苦参碱对伴刀豆球蛋白A诱导的免疫性肝损伤的保护作用及潜在机制研究

Studies on protective effects and underlying mechanisms of matrine against concanavalin A-induced immune liver injury

摘要

目的 探讨苦参碱对伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）诱导的免疫性肝损伤的保护作用和潜在机制，为自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）的治疗提供替代药物。 方法 采用ConA建立免疫性肝损伤模型。苦参碱预给药后，通过天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）试剂盒检测转氨酶活性，HE染色评估组织病理损伤。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）试剂盒检测氧化应激水平。免疫荧光染色检测CD4⁺ T细胞和巨噬细胞的浸润数量。ELISA检测炎症因子表达水平。TUNEL染色评估肝细胞凋亡水平。Western blot分析JAK1/STAT3和PI3K/Akt信号通路中关键蛋白的表达及磷酸化水平。 结果 苦参碱能降低血浆中AST和ALT水平，缓解肝细胞凋亡/坏死和炎性浸润。同时，苦参碱能抑制CD4⁺T细胞和巨噬细胞在肝脏的浸润，减少炎症因子的表达。此外，苦参碱能升高肝脏中SOD和CAT活性，降低MDA含量，从而提高TAC水平。Western blot结果显示，苦参碱能抑制JAK1表达和STAT3磷酸化，同时促进PI3K表达和Akt磷酸化。 结论 苦参碱能抑制ConA诱导的炎症反应和氧化应激，并通过调控JAK1/STAT3和PI3K/Akt通路减轻肝细胞凋亡。苦参碱可作为天然候选物，用于AIH治疗药物的开发。

Abstract

Objective : To explore the protective effects of matrine on ConA-induced immune liver injury and underlying mechanism， thus providing an alternative drug for the treatment of autoimmune hepatitis （AIH）. Methods Immune liver injury model was established by ConA. After pretreatment with matrine， the transaminase activities were detected using AST and ALT assay kits. H&E staining was used to assess tissue pathological damage. The oxidative stress levels were detected by malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， and total antioxidant capacity （TAC） assay kits. The infiltration of CD4⁺T cells and macrophages were evaluated by immunofluorescence staining. The inflammatory cytokine levels were measured by ELISA. TUNEL staining was used to assess the hepatocyte apoptosis. Western blot was used to analyze the expression and phosphorylation levels of key proteins in the JAK1/STAT3 and PI3K/Akt signaling pathways. Results Matrine could reduce AST and ALT levels in plasma， and alleviate hepatocyte apoptosis/necrosis and inflammatory infiltration. Meanwhile， matrine could inhibit the infiltration of CD4⁺ T cells and macrophages in the liver， and reduce the expression of inflammatory factors. In addition， matrine could increase the activities of SOD and CAT in the liver and decrease MDA content， thereby improving TAC level. Western blot results showed that matrine could inhibit JAK1 expression and STAT3 phosphorylation， while promoting PI3K expression and Akt phosphorylation. Conclusion Matrine can inhibit ConA-induced inflammatory responses and oxidative stress， and alleviate hepatocyte apoptosis by regulating the JAK1/STAT3 and PI3K/Akt pathways. It can serve as a natural candidate for the development of drugs for AIH treatment.

Graphical abstract

关键词

苦参碱 / 伴刀豆球蛋白A / 免疫性肝损伤 / 炎症反应 / 细胞凋亡

Key words

Matrine / Concanavalin A / Immune-mediated liver injury / Inflammatory response / Apoptosis

自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）是一种常见的肝脏疾病，病理特征为T淋巴细胞浸润、转氨酶水平升高、肝细胞凋亡和肝实质破坏等^［1］，严重威胁人类健康。研究显示，AIH是由环境、遗传、病毒等多种因素引起的机体免疫系统紊乱，但具体发病机制仍不明确。在疾病早期，T淋巴细胞被激活，产生大量炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）和白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等。这些细胞因子加速T淋巴细胞浸润，引发炎症反应和氧化应激，诱导肝细胞凋亡。随着病情的进展，可发展为肝纤维化甚至肝硬化^［2］。糖皮质激素或联合免疫抑制药物（硫唑嘌呤）是临床治疗AIH的常用方法，虽然可以缓解症状，延长生存期，但其疗程长，并伴有腹痛、脱发、白细胞减少、肾毒性等不良反应，寻找安全有效的新型药物具有重要意义^［3］。

苦参为豆科槐属植物，具有除湿祛黄疸的功效。苦参碱是苦参的主要活性成分之一，对肝脏具有潜在的保护作用^［4］。大量研究表明，苦参碱具有多种药理活性，如抗炎^［5］、免疫调节^［6］、抗肿瘤^［7］、抗菌^［8］等。目前，苦参碱注射液作为慢性病毒性肝炎的辅助药物已被广泛应用。研究也表明，苦参碱对酒精性肝损伤^［9］、乙型肝炎^［10］、脂肪肝^［11］和肝纤维化^［12］具有良好的治疗效果，但对AIH的治疗作用却鲜有报道。伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）是一种从刀豆中提取的植物血凝素，能强烈激活T淋巴细胞。在ConA诱导的免疫性肝损伤中，T淋巴细胞被大量激活，血清转氨酶水平显著升高，可以较好地模拟临床免疫性肝损伤的病理特征^［13］。本研究通过ConA诱导免疫性肝损伤，探究苦参碱对AIH的治疗作用，并阐明其可能的作用机制，从而为AIH治疗药物的开发提供新思路。

1 材料和方法

1.1　药物和试剂

苦参碱、水飞蓟素（纯度≥98%）（上海源叶生物技术有限公司）；伴刀豆球蛋白A（美国Sigma-Aldrich公司）；天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）及过氧化氢酶（Catalase，CAT）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）、TUNEL检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；IFN-γ、TNF-α、IL-2及IL-6 ELISA试剂盒（上海Excell生物技术有限公司）；CD4、F4/80抗体（美国Thermo Fisher公司）；iNOS、Bcl-2、β-actin抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司）；Cox-2、Bax抗体（美国Abcam公司）；PI3K、Akt、p-Akt、JAK1、STAT3、p-STAT3抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.2　动物

50只雄性ICR小鼠（SPF级），重24～26 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于赣南医科大学实验动物中心。所有动物研究均遵循国际医学伦理规范，并经赣南医科大学动物伦理委员会批准（2021092）。

1.3　主要仪器

全景组织细胞定量分析系统（Tissue Gnostics，型号TissueFAXS Plus）；多功能酶标仪（Thermo Fisher，型号Varioskan LUX）；共聚焦显微镜（Leica，型号STELLARIS 5）；蛋白电泳仪电源（Bio-Rad，型号164-5070）；电泳槽及配件（Bio-Rad，型号Mini-PROTEANTetra）；凝胶成像系统（Tanon，型号2500）。

1.4　方法

1.4.1　动物实验方案

50只ICR小鼠随机分为5组，每组10只：⑴对照组（Control组）：生理盐水灌胃5 d，然后经尾静脉注射生理盐水；⑵模型组（ConA组）：生理盐水灌胃5 d，尾静脉注射ConA（20 mg/kg）；⑶苦参碱低剂量组（ConA+LM组）：50 mg/（kg·d）苦参碱灌胃5 d，尾静脉注射ConA （20 mg/kg）；⑷苦参碱高剂量组（ConA+HM组）：100 mg/（kg·d）苦参碱灌胃5 d，尾静脉注射ConA （20 mg/kg）；⑸阳性对照组（Silymarin组）：100 mg/（kg·d）水飞蓟素灌胃5 d，尾静脉注射ConA（20 mg/kg）。上述药物均以0.5%羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）配制成混悬液。

1.4.2　肝功能检测

注射ConA 12 h后，从小鼠眼眶内采血。2 000 r/min离心15 min后，测定转氨酶活性。小鼠解剖后，称取肝脏质量，记录肝脏质量与体重之比（肝脏质量/体重×100%）作为肝脏指数。

1.4.3　组织病理学分析

处死小鼠后，用4%多聚甲醛固定肝左叶。将石蜡包埋的组织切成3 μm切片。HE染色后进行组织病理学观察，并采用TUNEL检测试剂盒观察肝细胞凋亡数量。对于免疫荧光染色切片，组织脱蜡处理后，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，血清封闭样品，最后分别用CD4和F4/80一抗孵育过夜。洗涤后，二抗孵育1 h。细胞核用DAPI染色，然后置于共聚焦显微镜下观察。

1.4.4　炎症因子和氧化应激水平测定

收集肝组织匀浆上清液，按照ELISA试剂盒的操作说明进行处理。根据标准曲线计算上清液中炎症因子的浓度。同样，肝组织在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的生理盐水中匀浆。离心后，收集上清液，按照试剂盒说明书进行操作。根据标准曲线计算MDA、SOD、CAT和TAC的含量。

1.4.5　Western blot

肝组织匀浆后，12 000 g离心15 min，收集上清液。将等量的蛋白质样品装入SDS-PAGE样品孔中。样品经电泳分离，然后转移至PVDF膜上，用封闭液封闭，一抗孵育过夜。清洗PVDF膜，二抗室温孵育1 h。最后，使用ECL检测试剂盒和凝胶成像系统对条带进行可视化分析。

1.5　统计学处理

数据采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。计量资料以\overline{x}±s表示，组间比较采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　苦参碱改善ConA诱导的免疫性肝损伤

血浆中AST和ALT的水平如图1A所示。与对照组相比，模型组的血浆AST和ALT水平均显著升高。而与模型组相比，苦参碱组的转氨酶AST和ALT水平呈剂量相关性下降。同样，与模型组相比，阳性对照组的转氨酶AST和ALT水平明显下调。此外，模型组的肝脏指数较对照组显著升高，而苦参碱低、高剂量组的肝脏指数较模型组显著降低，提示苦参碱可以减轻肝组织水肿（图1B）。HE染色结果显示，与对照组相比，模型组中央静脉红细胞淤积，并伴有大量炎症细胞浸润以及大面积肝细胞坏死。苦参碱低、高剂量组及阳性对照组的肝脏炎症浸润和坏死面积均较模型组显著减轻（图1C），进一步支持苦参碱可减轻ConA诱导的肝损伤。

2.2　苦参碱抑制炎症反应和氧化应激

有研究^［13］证实，ConA会激活T淋巴细胞，释放大量炎症因子。随后我们检测了肝组织中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的含量。如图2A所示，与对照组相比，模型组中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的含量显著升高。与模型组相比，苦参碱低、高剂量组均显著抑制上述炎症因子的释放。有研究^［14］表明，ConA也诱导氧化应激反应，增加ROS和MDA等脂质过氧化产物的生成，导致肝损伤。此外，SOD和CAT等抗氧化剂也会被过度消耗。研究结果显示，与对照组相比，模型组MDA水平显著升高，而肝组织中SOD、CAT和TAC水平显著降低。然而，苦参碱给药可逆转上述变化，表现为MDA的生成减少，SOD、CAT和TAC水平升高（图2B）。阳性对照组同样可显著抑制ConA诱导的氧化应激反应。此外，Western blot结果显示，苦参碱也显著抑制炎症相关蛋白i-NOS和Cox-2的表达水平（图2C～2E）。阳性对照组亦表现出类似的抗炎作用。

2.3　苦参碱抑制免疫细胞的浸润

T淋巴细胞浸润是AIH的典型病理改变之一。因此，我们统计了肝组织中CD4染色的阳性区域。如图3A所示，模型组肝组织内CD4⁺ T细胞浸润较对照组明显加重，而苦参碱低、高剂量组均可剂量依赖性地减小CD4⁺ T细胞阳性面积。巨噬细胞（F4/80⁺细胞）的浸润趋势与之相似（图3B）：模型组巨噬细胞（F4/80⁺细胞）数量较对照组显著升高，苦参碱低、高剂量组则明显降低该细胞数量。此外，阳性对照组亦表现出对CD4⁺ T细胞及巨噬细胞浸润的显著抑制作用。

2.4　苦参碱减少肝细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，与对照组相比，模型组肝细胞凋亡数量显著增加。而苦参碱低、高剂量组以及阳性对照组肝细胞凋亡面积较模型组明显减少（图4A～4B）。进一步Western blot检测凋亡相关蛋白表达，发现相比于对照组，模型组肝组织中Bcl-2表达水平显著下调，Bax蛋白表达水平显著上调（图4C～4D）。与模型组比较，苦参碱组及阳性对照组中Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低（图4C～4D）。

2.5　苦参碱调节JAK1/STAT3和PI3K/Akt通路抑制肝细胞凋亡

有研究^［15］证实，ConA激活CD4⁺ T细胞释放的大量炎症因子，可通过干预JAK1/STAT3、PI3K/Akt等信号通路介导肝细胞凋亡。为了进一步揭示苦参碱的肝保护机制，我们检测了苦参碱对IL-6激活的JAK1/STAT3信号通路的影响。结果显示，与对照组相比，模型组JAK1表达水平增加、STAT3磷酸化水平升高。与模型组相比，苦参碱高剂量组则显著抑制JAK1的表达和STAT3的磷酸化（图5A～5C）。与对照组相比，模型组的PI3K表达和Akt的磷酸化水平显著降低（图5D～5F）。苦参碱低、高剂量组的PI3K的表达水平和Akt的磷酸化水平显著高于模型组。

3 讨论

有研究^［15］显示，ConA静脉注射4 h后，即可与肝巨噬细胞表面的MHC Ⅱ结合，引起巨噬细胞活化并释放炎症因子。随后，CD4⁺ T细胞识别ConA修饰的MHC Ⅱ被大量活化，释放炎症因子，从而引起免疫性肝损伤。由于CD4⁺ T细胞和巨噬细胞在AIH病理中起着关键作用，我们分析了CD4⁺ T细胞和巨噬细胞在肝脏组织中的浸润情况。结果显示，ConA显著诱导CD4⁺ T细胞和巨噬细胞在肝组织中的浸润，并大量释放炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6。苦参碱预给药后则显著降低ALT和AST水平，改善肝组织病理损伤，并减少CD4⁺ T细胞和巨噬细胞的浸润，下调TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的表达水平。以上结果证明苦参碱能有效抑制ConA诱导的炎症反应，改善免疫性肝损伤。

炎症反应常伴随氧化应激。研究证实，ConA可诱导自由基的生成，导致细胞磷脂膜的破坏，加重病理损伤^［16］。SOD和CAT是重要的抗氧化剂，可以有效清除自由基，维持氧化和抗氧化之间的平衡。MDA作为膜脂过氧化的主要产物，是组织过氧化的常见指标。本研究结果显示，苦参碱预给药后SOD、CAT和TAC水平显著升高，MDA水平降低，说明苦参碱的肝保护作用也与抑制氧化应激有关。研究表明，活化的T细胞和巨噬细胞分泌大量炎症因子，通过调节多种信号通路，诱导肝细胞凋亡^［17］。例如，IL-6/JAK/STAT3通路已被证明在ConA诱导的肝损伤中被激活。当细胞因子受体与IL-6结合时，激活的JAK使STAT磷酸化并形成二聚体进入细胞核上调BNIP3的表达。增加的BNIP3可抑制Bcl-2的抗凋亡作用，并通过激活半胱天冬酶，触发细胞凋亡^［18］。此外，研究还证实，PI3K/Akt通路在ConA诱导的肝损伤过程中发挥保护作用。PI3K/Akt通路参与调控细胞增殖、凋亡和代谢等生理过程。PI3K激活其下游靶点Akt后，游离Bcl-2的释放增加，从而抑制细胞凋亡^［19］。为了进一步揭示苦参碱的肝保护机制，我们检测了苦参碱对JAK/STAT3和PI3K/Akt通路的影响。结果显示，苦参碱促进JAK1表达和STAT3磷酸化，抑制JAK/STAT3通路。同时，苦参碱也能有效上调PI3K表达和Akt磷酸化，激活PI3K/Akt通路。以上结果提示，苦参碱可通过调节JAK/STAT3和PI3K/Akt通路抑制肝细胞凋亡。

综上所述，苦参碱能有效抑制ConA诱导的炎症反应和氧化应激，并通过调节JAK1/STAT3和PI3K/Akt通路抑制肝细胞凋亡。本研究揭示了苦参碱对AIH的保护作用和潜在的作用机制，为其临床应用提供了理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金地区项目(82160777)