葛根素通过激活PI3K/Akt信号通路减轻2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤

Puerarin attenuates cardiac ischemia/reperfusion injury in type 2 diabetic rats by activating the PI3K/Akt signaling pathway

摘要

目的 观察葛根素（Puerarin，Pue）对2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM）大鼠心肌缺血再灌注（Ischemia/reperfusion， I/R）损伤的保护作用，并探讨其对PI3K/Akt信号通路的调控机制。 方法 建立T2DM雄性SD大鼠模型，取16周龄T2DM雄性SD大鼠30只，随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）和葛根素预处理组（I/R+Pue组），每组10只。I/R+Pue组腹腔注射葛根素50 mg/（kg·d），连续3 d，Sham组与I/R组以等量生理盐水替代，末次给药24 h后构建心肌I/R模型（左冠状动脉前降支结扎30 min，再灌注2 h）。葛根素给药前1 d、给药3 d后监测空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）。超声心动图测量心脏射血分数（EF），ELISA检测血清心肌损伤标志物（CK、LDH、cTnI）及肝肾功能指标，HE染色和TUNEL染色分别评估心肌病理损伤和细胞凋亡，Western blot检测PI3K、p-Akt蛋白表达。 结果 与Sham组比较，I/R组给药前1 d及给药3 d后血清FBG、ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），CK、LDH及cTnI水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与I/R组比较，I/R+Pue组血清ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），给药3 d后FBG、CK、LDH、cTnI水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。HE染色显示，Sham组大鼠心肌细胞形态规则、排列整齐、横纹清晰，未见细胞水肿及炎症浸润。I/R组心肌细胞形态不规则，排列紊乱，局部肌纤维横纹消失，可见明显炎症细胞浸润及细胞质水肿，部分细胞出现变性坏死。与I/R组比较，I/R+Pue组心肌组织损伤程度明显减轻，炎症细胞浸润减少，心肌细胞结构相对完整。TUNEL染色显示，Sham组心肌细胞凋亡极少，I/R组出现大量TUNEL阳性细胞（绿色荧光），与Sham组比较，I/R组TUNEL阳性细胞比例显著升高（P<0.05），与I/R组比较，I/R+Pue组TUNEL阳性细胞比例显著降低（P<0.05）。Western blot结果显示，与Sham组比较，I/R组心肌PI3K和p-Akt水平显著降低（P<0.05），与I/R组比较，I/R+Pue组PI3K和p-Akt水平显著升高（P<0.05）。 结论 葛根素可显著减轻T2DM大鼠心肌I/R损伤并改善心脏收缩功能，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路、抑制心肌细胞凋亡有关。

Abstract

Objective : To investigate the protective effect of puerarin （Pue） against cardiac ischemia/reperfusion （I/R） injury in type 2 diabetic （T2DM） rats and to explore its regulatory mechanism on the PI3K/Akt signaling pathway. Methods A T2DM male SD rat model was established by selecting 30 sixteen-week-old T2DM male SD rats， which were randomly divided into three groups： sham group （Sham）， ischemia-reperfusion group （I/R）， and puerarin pretreatment group （I/R+Pue）， with 10 rats in each group. The I/R+Pue group received intraperitoneal injections of puerarin at 50 mg/（kg·d） for three consecutive days， while the Sham and I/R groups received an equal volume of saline instead. Twenty-four hours after the final drug administration， myocardial I/R model was established by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 minutes followed by 2 hours of reperfusion. Fasting blood glucose （FBG） levels were monitored one day before puerarin administration and three days after treatment. Echocardiography was used to measure left ventricular ejection fraction （EF）. Serum levels of myocardial injury markers （CK， LDH， cTnI） and liver/kidney function indicators were assessed by ELISA. Myocardial pathological damage and apoptosis were evaluated using hematoxylin-eosin （HE） staining and TUNEL assay， respectively. Western blot analysis was performed to detect protein expression of PI3K and p-Akt. Results Compared with the Sham group， there was no statistically significant difference in serum FBG， ALT， AST， BUN， and Cr levels between the I/R group before drug administration and 3 days after administration （P>0.05）， while CK， LDH， and cTnI levels were significantly elevated， showing statistical significance （P<0.05）. Compared with the I/R group， the I/R+Pue group showed no significant differences in serum ALT， AST， BUN， and Cr levels （P>0.05）， but FBG， CK， LDH， and cTnI levels were significantly reduced 3 days after administration， with statistical significance （P<0.05）. HE staining revealed that myocardial cells in the Sham group had regular morphology， orderly arrangement， and clear striations， without cellular edema or inflammatory infiltration. In contrast， myocardial cells in the I/R group exhibited irregular shapes， disordered arrangement， loss of striations in some areas， obvious inflammatory cell infiltration， cytoplasmic edema， and degeneration or necrosis in some cells. Compared with the I/R group， the I/R+Pue group showed significantly reduced myocardial tissue damage， less inflammatory cell infiltration， and relatively intact myocardial cell structure. TUNEL staining showed minimal apoptosis in the Sham group， whereas numerous TUNEL-positive cells （green fluorescence） were observed in the I/R group. The proportion of TUNEL-positive cells was significantly higher in the I/R group compared with the Sham group （P<0.05）， and significantly lower in the I/R+Pue group compared with the I/R group （P<0.05）. Western blot results indicated that， compared with the Sham group， PI3K and p-Akt levels in the I/R group were significantly decreased （P<0.05）， whereas in the I/R+Pue group， these levels were significantly increased compared with the I/R group （P<0.05）. Conclusion Puerarin can significantly attenuate myocardial I/R injury and improve cardiac contractile function in T2DM rats， and the underlying mechanism may involve activation of the PI3K/Akt signaling pathway and inhibition of cardiomyocyte apoptosis.

Graphical abstract

关键词

葛根素 / 缺血再灌注损伤 / 2型糖尿病 / PI3K/Akt信号通路 / 心肌保护

Key words

Puerarin / Ischemia/reperfusion injury / Type 2 diabetes mellitus / PI3K/Akt signaling pathway / Myocardial protection

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以慢性高血糖和胰岛素抵抗为特征的代谢性疾病，与多种心血管并发症密切相关。T2DM患者心肌对缺血再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）损伤的耐受性显著降低，这一现象被称为“糖尿病心肌易感性”，其机制可能与氧化应激增强、炎症失调及促存活信号通路抑制有关^［1-3］。PI3K/Akt信号通路是心肌细胞重要的内源性促存活通路，也是再灌注损伤挽救激酶（Reperfusion injury salvage kinase，RISK）网络的重要组成部分，参与调控葡萄糖摄取、能量代谢、线粒体稳态、炎症反应和细胞凋亡。在糖尿病心肌病状态下，持续高糖、胰岛素抵抗和脂毒性可抑制IRS-1/PI3K/Akt信号传导，降低Akt磷酸化水平，进而促进线粒体通透性转换孔开放、Bax/Bcl-2失衡及caspase级联激活，削弱心肌对I/R应激的内源性保护反应，从而加重心肌细胞损伤^［3］。因此，在T2DM合并心肌I/R损伤背景下，恢复或增强PI3K/Akt信号通路可能是改善心肌损伤和心功能的重要干预靶点。

葛根素（Puerarin，Pue）是从豆科植物野葛（Pueraria lobata）干燥根中提取的主要异黄酮类活性成分，具有扩张冠状动脉、降低心肌耗氧量、抗氧化、抗炎及改善胰岛素抵抗等多种药理作用^［4-6］。既往研究证实，Pue对非糖尿病动物模型的心肌I/R损伤具有明确保护作用^［7-8］，但在T2DM特殊病理背景下能否有效减轻心肌I/R损伤，目前尚缺乏系统研究。

本研究通过建立T2DM大鼠心肌I/R损伤模型，观察Pue干预对心功能、心肌损伤标志物、病理形态、细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响，旨在阐明其心肌保护作用及潜在机制，为Pue用于糖尿病合并缺血性心肌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试剂与仪器

葛根素（纯度≥98%，江苏强耀生物科技有限公司，货号：CAS No. 3681-99-0）、链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma-Aldrich公司）；HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、TUNEL染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、血糖检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、LDH试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）、CK检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、cTnI检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、ALT检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号/批号：C009-2-1）、AST检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、BUN检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、Cr检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；抗PI3K抗体（美国Cell Signaling Technology公司）、抗p-Akt抗体（美国Cell Signaling Technology公司）、抗β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；小动物超声心动图仪（加拿大VisualSonics公司，型号：Vevo 3100）、小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司，型号：ALC-V8S-651）、凝胶电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司，型号：Gel Doc XR+）。

1.2　实验动物

SPF级6周龄雄性SD大鼠，购自长沙天勤生物技术有限公司［许可证号：SCXK（湘）2019-0014］，体质量180～220 g。饲养条件：温度22～25 ℃，相对湿度50%～60%，12 h明暗循环，自由摄食饮水。本研究经南昌乐悠生物科技有限公司动物伦理委员会批准（批准号：RYE2020091101）。

1.3　T2DM模型大鼠建立

SPF级6周龄雄性SD大鼠适应性饲养1周后，检测基础空腹血糖（禁食8 h）。随后以高脂高糖饲料（含58%脂肪、25%蔗糖）喂养6周建立胰岛素抵抗后再予以单次腹腔注射小剂量STZ（35 mg/kg，溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5）。注射72 h后再次检测空腹血糖（禁食8 h），以血糖≥11.1 mmol/L作为造模成功标准^［9］。T2DM模型大鼠继续高脂高糖饲养至第16周龄用于实验。

1.4　实验分组与心肌I/R模型构建

取16周龄T2DM雄性SD大鼠30只，按随机数字表法分为3组（n=10）：Sham组、I/R组、I/R+Pue组。I/R+Pue组大鼠腹腔注射Pue 50 mg/（kg·d），连续3 d，I/R组及Sham组以等量生理盐水替代，末次注射24 h后构建I/R模型。各组在葛根素给药前1 d以及在连续给药3 d后分别检测空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）。

I/R模型构建：以4%异氟烷诱导麻醉，大鼠仰卧固定，气管插管后连接小动物呼吸机（潮气量6 mL/kg，频率60次/min），持续监测心电图（Electrocardiogram，ECG）。于第四、五肋间开胸，暴露心脏，以4-0丝线结扎左冠状动脉前降支（Left anterior descending，LAD），以心肌颜色变白及ECG示ST段弓背形抬高确认缺血成功；缺血30 min后松开结扎线，以心肌颜色恢复及出现再灌注心律失常确认再灌注，持续2 h，于负压下逐层关胸。Sham组穿线绕过LAD但不结扎，其余操作相同。

1.5　心脏射血分数（Ejection fraction，EF）测定

再灌注结束后，待大鼠完全苏醒2 h，以小动物超声心动图仪（Vevo 3100）在胸骨旁左室长轴切面进行M型超声检查，测量各组左室收缩末期内径和舒张末期内径，计算EF值，每只大鼠重复测量3次取均值。

1.6　标本采集

完成M型超声检查后，以4%异氟烷诱导麻醉，经心脏穿刺取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，-80 ℃保存备用。随即取出心脏，将左心室心肌横切：一份置4%多聚甲醛固定，用于病理学检测；另一份经液氮速冻后转-80℃保存，用于蛋白质检测。

1.7　ELISA检测

按ELISA试剂盒说明书检测血清CK、LDH、cTnI、ALT、AST、BUN、Cr。

1.8　HE染色

取心肌石蜡切片，依次将切片放入二甲苯、乙醇等溶液中脱蜡和水化，随后行苏木素染液染色，自来水冲洗，盐酸酒精分化，氨水返蓝。再入伊红染液中染色。染色后将切片依次放入不同浓度的乙醇和二甲苯中脱水透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察心肌细胞形态及炎症细胞浸润情况。

1.9　TUNEL染色

取心肌石蜡切片，常规脱蜡水化：依次经二甲苯和无水乙醇各洗涤2次，再以95%和75%梯度乙醇各洗涤1次。切片经蛋白酶K抗原修复后，磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline，PBS）清洗；以含0.5% H₂O₂的PBS溶液室温孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶活性。按试剂盒推荐比例配制TdT酶与荧光标记dUTP反应混合液，加至样本上，于37 ℃避光孵育1~2 h；孵育结束后PBS充分洗涤，去除未结合的核苷酸与酶。随后滴加辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）偶联的抗地高辛抗体，于37 ℃湿盒中孵育30 min。采用二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）底物与H₂O₂进行显色反应，以过量超纯水终止反应并洗涤。切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片。每张切片于激光共聚焦显微镜下随机选取5个不重叠视野进行观察与图像采集。计算凋亡指数（Apoptotic index，AI）=TUNEL阳性细胞数/总心肌细胞数×100%，并对各组AI进行统计分析。

1.10　Western blot检测

取心肌组织（约50 mg）加入含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000×g离心15 min取上清液，BCA法定量测量蛋白浓度。各组上样量均为30 μg，经10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL化学发光显影。以β-actin为内参，采用Image J软件进行灰度值分析。

1.11　统计学处理

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0进行统计分析，方差齐性的计量资料以均数±标准差表示，2组间比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　葛根素对T2DM大鼠血清生化指标的影响

与Sham组比较，I/R组给药前1 d及给药3 d后血清FBG、ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），CK、LDH及cTnI水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与I/R组比较，I/R+Pue组血清ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），给药后FBG、CK、LDH、cTnI水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2　葛根素对T2DM大鼠心脏EF的影响

与Sham组比较，I/R组大鼠EF显著降低（t=16.842，P<0.001），提示心肌缺血再灌注可显著损害T2DM大鼠左心室收缩功能。与I/R组比较，I/R+Pue组EF显著升高（t=-10.889，P<0.001）。

2.3　葛根素对T2DM大鼠心肌病理损伤的影响

HE染色结果显示，Sham组大鼠心肌细胞形态规则、排列整齐、横纹清晰，未见细胞水肿及炎症浸润。I/R组心肌细胞形态不规则，排列紊乱，局部肌纤维横纹消失，可见明显炎症细胞浸润及细胞质水肿，部分细胞出现变性坏死。与I/R组比较，I/R+Pue组心肌组织损伤程度明显减轻，炎症细胞浸润减少，心肌细胞结构相对完整（图1）。

2.4　葛根素对T2DM大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色显示，Sham组心肌细胞凋亡极少，I/R组出现大量TUNEL阳性细胞（绿色荧光），提示缺血再灌注导致显著的心肌细胞凋亡。与Sham组比较，I/R组TUNEL阳性细胞比例显著升高（P<0.001），与I/R组比较，I/R+Pue组TUNEL阳性细胞比例显著降低（P<0.001）（图2）。

2.5　葛根素对T2DM大鼠心肌PI3K/Akt信号通路的影响

与Sham组比较，I/R组心肌PI3K和p-Akt蛋白水平显著降低（P<0.001），提示I/R损伤抑制了PI3K/Akt促存活信号通路的激活。与I/R组比较，I/R+Pue组PI3K和p-Akt蛋白水平显著升高（P<0.001）（图3）。

3 讨论

根据2020年发表在《BMJ》的中国大规模流行病学调查，我国成年人糖尿病总体患病率为12.8%，其中T2DM占绝大多数，且知晓率、治疗率和控制率仍不理想^［10］。T2DM患者心血管疾病风险较非糖尿病人群高2~4倍，约50%的T2DM患者死于心血管疾病，其中心肌梗死、心力衰竭是主要死因^［11］。T2DM患者心肌对缺血再灌注损伤的易感性显著增加，其发病机制涉及高血糖介导的氧化应激增强、炎症反应持续激活以及促存活信号通路受损等多个层面^［1-3］。因此，在T2DM背景下寻找有效减轻心肌I/R损伤的干预策略具有重要临床意义。

葛根素作为中药葛根的核心活性成分，其心血管保护和糖代谢调节作用已在大量体外和动物实验中得到证实^［4-6］。本研究在剂量选择上参考既往文献^［9，12］，Pue在糖尿病动物模型中的有效且安全剂量为50 mg/kg。本案研究结果显示，Pue干预后各组间ALT、AST、BUN及Cr水平差异均无统计学意义（均P>0.05），证实该剂量在发挥药效的同时不引发明显肝肾毒性，具有良好安全性，为后续临床转化提供了初步毒理学依据。

CK、LDH和cTnI是反映心肌细胞损伤与坏死程度的敏感标志物。本研究中，I/R组上述指标均较Sham组显著升高，而I/R+Pue组上述指标较I/R组显著降低，提示葛根素能有效减少心肌细胞膜通透性改变及内容物渗漏。此外，本研究还发现Pue干预可显著降低T2DM大鼠的空腹血糖水平，这与其改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖摄取的药理作用相符^［4］，提示血糖控制可能是其减轻心肌易感性的重要机制之一。

从组织形态学层面，HE染色和TUNEL染色结果证实了Pue的心肌保护效应：I/R+Pue组心肌炎症浸润和细胞变性明显减轻，凋亡指数显著降低。这与已有研究^［6，13］报道Pue能通过抑制炎症反应和凋亡通路减轻糖尿病大鼠心肌损伤的结论相一致。从心功能层面，I/R组EF值显著降低，而I/R+Pue组EF值得到明显增加，结合上述组织学改变，表明葛根素通过减少心肌细胞丢失、维护心肌结构完整性，最终改善了再灌注后的心脏收缩功能。

PI3K/Akt信号通路是调控细胞存活和凋亡的核心通路，也是糖尿病心肌I/R损伤中受到抑制的重要促存活信号。该通路激活后可促进Akt磷酸化，进一步调控GSK-3β、mTOR、Bad、Bcl-2/Bax及caspase-3等下游分子，抑制线粒体通透性转换孔开放，从而对抗I/R诱导的心肌细胞凋亡^［14-15］。本研究发现，I/R损伤降低了心肌p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt水平，而葛根素处理后显著上调上述指标，提示其心肌保护机制与恢复PI3K/Akt通路磷酸化活化密切相关。这与近年来多项研究报道天然活性成分通过激活PI3K/Akt通路发挥心肌保护作用的结果相呼应^［16-18］。

综上所述，本研究证实葛根素（50 mg/kg）在T2DM大鼠心肌I/R损伤模型中安全有效，可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制心肌细胞凋亡，显著减轻心肌损伤、改善心脏收缩功能，并具有降低血糖的协同效应，为其临床应用提供了实验支撑。本研究局限性在于仅采用单一剂量和短期给药方案，且血糖动态变化、代表性超声心动图及PI3K/Akt通路完整磷酸化蛋白谱仍需进一步完善；未来需进一步探讨葛根素的量效关系、长期用药安全性及其对PI3K/Akt下游凋亡和线粒体功能分子的调控作用。

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基金资助

江西省中医药管理局科技计划项目(2021B123)