基于微卫星标记的藏原羚遗传多样性及亲缘关系分析

Genetic Diversity and Kinship of Procapra picticaudata Based on Microsatellite Markers

摘要

遗传多样性和亲缘关系的研究对于野生动物种群的健康维持和长久繁衍具有重要意义。为评估三江源国家公园长江源园区藏原羚（Procapra picticaudata）种群的遗传多样性，共采集24个藏原羚集群的149份新鲜粪便样本，利用MB066、HDZ8和HDZ496等8个微卫星位点进行基因分型，最终识别出105个藏原羚个体，并利用性别鉴定引物确定其中有雌性77只，雄性28只。结果表明：8个微卫星位点的平均等位基因数为21.125，平均多态信息含量（P_IC）为0.708，观测杂合度（H_o）为0.219~0.914，平均值为0.645；期望杂合度（H_e）为0.265~0.937，平均值为0.724，显示该种群处于较高的遗传多样性水平。然而，近交系数为0.103，表明种群中存在杂合子缺失的情况，暗示有近交风险的存在。此外，亲缘关系分析共鉴定出36对亲子关系，涉及57只个体。这些亲子对多数出现在同一集群内，且以母女关系为主（占62.5%），而与雄性相关的亲子对（母子/父女/父子）仅占37.5%。研究结果为长江源园区藏原羚种群的遗传多样性评估和亲缘关系分析提供了新的视角和数据支持，对于制定有效的藏原羚保护策略和措施具有重要参考价值。

Abstract

Genetic diversity and the kinship among members are crucial for the sustainable health and long-term reproductive success of wildlife populations. To evaluate the genetic diversity of Procapra picticaudata in the Yangtze River Source Area of Sanjiangyuan National Park， a total of 149 fresh fecal samples were collected from 24 Procapra picticaudata groups. These samples were analyzed using eight microsatellite loci， namely MB066， HDZ8， and HDZ496 among others. A total of 105 individual Procapra picticaudata were identified. Using gender identification primers， 77 females and 28 males were determined subsequently. The results indicated that the eight microsatellite loci exhibited an average allele number of 21.125， with an average polymorphic information content of 0.708. The observed heterozygosity （H_o） ranged from 0.219 to 0.914， averaging 0.645， while the expected heterozygosity （H_e） varied between 0.265 and 0.937， averaging 0.724. These findings suggested a high level of genetic diversity within the population. However， the inbreeding coefficient was estimated at 0.103， indicating a deficit in heterozygotes and suggesting a potential risk of inbreeding. Furthermore， this study identified 36 parent-offspring dyads involving 57 individuals through parentage testing. The majority of these dyads （62.5%） were mother-daughter pairs， while the remaining 37.5% involved male individuals （mother-son， father-daughter， and father-son relationships）. This research provided novel insights and data support for assessing genetic diversity and conducting parentage analysis of Procapra picticaudata populations in the Yangtze River Source Area. This information serves as a critical reference for developing effective conservation strategies and measures for Procapra picticaudata.

Graphical abstract

关键词

藏原羚 / 粪便DNA / 亲缘关系 / 遗传多样性

Key words

Procapra picticaudata / Fecal DNA / Kinship / Genetic diversity

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种生存与进化的基础，也是衡量种群进化潜力的关键指标之一，对于物种的健康维持和长久繁衍有重要意义^［1-2］。遗传多样性高的种群具备更强的适应能力和生存能力^［3］；相反，遗传多样性低的种群则面临更高的灭绝风险^［4］。研究表明，遗传多样性受诸多因素影响^［5-7］。例如，草原围栏导致蒙原羚（Procapra gutturosa）的栖息地被隔离和破碎化，限制了该物种种群之间的基因流动，从而使得破碎栖息地中的蒙原羚种群遗传多样性显著低于连续栖息地中的种群^［8］。在破碎化的栖息地中，即使种群间的地理位置相距较近，但缺乏有效基因交流的小种群间也可能发生不同程度的遗传分化。以普氏原羚（Procapra przewalskii）为例^［9］，青藏铁路将高密度的普氏原羚种群一分为二，阻碍了一路之隔的两个种群间的基因交流，导致出现中等程度的遗传分化，使得该物种的遗传多样性水平较低^［10］。此外，气候变化也会对野生动物的遗传多样性产生影响^［11］。利用MaxEnt模型预测2070年高排放（RCP8.5）气候变化背景下尼尔吉里塔尔羊（Nilgiritragus hylocrius）的适宜栖息地变化趋势，结果表明该物种将失去约一半的可用栖息地，同时导致尼尔吉里塔尔羊种群的遗传结构由当前的3个主要遗传簇变为1个，进而降低该物种的遗传多样性水平^［12］。

亲缘关系在解析野生动物行为演化及繁殖策略中具有重要意义。以藏羚（Pantholops hodgsonii）为例，该物种存在性别分离且具有雌性迁徙产仔习性，针对其交配群成员间的亲缘关系研究结果表明，雌性个体之间较高的亲缘关系不仅有利于提高集群的稳定性，还可能方便雌性间迁徙相关信息的交流和传递^［13］。此外，亲缘关系的研究还可解释物种的扩散行为差异。雄性狍（Capreolus pygargus）因不擅长迁移而聚集在相隔较近的区域内，相较于雌性狍拥有更近的亲缘关系，同时也说明了狍呈现偏雌性扩散的行为模式^［14］。鉴于此，亲缘关系还能揭示物种复杂的繁殖策略。通过对偏好集群的贺兰山岩羊（Pseudois nayaur）个体间亲缘关系的研究发现，其婚配制度为一雄多雌^［15］；而针对喜独居、行动隐蔽的小麂（Muntiacus reevesi）和黑麂（M.crinifrons）而言，亲缘关系的研究可推断其婚配制度均为一雄多雌^［16-17］。

藏原羚（Procapra picticaudata）是青藏高原特有物种，目前主要分布于国内的西藏、青海、四川、甘肃和新疆等地，此外，曾在印度的锡金和拉达克地区记录过数十只个体的种群^［18-19］。该物种主要栖息于海拔3 000～5 750 m的高寒草原和高寒草甸等生态系统中，以禾本科（Poaceae）、豆科（Fabaceae）及莎草科（Cyperaceae）植物为食^［20-21］。藏原羚多集群生活且存在性别分离现象，最适集群为2～8只，鲜见超过20只个体的集群，雌雄个体在非交配季节通常分开活动^{［18，22］}。以往对藏原羚的研究主要集中于地理分布、行为模式、食性组成、栖息地选择和寄生虫等方面^［23-28］，针对该物种遗传结构和多样性的研究相对较少。仅有的研究表明，藏原羚在中国境内分化为3个支系，即西藏支系、四川支系和青海-新疆支系，并表现出较高的遗传多样性水平^［29］。然而，关于藏原羚单个地理种群的遗传多样性和亲缘关系研究仍相对有限。因此，本研究采集三江源国家公园长江源园区内藏原羚种群的新鲜粪便样本，采用微卫星DNA标记技术对该物种种群开展遗传学研究，评估其集群内个体间的亲缘关系以及种群的遗传多样性现状，为未来在该区域内深入开展藏原羚种群健康状况评估和保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

三江源国家公园长江源园区位于青海省西南部（33°09′05″—36°47′53″ N，89°50′57″—95°18′51″ E），总面积约为9.03万km²，平均海拔超过4 000 m^［30］。气候寒冷干燥，年均气温-4.2～3.0 ℃，年降水量为221.5～515.0 mm^［31-32］。植被类型以高寒草甸和高寒草原为主，优势物种分别为莎草科嵩草属（Kobresia）和禾本科针茅属（Stipa）植物^{［31，33］}。区内常见野生动物包括藏原羚、藏野驴（Equus kiang）、藏羚、藏狐（Vulpes ferrilata）和喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）等^［34］。

1.2 样本采集

2022年7月和2023年4月，沿省道S224（G109国道路口至索加乡段）以及唐古拉山镇至班德湖、多尔玛村和通天河断崖的3条乡道调查，记录沿途所遇藏原羚集群。在发现集群时，使用GPS定位并记录集群规模和结构，原地等待至藏原羚群自行离开后，前往集群所在区域采集新鲜粪便样本。采样时佩戴一次性PE手套，挑选未沾染沙土的新鲜粪便颗粒置于采样袋中，袋身标注编号后以锡箔纸包裹放入液氮罐中。样本编号采用4位编码：前2位数字代表集群编号，后2位代表个体编号，如“0101”表示01号集群中的01号个体。为杜绝交叉污染，每采集完一份粪便样本后立即更换手套。

两次共收集24个藏原羚集群的149份新鲜粪便样本，其中01～11号集群采集于2022年7月，12 ~ 24号集群采集于2023年4月。集群类型包含15个雌性群（62.50%），4个雄性群（16.67%）和5个雌雄混合群（20.83%）。其中有9个集群采集的粪便样本数多于集群内动物个体数量。所有样本在带回实验室后，统一置于-20 ℃冰柜内保存。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取与检测

使用一次性刀片刮取藏原羚粪便样本表层，以获得检测样品。为避免不同个体粪便之间的DNA交叉污染，每处理完一份样本即更换新刀片。称取180～220 mg样品后，参照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，Germany）试剂盒操作说明提取DNA。采用NanoDrop 2000c微量分光光度计检测DNA样品浓度，对浓度低于10 ng/μL的样品进行重新提取^［13］，以确保DNA浓度达到后续试验要求。

1.3.2 微卫星位点的筛选和PCR扩增

通过反复试验，最终筛选出8对扩增稳定性良好的微卫星引物（表1）。所有引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，使用无菌双蒸水将引物浓度稀释至100 μmol/L，并于-20 ℃冰箱中保存备用。

PCR扩增总体系为25.0 μL，包含0.5 μL正、反引物，2.0 μL DNA模板，12.5 μL PCR mix，以及9.5 μL ddH₂O。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；循环结束后72 ℃终延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在120 V电压下电泳45 min，最后通过凝胶成像系统在紫外光下观察结果，部分结果如图1所示。

1.3.3 微卫星分型及个体识别

利用FAM和HEX荧光染料分别标记各引物的5'上游端。PCR扩增总体系为25.0 μL，其中正、反引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，dNTP（mix） 0.5 μL，Taq Buffer（含MgCl₂）2.5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH₂O18.8 μL。PCR产物用自动测序仪（ABI 3730XL）进行分型分析，并通过GeneMapper软件分析获得每个微卫星位点的等位基因片段大小。使用Excel Microsatellite ToolKit进行个体识别，识别的原则：若个体在所有微卫星位点上的基因型完全一致，或仅有一个等位基因存在差异，则判定为同一个体^［41］。

1.3.4 藏原羚性别鉴定

采用牛科（Bovidae）动物性别鉴定通用引物KY1/KY2和Y1/Y2（表2）对藏原羚个体进行性别鉴定。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，PCR反应体系与扩增程序同1.3.2节。为提高性别鉴定结果的可靠性，使用上述2对引物扩增所有藏原羚粪便DNA样品。若两次扩增结果一致，则判定为该样本的性别；若结果不一致，则进行第3次扩增，以确认样本性别。

1.4 数据分析

采用GenALEx 6进行主坐标分析（PCoA）、分子方差分析（AMOVA）以及不同软件所需数据格式的转换^［44］。使用GIMLET 1.3.3软件计算8个微卫星位点的联合个体识别率（probability of identity，P_ID），即无亲缘关系或全同胞个体之间具有相同基因型的概率^［45］。运用POPGENE计算种群的F_IS^［44］。利用CERVUS 3.0.7软件计算各位点的等位基因数（number of alleles，A）、观测杂合度（observed heterozygosity，H_o）、期望杂合度（expected heterozygosity，H_e）、多态信息含量（polymorphism information content，P_IC），以及排除概率（exclusion probability），包括已知一个亲本时的排除概率（（NE-1P）、两个亲本均未知时的排除概率（NE-2P）和亲本对的排除概率（NE-PP），并进行Hardy-Weinberg平衡检测（Hardy-Weinberg equilibrium test，HWE）。在此基础上，依次使用Simulation of Parentage Analysis和Parent pair （sexes known）模块进行亲权鉴定。由于样本的父母本信息未知，将全部识别出的雄性个体设为候选父本、雌性为候选母本，取样概率均设为1.0^［46］。IBM SPSS statistics 22.0软件的Kolmogorov-Smirnov test正态分布检验显示，集群间亲子数量与集群间距离不符合正态分布，故采用Spearman’s rank correlation test检验二者之间是否存在关联。使用KINGROUP V2计算个体间的亲缘系数（coefficient of relationship，r），取值范围在-1至1，数值越大表示亲缘关系越近，该结果作为亲权鉴定的补充^［47］。在剔除藏原羚较小规模（N < 2）的集群后，剩余19个集群的平均亲缘系数以平均值 ± 标准误（mean ± SE）表示。

2 结果

2.1 藏原羚个体识别和性别鉴定

GIMLET分析显示，当微卫星位点数达到8个时，无偏个体识别率为1.80 × 10^-10，有偏个体识别率为4.28 × 10^-10（图2），说明所使用的8个微卫星位点具有较高的联合识别分辨率。149份粪便样本中的115份在8个位点成功扩增（77.18%），共识别出105个藏原羚个体，其中包括77只雌性，28只雄性（图3）。

2.2 藏原羚种群遗传多样性及遗传结构

由表3可知，8个微卫星位点共检测到169个等位基因，平均等位基因数（A）为21.125。P_IC为0.261 ~0.928，平均为0.708；H_o为0.219～0.914，平均为0.645；H_e为0.265～0.937，平均为0.724；Shannon’s信息指数（I）为0.778～2.880，平均为2.038；F_IS为-0.070～0.289，平均为0.103。所有位点均呈现出中高程度多态性，其中BM1862和MB066两个位点呈中度多态性（0.25 ≤ P_IC < 0.50），其余位点均为高度多态性（P_IC ≥ 0.50）。无效等位基因频率在各位点均低于0.2，无需剔除任何位点。

基于基因型的PCoA分析显示，主坐标1和主坐标2分别解释了总变异的7.29%和7.09%，累计贡献率为14.38%。集群间个体相互交错，未形成明显遗传聚类（图4）。AMOVA结果进一步表明，遗传变异主要来自于集群内个体间（99%），集群间变异仅占1%。固定系数F_ST为0.014（P < 0.01），说明该种群尚未产生遗传分化。

2.3 藏原羚个体间亲权鉴定

将8个微卫星位点根据多态信息含量由高到低的顺序排列作为位点组合的依据，然后依次计算位点数目从1增加到8时的累积排除概率（表4）。结果显示，当微卫星位点数达到8个时，累积排除概率均高于99%，表明选用的8个微卫星位点适用于后续亲权鉴定分析。

由于无法获知藏原羚个体的年龄信息，难以准确判定亲代和子代关系，因此本研究将亲权鉴定结果以亲子对形式呈现（表5）。共鉴定出36组亲子对，包括7对父子、19对母女和10对母子（父女）关系。父子对的亲缘系数为0.257～0.711，平均为（0.415 ± 0.063）；母女对的亲缘系数为0.255～0.829，平均为（0.570 ± 0.033）；母子（父女）对的亲缘系数为0.329～0.695，平均为（0.446 ± 0.035）。这36对亲子对共涉及57只个体，分布于17个集群。其中16对在集群内，包括10对为母女关系（占62.5%），6对与雄性相关的亲子对（占37.5%）。跨集群的亲子对共20组，其中19号集群与21号集群之间存在4对亲子对（两集群距离约26 796 m），11号集群的1112（ ）个体与13号、14号集群均存在着亲子对关系（11号与13号集群距离约为3 044 m，与14号集群距离约为1 254 m）。Spearman相关分析表明，集群间距离与亲子对数量呈显著负相关（R = -0.09，P < 0.05），说明随着距离增大，集群间亲子对数量减少。与雄性相关的亲子对所存在的集群间的平均距离约为（28 031 ± 6 331）m，而与雌性相关的亲子对所存在的集群间的平均距离约为（7 034±3 492）m。剔除单个个体的集群后，剩余19个集群成员间平均亲缘系数为（0.132 ± 0.038）（表6）。

3 讨论与结论

3.1 藏原羚种群遗传多样性分析

遗传多样性是评估物种进化潜力及环境适应能力的关键指标，也为物种现状评估与保护提供了科学依据^［48］。遗传多样性的评估通常依赖于基因数、P_IC和杂合度等参数^［49-50］。本研究结果显示，三江源国家公园长江源园区藏原羚种群具有较高的遗传多样性水平。在8个微卫星位点中共检测到169个等位基因，平均等位基因数较高；平均P_IC为0.708，依据多态性判别标准（P_IC ≥ 0.50属高度多态），除MB066和BM1862为中度多态性位点外，其他位点均为高度多态性，其中P113位点多态性最高（P_IC = 0.928）。平均H_o为0.645，平均H_e为0.724，二者均大于0.5，进一步表明长江源园区藏原羚的遗传多样性水平较高。H_o与H_e数值较为接近，提示种群整体上处于相对健康的遗传状态。相较于西藏（H_e = 0.780，n = 13） ^［51］、可可西里（H_e = 0.799，n = 8）^［51］和青海都兰县（H_e = 0.804，n = 16）^［52］的藏原羚种群，本研究中的长江源园区藏原羚种群的遗传多样性（平均H_e = 0.724，H_o = 0.645）略低，仅高于四川种群（H_o = 0.644，n = 5）^［51］。这一差异可能与样本量（本研究n = 105，其他研究n = 5～16）及位点选择差异有关。相较于同域分布的其他有蹄类动物，长江源园区藏原羚的遗传多样性水平介于具有迁徙习性的藏羚（H_e = 0.798，n = 145）与栖息地特化的普氏原羚（H_e = 0.648，n = 258）之间。藏羚的长距离迁徙可能增强了不同集群间的基因交流，而普氏原羚因分布区仅局限于青海湖周边地区，且受到道路阻隔的影响导致小种群之间基因交流受阻，从而使其遗传多样性下降^{［9，13，53］}。

F_IS是衡量种群近亲繁殖程度的重要指标之一。当F_IS > 0时，表示群体内存在杂合子缺失的现象，这可能由近交或Wahlund效应（种群混合）引起；当F_IS < 0时，则表示杂合子过剩，通常意味着存在远交或选择优势；若F_IS = 0时，则表示种群处于哈迪-温伯格平衡下的随机交配状态^［54-55］。本研究种群平均F_IS为0.103，平均H_e略高于平均H_o，表明藏原羚种群存在轻微的杂合子缺失和低度近交。这一点在个体亲子关系中也有所体现，如1401（♀）号个体和1108（♀）号个体为母女关系，1401（♀）号个体与1112（ ）号个体为亲子关系，而同时1108（♀）又和1112（ ）存在亲子关系，3只藏原羚个体两两之间均存在亲子关系，表明藏原羚种群内存在近亲交配现象。然而，与其他有蹄类动物相比，如赛加羚羊指名亚种（Saiga tatarica tatarica）（F_IS = 0.181）^［56］、鹅喉羚（Gazella subgutturosa）（F_IS = 0.587）^［57］以及狍（F_IS = 0.247）^［58］等，藏原羚的杂合子缺失程度较低。

3.2 藏原羚集群个体间的亲缘关系

本研究所使用的8个微卫星位点，其无效等位基因频率均低于0.2，当累积位点数达到8个时，CNE-1P、CNE-2P和CNE-PP分别为0.998 9、0.999 7和0.999 9，均大于99%。因此，本研究中选用的8对微卫星引物满足亲权鉴定的要求。

本研究共识别出36对亲子关系，其中，与雄性相关的亲子对较少。在同一集群内识别出的亲子关系有16对，母女关系有10对（62.5%），显著高于与雄性相关的亲子对（37.5%）。这一结果可能与藏原羚一雄多雌的婚配制度有关。雌性个体通常承担更多的育幼职责，这使得母女之间的关系更为紧密，而藏原羚同时存在性别分离现象，雄性仅在交配季节才会与雌性混群，导致其与后代之间的联系相对松散^［59］。在不同集群间，共识别出20组亲子对。Spearman相关分析表明，跨集群亲子对的数量与所在集群间的地理距离之间呈显著负相关（P < 0.05），这一结果说明，随着集群间距离增大，集群间亲子对数量逐渐减少。这一模式可能与藏原羚并无远距离迁移的习性有关，如本研究发现的单一个例——2022年7月采集到的1108号雌性个体于次年4月在距离982 m外的18号集群被再次采集。进一步的分析表明，所有父子、母女和母子（父女）间的平均亲缘系数为（0.505 ± 0.025），其中母女间的亲缘系数最高，父子间较低，母子（父女）介于二者之间，三者的亲缘系数分别为（0.570 ± 0.033）、（0.415 ± 0.063）和（0.446 ± 0.035）。这些结果说明母女关系的亲缘程度较高，形成了相较于雄性个体组成的集群，雌性个体间存在更加稳定的集群成员间关系。

结合PCoA与AMOVA分析结果，表明长江源园区藏原羚种群未产生分化。AMOVA结果显示，种群间遗传变异贡献率仅占1%，而个体内遗传变异占比高达99%，表明在不同集群间不存在遗传隔离。PCoA结果进一步支持这一结论，两个主坐标轴累计解释率仅为14.38%，样本点呈分散分布且无显著聚类模式，反映出种群内遗传多样性高度分散，未形成显著的地理或群体结构。这种现象可能与集群间的基因流动以及局域性近亲繁殖的共同作用有关，前者有助于缓冲种群内的分化，而后者则增加了个体之间的遗传相似性。

本研究结果表明，尽管长江源园区藏原羚种群存在一定程度的杂合子缺失，但仍保持较高的遗传多样性水平，且近交程度并不显著。鉴于此，未来的研究应增加样本采集量，尤其是在产仔期和交配期等关键时期，再结合生态学和行为学观察数据，以更全面地探讨遗传多样性与亲缘关系以及个体扩散行为之间的动态变化，为藏原羚的保护与管理提供科学依据。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFF1305003)

青海省自然科学与工程技术学科带头人专项资金