一株圈养疣鼻天鹅源维隆气单胞菌的分离鉴定、致病性和耐药性

Isolation，Identification， Pathogenicity and Drug Resistance of Aeromonas veronii from a Captive Mute Swan

摘要

维隆气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种在陆生和水生环境中普遍存在的细菌，对动物和人类健康的影响越来越大，它正在全球成为一种新兴病原体。为探究一圈养疣鼻天鹅（Cygnus olor）的死亡原因，在对其进行病理剖检后，取其内脏组织进行细菌分离和病毒PCR检测；随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和gyrB基因序列分析对分离菌种进行鉴定；之后对该分离菌株进行毒力基因检测、雏鹅感染试验和药物敏感性分析。结果显示：分离菌株为维隆气单胞菌，命名为HNYJ-4/2023；该菌株携带alt、ela、lip、act、aerA和fla六个毒力基因，对雏鹅半数致死剂量为1.74 × 10⁷ CFU/mL。药敏试验结果显示，该菌株对美罗培南、氨苄青霉素、恩诺沙星和头孢他啶耐药。研究结果扩展了维隆气单胞菌已知宿主的范围。这些发现表明，人们急需针对环境、动物和人类开展维隆气单胞菌的广泛监测和研究，最大限度阻止维隆气单胞菌在三者之间的传播。

Abstract

Aeromonas veronii is a ubiquitous bacterium in terrestrial and aquatic environments. It is becoming an emerging pathogen worldwide with an increasing impact on animal and human health. In order to investigate the cause of death of a captive mute swan （Cygnus olor）， a pathological autopsy was performed and visceral tissues were collected for bacterial isolation and virus detection by PCR. The isolated strains were identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） and gyrB gene sequence analysis. Subsequently， the isolated strains were tested for virulence genes， gosling infection test and drug sensitivity analysis， respectively. The results showed that the isolated strain was Aeromonas veronii， named HNYJ-4/2023. This strain contained six virulence genes： alt， ela， lip， act， aerA and fla， and the median lethal dose （LD₅₀） to gosling was 1.74 × 10⁷ CFU/mL. Antimicrobial susceptibility test showed that the A.veronii HNYJ-4/2023 was resistant to meropenem， ampicillin， enrofloxacin and ceftazidime， respectively. The results extend the spectrum of known hosts of A.veronii. These findings highlight the urgent need for comprehensive surveillance and research targeting A.veronii across the environment， animals and humans to minimize the spread of A.veronii among them.

Graphical abstract

关键词

疣鼻天鹅 / 维隆气单胞菌 / 新兴病原体 / 人兽共患病 / 公共卫生

Key words

Mute swan（Cygnus olor） / Aeromonas veronii / Emerging pathogen / Zoonosis / Public health

维隆气单胞菌（Aeromonas veronii），又名凡隆气单胞菌、维氏气单胞菌，是气单胞菌属（Aeromonas）中的一个重要致病菌种。近年来，该菌感染导致多种水生和陆生动物发病，包括绵羊、长江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、中华鳖（Pelodiscus sinensis）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）及其他多种淡水鱼^［1-7］。此外，维隆气单胞菌也可感染人类，特别是对老年人和儿童危害显著，可致败血症、肠胃炎和其他疾病^［8-9］。该菌不仅是全球淡水鱼类的主要病原之一^［5，10］，也是食品中最易检出的气单胞菌属菌种^［11］。随着临床病例的增加，维隆气单胞菌已成为气单胞菌属中的优势致病种，人类和动物主要通过摄入受污染的水或食物、接触粪便或直接接触而感染^［12-13］。由于其同时威胁动物健康、环境安全、人类健康和食品安全，维隆气单胞菌对“同一个健康”（One Health）构成严峻挑战^{［9-10，13-14］}，因而被视为一种新兴的人兽共患病原体^［14］。尽管该菌宿主广泛，但目前尚无圈养疣鼻天鹅（Cygnus olor）源维隆气单胞菌的报道。2023年4月17—20日，河南省某公园圈养的疣鼻天鹅在无显著临床症状的情况下陆续死亡3只。为查明死因，本研究从一只体质量9.6 kg的病死疣鼻天鹅肝脏和心脏组织中分离到一株细菌，经鉴定为维隆气单胞菌，并通过毒力基因检测、雏鹅感染试验和药物敏感性试验分析了其生物学特性。根据药敏试验结果，我们选用敏感药物成功治疗了公园内其余发病疣鼻天鹅。本研究首次报道了圈养疣鼻天鹅源维隆气单胞菌的感染，扩大了该菌的已知宿主范围，并对其潜在的传播途径和公共卫生意义进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源

病料为河南某公园送检的一只病死疣鼻天鹅。

1.2 主要试剂与菌株

DNA纯化试剂盒、PCR试剂和DNA Marker均购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂平板购自北京奥博星生物技术有限责任公司；抗菌药购自北京索莱宝科技有限公司；大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 细菌分离培养和病毒PCR检测

细菌分离培养：使用75%乙醇消毒病死疣鼻天鹅体表。在无菌条件下，分别取肝脏和心脏的新鲜切面，用接种环蘸取后，划线接种于含5%脱纤维绵羊血的脑心浸液（BHI）琼脂平板、含5%绵羊血的血琼脂平板、含5%绵羊血的麦康凯（MacConkey）琼脂平板和含5%绵羊血的胰蛋白酶大豆（TSA）琼脂平板。将所有平板置于恒温培养箱中37 ℃培养12～24 h后，挑取优势单菌落进行革兰氏染色和镜检。

病毒核酸提取与检测：取相同组织样本，置于无菌磷酸盐缓冲盐水（pH = 7.2）中匀浆。将组织匀浆液冻融3次后，4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清。使用病毒基因组DNA/RNA试剂盒提取的总核酸作为PCR/RT-PCR模板。参考文献［15-17］报道的引物和反应程序，分别检测鹅呼肠孤病毒（Goose reovirus）、鹅出血性多瘤病毒（Goose hemorrhagic polyomavirus）、鹅细小病毒（Goose parvovirus）、坦布苏病毒（Tembusu virus）和禽流感病毒（Avian influenza virus）。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定

挑取新鲜纯培养的单菌落，点样于MALDI-TOF MS（美国Bruker公司）靶板的样品孔中，室温下自然干燥。随后，在样品表面覆盖1 μL基质溶液，干燥后进行质谱采集与分析。

1.4.2 基于管家基因gyrB的序列分析

用煮沸法提取的分离菌株基因组DNA作为PCR模板，参照文献［18］的扩增反应体系和程序，使用通用引物gyrB-F（5'-GAAGTCATCATGACCG TTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）和gyrB-R （5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRT NGCRTCNGTCAT-3'）扩增gyrB基因。通过1%琼脂糖凝胶检测PCR产物，并将纯化的目的片段送至郑州尚亚生物科技有限公司测序。基于获得的gyrB基因序列，利用MEGA-X软件，以邻接法构建系统发育树，Bootstrap自展值设置为1 000。

1.5 毒力基因检测

用煮沸法提取的分离菌株基因组DNA作为PCR模板，参照文献［19］的引物和PCR扩增程序检测编码热不稳定肠毒素（alt）、弹性蛋白酶（ela）、脂肪酶（lip）、细胞毒性肠毒素（act）、气溶素（aerA）、鞭毛蛋白（fla）、溶血素A（hlyA）和热稳定细胞毒素（ast）的基因。所有PCR产物均使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 雏鹅感染试验

取1日龄健康雏鹅25只（原阳云波鹅业公司，中国），随机分为5组，每组5只。其中4组为感染组，分别通过腹腔注射接种1.1 × 10⁹、1.1 × 10⁸、1.1 × 10⁷、1.1 × 10⁶ CFU/mL（0.2 mL/只）的本研究分离菌株悬液；另设一组为对照组，每只雏鹅接种无菌PBS（0.2 mL/只）。接种后连续记录7 d雏鹅的临床症状和死亡率。采用累计法计算其半数致死量（median lethal dose，LD₅₀）。试验结束后，随机选取3只死亡雏鹅，无菌采集其心脏与肝脏组织进行细菌的再分离与鉴定，以验证感染。同时，取肺脏与肝脏组织，经10%福尔马林固定24 h以上，进行石蜡包埋、切片及H&E染色，做组织病理学观察。

1.7 药物敏感性试验

根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南^［20］，采用微肉汤稀释法测定分离菌株对抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）。将分离菌株单菌落接种于MH琼脂平板上，在（35 ± 1）℃孵育24 h。挑取单菌落，以MH肉汤配制0.5麦氏浊度（5 × 10⁵ CFU/mL）标准菌悬液。然后在96孔板的每孔中加入50 µL菌悬液，在第1列孔添加药液50 µL，做2倍倍比稀释。仅含菌悬液的2孔作为阳性对照，仅含无菌MH液体培养基的2孔作为阴性对照，（35 ± 1）℃孵育（24 ± 2） h。检测的抗菌药包括美罗培南、利奈唑胺、阿莫西林、多西环素、替加环素、黏菌素、庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢西丁、头孢他啶、泰妙菌素、壮观霉素和磷霉素。用大肠埃希菌ATCC 25922进行质控。

2 结果与分析

2.1 分离菌株HNYJ-4/2023为革兰氏阴性、两端钝圆短杆菌

将无菌采集的病死疣鼻天鹅肝脏及心脏组织，分别接种于TSA、麦康凯、BHI平板和绵羊血琼脂平板进行细菌分离，并用PCR/RT-PCR方法检测可能的鹅源病毒。结果显示，菌落呈圆形、光滑、湿润、浅灰色，直径约2 mm（图1A）。分离菌株为革兰氏阴性短杆状，两端钝圆，单个或成对排列（图1B），命名为HNYJ-4/2023。组织样品中均未检测到鹅呼肠孤病毒、鹅出血性多瘤病毒、鹅细小病毒、坦布苏病毒和禽流感病毒的核酸。

2.2 分离菌株HNYJ-4/2023为维隆气单胞菌

在MALDI-TOF MS分析中，菌株HNYJ-4/2023与维隆气单胞菌最匹配，分值为2.45。分子生物学鉴定结果进一步证实了上述结论。琼脂糖凝胶电泳结果显示，其gyrB基因扩增产物大小约为1 200 bp（图2）。该gyrB基因序列（GenBank登录号：PQ846496）与Aeromonas veronii LOID15995和A.veronii Colony111的同源性分别为98.3%和99.4%。基于gyrB序列构建的系统发育树显示，HNYJ-4/2023与维隆气单胞菌参考菌株聚于同一个进化分支（图3）。综上，通过MALDI-TOF MS和分子遗传学分析，将该分离株鉴定为维隆气单胞菌。

2.3 维隆气单胞菌HNYJ-4/2023携带6种毒力基因

气单胞菌属毒力基因检测结果表明，HNYJ-4/2023携带6种毒力基因，分别为alt、ela、lip、act、aerA和fla（图4）。

2.4 维隆气单胞菌HNYJ-4/2023感染的雏鹅多器官损伤

雏鹅感染试验结果显示，菌株HNYJ-4/2023具有强致病性。接种12 h后，雏鹅出现嗜睡、震颤及呼吸急促等临床症状。感染24 h后雏鹅出现死亡，其中两个高浓度组（1.1 × 10⁹、1.1 × 10⁸ CFU/mL）的雏鹅均在48 h内死亡，而两个较低剂量组（1.1 × 10⁷、1.1 × 10⁶ CFU/mL）的雏鹅7 d内死亡率均为0。维隆气单胞菌HNYJ-4/2023对雏鹅的LD₅₀为1.74 × 10⁷ CFU/mL（表1）。从死亡雏鹅的心脏和肝脏中成功重新分离到该菌，证实了其病原性。病理学检查显示，阴性对照组雏鹅各器官未见肉眼可见病变（图5A），感染组雏鹅的多个器官弥漫性出血（图5B）。组织病理学观察可见肺泡及间质充斥大量红细胞（图5C），局部肝细胞变性、坏死（图5D）。

2.5 维隆气单胞菌HNYJ-4/2023多重耐药

药敏试验结果显示，HNYJ-4/2023对头孢西丁（MIC为16 µg/mL）、庆大霉素（8 µg/mL）中介，对美罗培南（32 µg/mL）、氨苄青霉素（64 µg/mL）、恩诺沙星（1.25 µg/mL）和头孢他啶（16 µg/mL）耐药（表2）。

3 讨论

本研究首次从一只出现急性多器官病变的圈养疣鼻天鹅脏器中分离出维隆气单胞菌HNYJ-4/2023，证实了该菌对水禽的致死性感染，从而扩大了其已知宿主范围。这一发现进一步支持了维隆气单胞菌已成为一种宿主谱广泛的新兴人兽共患病原体的观点^{［14，21-24］}。该菌不仅可感染多种水生与陆生动物，也是人类胃肠炎、败血症等疾病的重要病原，并日益成为临床和食品安全监测中的焦点^{［5-6，10，25-27］}。

气单胞菌属细菌毒力是多种毒力因子的累积效应^［28］。在本研究中，HNYJ-4/2023菌株携带alt、act、aerA、ela、lip和fla六个关键毒力基因。这一基因谱很可能共同介导了其强烈的致病性。其中，fla编码的鞭毛不仅赋予其细菌运动能力，也与其黏附和生物膜形成有关^［29］；act抑制宿主细胞的吞噬活性并产生溶血^［30］；aerA编码的气溶素是气单胞菌属的原型溶血素，它可以在靶细胞膜上形成孔隙，导致细胞渗透裂解^［29］。这些毒力因子的协同作用，使得其对雏鹅表现出较强的侵袭力（LD₅₀为1.74 × 10⁷ CFU/mL），并在感染后引发急性、全身性病理过程，如多器官出血（图5B）、肺泡及其间质浸润大量红细胞（图5C）及肝细胞变性坏死（图5D）。因此，HNYJ-4/2023的毒力基因型与其高致病性的表型高度吻合。

从水生生物、昆虫及家禽中分离的气单胞菌与人源气单胞菌表现出相似的抗药谱^［31］，随着多重耐药气单胞菌的报道越来越多，其耐药性已成为人类日益关注的问题^{［6，11，24］}。本研究药敏试验显示，菌株HNYJ-4/2023对美罗培南、氨苄青霉素、恩诺沙星和头孢他啶等多种重要临床药物耐药。这一耐药谱与近年来从动物、环境及人类中分离的气单胞菌趋势^{［22，24，32-36］}相符。其对碳青霉烯类药物美罗培南的耐药性，构成了严峻的公共卫生挑战。碳青霉烯类药物被世界卫生组织认为在人类医学上至关重要，是危及生命感染的最后治疗药物，耐碳青霉烯类药物维隆气单胞菌的出现不仅限制了兽医和人类临床的治疗选择，更预示着“后抗生素时代”的潜在风险。此外，本菌株对第二代头孢菌素头孢西丁（MIC =16 µg/mL）表现为中介，而对第三代头孢菌素头孢他啶（MIC = 16 µg/mL）则已表现为明确的耐药。这一结果表明，该菌株可能携带针对β-内酰胺类药物的耐药机制，且对更高代别的头孢菌素具有更强的耐药性，这为合理用药带来了不确定性。

关于本病例的感染源，推测可能与圈养环境中的水或食物污染有关。游客投喂、与其他动物共用水源或接触受污染的环境均可能是潜在的传播途径。受污染的水中饲养的鱼可引起人群中维隆气单胞菌的食源性传播^{［11，14］}。此外，水禽可通过饮用受污染的水直接或间接感染耐碳青霉烯类维隆气单胞菌，并可能将其传播给人类。因此，维隆气单胞菌的食源性和水媒传播是一个值得关注的公共卫生问题。这就要求持续监测各种来源的维隆气单胞菌，并改善养殖水禽的环境卫生，以防止水污染和人类感染，减轻其对公共卫生安全的影响。

4 结论

本研究首次报道了由维隆气单胞菌引起的圈养疣鼻天鹅致死病例，分离株HNYJ-4/2023携带多重毒力基因且对包括美罗培南在内的多种抗菌药物耐药。这些发现不仅扩展了该病原体的宿主范围，更揭示了其作为兼具高致病性与多重耐药性的人兽共患病原体的潜在风险。为此，必须建立跨物种、跨环境的主动监测体系，深入研究其传播机制与耐药进化规律，为制定有效的干预策略提供科学依据，以阻断其在动物、环境与人类之间的传播链，保障公共卫生安全。

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基金资助

河南省重点学科“兽医”建设项目（序号312）

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