独立预后生物标志物，其表达上调与BC患者总生存期及无复发生存期的缩短显著相关，且与肿瘤组织中CD4⁺记忆T细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸润水平相关，提示PDHA1可能通过间接调控免疫微环境从而影响患者预后^［14］。在TNBC这一恶性程度较高且临床治疗手段相对匮乏的BC亚型中，5种CRGs的差异表达特征可作为患者预后评估的重要分子指标：ATP7A、DLST及LIAS高表达与患者总生存期缩短呈显著正相关，提示预后不良；而LIPT1与PDHA1高表达则与患者更优的生存获益相关，可作为预后良好的潜在分子标志。进一步研究发现，靶向抑制ATP7A表达可直接降低TNBC细胞迁移与增殖能力，从机制层面明确了该基因表达水平与肿瘤进展的密切关联性，为其作为TNBC预后评估分子标志物的临床应用提供了坚实的功能学支撑^［37］。DLD高表达与BC患者更长的总生存期显著相关，其表达水平可作为BC患者生存预后的独立预测指标，为临床预后分层提供了分子水平的依据^［33］。此外，基于CRGs构建的多基因风险模型（如包含9个铜死亡相关长链非编码RNA的风险评分系统）、铜死亡评分及CDKN2A表达状态等，均可有效区分高、低风险患者群体，为临床预后分层及个体化治疗决策提供量化依据^{［32，38］}。

3 靶向铜死亡治疗乳腺癌的策略

传统药物主要通过诱导癌细胞凋亡抑制肿瘤生长，与之不同的是，铜死亡通过脂酰化蛋白寡聚和铁硫簇蛋白降解等独特机制诱导肿瘤细胞死亡，这为规避BC治疗中常见的凋亡通路耐药带来希望。此外，铜死亡相关干预不仅可直接杀伤肿瘤细胞，还能通过调节肿瘤微环境中免疫细胞浸润及免疫检查点分子表达等，为联合治疗增效创造条件。基于上述特性，靶向铜死亡的治疗策略已成为突破BC治疗瓶颈的重要方向。

3.1　铜离子载体的应用

铜离子载体能够将铜离子转运至细胞内，通过增加细胞内铜离子的浓度来诱导铜死亡。Elesclomol是一种高效的铜离子载体，其通过形成ELC-Cu²⁺复合物将铜离子转运至细胞内，使ROS水平超过阈值，从而诱导BC细胞凋亡，此外，Elesclomol还能改善BC对阿霉素或紫杉醇等化疗药物的长期治疗所产生的耐药性^［39］。ZnPT作为一种非特异性铜离子载体，可通过靶向破坏铜稳态来诱导细胞死亡，并抑制TNBC细胞的活力与增殖。ZnPT通过下调EGFR-PI3K-AKT信号通路和上调MAPK信号通路来抑制TNBC细胞迁移、侵袭和干性^［28］。双硫仑（Disulfiram，DSF）作为一种高效且安全的铜离子载体，在BC治疗中已得到广泛的临床前研究，证据表明，DSF（尤其是与铜离子结合后）可通过多种通路有效杀伤TNBC细胞^［40］。此外，DSF在BC中的Ⅱ期临床研究（临床试验编号：NCT03323346）正在进行，该项目旨在为在常规全身性和/或局部治疗失败后，将DSF作为转移性BC的积极治疗方案提供临床证据。除了上述3种载体外，其他铜离子载体如二硫代氨基甲酸酯的活性形式（吡咯烷二硫代氨基甲酸酯和二乙基二硫代氨基甲酸酯）也有望用于BC治疗^［41-42］。

3.2　铜络合物的应用

由铜离子与有机配体中的金属核络合形成的铜络合物，在体内稳定存在并发挥特定功能，因此可作为BC的独特治疗手段。这类铜络合物通过调节关键细胞死亡蛋白的表达或直接促进细胞死亡进程，诱导免疫原性细胞死亡、细胞凋亡、氧化应激和氧化还原介导的细胞死亡及自噬在内的多种细胞死亡方式，从而有效治疗BC^［43］。如铜络合物DSF/Cu显著下调HER2胞内域表达，阻断AKT磷酸化和下游信号通路激活，改善曲妥珠单抗耐药并抑制HER2阳性BC生长^［44］。Morais T S等^［45］合成的磷烷Cu（I）复合物表现出显著的抗肿瘤细胞毒性，其机制主要在于阻滞BC细胞的G2/M细胞周期进程和诱导细胞凋亡来实现的。除了以上2种铜络合物外，还有几种具有潜在抗癌特性的其他铜络合物，比如Terpyridin、硫代氨基甲酸乙酮、Plumbagin等都可能成为未来BC治疗的新手段^［46］。

3.3　铜螯合剂的应用

四硫钼酸盐（Tetrathiomolybdate，TM）是一种高选择性铜螯合剂，临床前研究表明，TM可显著抑制HER2阳性BC细胞的增殖和转移^［47］。一项针对TM应用于TNBC的Ⅱ期研究（临床试验编号：NCT00195091）首次在临床上证明，通过口服铜螯合剂进行“铜剥夺”治疗，可作为高危TNBC患者一种有效且低毒的维持治疗策略。ATN-224是一种口服有效的铜螯合剂和超氧化物歧化酶1（SOD1）抑制剂，作为第二代四硫钼酸类似物，在多种癌症中展现出抗肿瘤活性^［48］。ATN-224在一项包含BC的实体瘤Ⅰ期临床试验中显示出良好的安全性，并且在2例患者中观察到超过6个月的疾病稳定期^［49］。除上述2种铜螯合剂外，D-penicillamine和Triethylenetetramine在肿瘤中也显示出良好的抑制作用^［50-51］。

3.4　铜死亡相关药物与传统化疗药物联合应用

铜死亡相关药物与传统化疗药物联合应用可发挥协同增效作用。传统化疗药物如顺铂、多柔比星和吉西他滨等通过不同机制治疗BC，但长期使用易产生耐药性^［3］。铜死亡相关药物可通过调节细胞内铜代谢、改变肿瘤细胞的生物学特性，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。例如，顺铂可通过损伤DNA抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡，但由于化疗药物的非特异性和毒副作用，以及肿瘤本身的复杂异质性和细胞干性，使化疗药物在临床中常面临耐药和剂量依赖毒性问题^［52］。ALDH是BC干细胞的标志物，而DSF对ALDH阳性BC干细胞具有抑制作用，当DSF与顺铂联用时，DSF通过抑制干性和克服ALDH⁺干细胞的耐药性来增强顺铂的细胞毒性^［53-54］。因此，铜死亡相关药物与传统化疗药物联合，一方面可能通过诱导肿瘤细胞发生铜死亡和细胞凋亡等多种形式的细胞死亡，从而提高治疗效果；另一方面，联合治疗还能够有效减少因化疗剂量过高而导致的毒副作用。

3.5　铜离子载体或铜络合物与免疫治疗药物联合应用

免疫治疗在BC治疗中取得了一定进展，但整体有效率仍有待提高^［55-56］。既往研究提示，经典铜死亡诱导剂DSF/Cu²⁺复合物虽可诱导铜死亡，却会使肿瘤细胞中PD-L1的表达水平升高，可能导致肿瘤免疫逃逸并削弱治疗效果^［57］。研究者巧妙地利用CuX-P系统介导PD-L1上调后形成细胞内吞的正反馈，富集DSF/Cu²⁺高效诱导肿瘤细胞铜死亡^［58］。此外，一项针对高危型TNBC的Ⅰb/Ⅱ期临床试验（临床试验编号：NCT06134375）将TM与Capecitabine和Pembrolizumab联合。该项目主要目的是评估TM与免疫治疗药物联用的安全性及其对TNBC预后的改善作用。目前该项目仍在招募中，可关注后续相关研究结果。总之，铜死亡可通过重塑肿瘤免疫微环境、调控免疫检查点分子表达、诱导免疫原性细胞死亡等途径，影响免疫治疗效果，这是BC联合治疗的重要研究方向。

4 小结与展望

铜死亡作为一种新型的程序性细胞死亡方式，其机制主要涉及铜与脂酰化蛋白结合，影响其寡聚化，从而介导铁硫簇蛋白的丢失，进而引发蛋白质毒性应激，最终导致细胞死亡。临床前及临床研究显示，铜死亡与BC密切相关，铜死亡相关生物标志物对BC的分子亚型诊断、预后、化疗敏感性和免疫浸润具有重要意义。

铜死亡相关生物标志物为BC精准治疗提供了新靶点。目前，铜离子载体、铜络合物和铜螯合剂等药物已在BC的基础研究中显示出协同化疗（如顺铂）及免疫治疗的潜力，其机制可能与靶向清除ALDH阳性干细胞并逆转耐药相关。然而，该类药物多处于临床前阶段，体内铜稳态调控复杂性及生物利用度低仍是主要转化障碍。未来需借助新型递送系统及基于生物标志物的患者分层策略，以推动铜死亡诱导剂在BC临床中的应用。

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