岩羊、塔尔羊传染性脓疱病毒F1L和B2L基因遗传进化分析

Genetic Evolution Analysis of F1L and B2L Genes of ORFV Isolated from Blue Sheep and Himalayan Tahr

摘要

2021年11月和2023年1月，济南某动物园的岩羊（Pseudois nayaur）、塔尔羊（Hemitragus jemlahicus）先后出现口唇部丘疹、结痂及觅食困难等典型羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）感染症状。采集两种发病动物口唇结痂，提取病毒DNA后，通过PCR特异性扩增ORFV的F1L和B2L基因并进行测序。序列比对和系统进化分析显示，两毒株F1L和B2L基因相似性分别为98.7%和99.2%；进化树表明，其F1L基因与2011年中国东北地区绵羊源毒株JQ619904亲缘关系最近，B2L基因则与同来源毒株JQ619903归属同一分支。结果表明，本次动物园内岩羊和塔尔羊感染的ORFV分离株在遗传进化上与我国东北地区早期流行毒株最为接近，研究结果为ORFV的分子流行病学追踪与传播路径分析提供了新的实验依据。

Abstract

In November 2021 and January 2023， the blue sheep （Pseudois nayaur） and Himalayan tahr （Hemitragus jemlahicus） from a zoo in Jinan exhibited typical symptoms of Orf virus （ORFV） infection， including papules， scabs and difficulty foraging on their lips. Lip scabs from two infected animals were collected and viral DNA was extracted， the ORFV F1L and B2L genes were specifically amplified by PCR and sequenced respectively. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the gene similarity of F1L and B2L of the two strains was 98.7% and 99.2%， respectively. The phylogenetic tree indicated that the F1L gene was most closely related to the 2011 sheep derived strain JQ619904 in northeast China， while the B2L gene belonged to the same branch with the strain JQ619903. The results showed that the ORFV strains isolated from the blue sheep and Himalayan tahr in the zoo were most closely in genetic evolution to the early prevalent strains in northeast China. The research results provided a new experimental evidence for the molecular epidemiological tracking and transmission path analysis of ORFV.

Graphical abstract

关键词

羊传染性脓疱病毒 / F1L基因 / B2L基因 / 岩羊 / 塔尔羊 / 遗传进化

Key words

Orf virus （ORFV） / F1L gene / B2L gene / Blue sheep （Pseudois na-yaur） / Himalayan tahr （Hemitr-agus jemlahicus） / Genetic evolution

羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）属痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus），是一种在全球广泛流行的病原体。该病毒在我国20多个省份有相关报道，可引起绵羊（Ovis aries）和山羊（Capra hircus）等反刍动物的急性、接触性皮肤病变^［1-3］。ORFV具有反复感染、跨地域和跨物种传播的能力。除家养动物外，其在野生动物中也多有发现，如挪威的半驯化驯鹿（Rangifer tarandus tarandus）^［4］和麝牛（Ovibos moschatus）^［5］、美国明尼苏达州动物园的麝牛和羚牛（Budorcas taxicolor tibetana）^［6］均曾分离到该病毒。Tryland et al.^［7］研究也指出，阿拉斯加大部分地区的多种野生反刍动物均可携带ORFV。

临床上，ORFV主要侵害上皮细胞，感染后通常表现为斑丘疹、水疱性脓疱和结痂增殖性病变等阶段性皮肤症状，病变常集中于嘴唇皮肤、口腔黏膜和鼻孔周围^［8］。感染导致机体免疫力下降，易继发细菌或真菌感染。ORFV基因组的保守区域F1L和B2L基因编码病毒囊膜蛋白，是进行分子流行病学和进化分析最常用的靶基因。然而，该病毒在特定圈养野生动物群体（如岩羊Pseudois nayaur、塔尔羊Hemitragus jemlahicus）中的遗传背景与传播来源尚不明确。为此，本研究对2021—2023年济南某动物园两次ORFV疑似疫情开展病原检测，通过PCR扩增岩羊与塔尔羊毒株的F1L和B2L基因序列并进行系统进化分析，旨在阐明其遗传进化地位，追溯潜在来源，以期为动物园环境下该病毒的有效防控提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

样本源于济南某动物园两次独立的ORFV疑似疫情。2021年11月，一只成年雄性岩羊首发唇部丘疹与脓疮（图1（a）），随后同群3只亚成体及幼年岩羊相继出现类似症状。2023年1月，一只成年雄性塔尔羊出现口唇脓疮及厚痂，并伴有蹄部破溃（图1（b）），同舍个体随后出现口唇病变。分别于上述时间点，采集发病岩羊与塔尔羊口唇部结痂组织。采样时，先用无菌生理盐水轻轻冲洗患处，再用灭菌镊子取痂，样本置于1.5 mL灭菌离心管中，低温保存并及时送检。

1.2 PCR扩增与测序

将采集的口唇结痂加入适量生理盐水充分研磨后，离心取上清液，根据Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司，中国）说明书提取病毒DNA。按文献［9］的引物序列（表1）和反应条件，以提取的DNA为模板，分别对ORFV的F1L和B2L基因进行PCR特异性扩增。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 序列比对与系统发育分析

从GenBank数据库下载不同地区ORFV毒株的F1L和B2L基因序列作为参考（表2）。首先，运用DNAStar 7.1软件中的MegAlign模块，对本研究测序株与参考毒株的相应基因序列的一致性进行分析。随后，将所有序列一同导入MEGA 12软件，使用Clustal W算法进行多序列对比。基于比对结果，采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，并通过Bootstrap 法重复抽样1 000次以评估各分支节点的置信度。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

F1L和B2L基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测均为阳性，与预期片段大小相符（图2）。岩羊源毒株命名为JNR21-5，塔尔羊源毒株命名为JNT23-1。

2.2 F1L基因序列与遗传进化分析

将JNR21-5、JNT23-1毒株和已公布的来自不同地区的16株ORFV参考毒株的F1L基因序列进行比对分析，结果显示岩羊源毒株JNR21-5与塔尔羊源毒株JNT23-1的F1L基因序列相似性为98.7%，二者与中国东北地区绵羊源毒株JQ619904的序列相似性分别为98.5%和98.7%，与马来西亚毒株OP279269的相似性最低（图3）。基于F1L基因序列构建的系统进化树（图4）显示，毒株JNR21-5与JNT23-1首先聚类形成一个独立分支，表明其亲缘关系最近；该分支继而与东北地区毒株JQ619904共同构成一个更大的进化簇。

2.3 B2L基因序列和遗传进化分析

将JNR21-5、JNT23-1毒株和已公布的来自不同地区的16株ORFV毒株的B2L基因序列进行比对分析，结果显示岩羊源毒株JNR21-5与塔尔羊源毒株JNT23-1的B2L基因序列相似性最高，为99.2%，二者与印度毒株KT935589的相似性均最低；JNT23-1与中国东北地区绵羊源毒株JQ619903的相似性最高，为99.4%（图5）。遗传进化树（图6）显示，毒株JNR21-5和JNT23-1的B2L基因亲缘关系最近，聚类形成一个分支，并与东北毒株JQ619903组成一个大分支。

2.4 临床管理与治疗转归

目前，针对ORFV感染尚无特效药物，临床以对症支持治疗为主。在本案例中，首发患病的塔尔羊雄性个体于治疗初期曾尝试采用机械摘除结痂的方式进行清创，但愈合缓慢、效果不佳，最终因病灶迁延不愈而退出繁殖计划，这与Santiago et al.^［10］指出强行剥离结痂可能延长病程的结论一致。此后，对感染动物改用中西医结合的综合治疗方案，取得了良好的疗效。具体治疗方法如下：对于有明显创面的个体，使用连翘（Forsythiae fructus）、金银花（Lonicerae japonicae flos）和蒲公英（Taraxaci herba）煎剂进行局部冲洗，再涂抹碘甘油以保持创面湿润、促进愈合。对结痂破溃严重的动物，辅以抗生素肌注以预防继发性细菌感染，待结痂自动脱落，切勿人工剥离。对于症状轻微、不宜频繁保定的动物，则将五味消毒饮（含金银花、野菊花Chrysanthemi indici flos、蒲公英、紫花地丁Violae herba和天葵子Semiaquilegiae radix）煎剂拌入饲料中供其自由采食。针对孕期或哺乳期感染动物，实施单独隔离，并在中药方剂中酌减寒凉药物，增加黄芪（Astragali radix）、茯苓（Poria）等，以健脾益气、扶正固本。

经上述综合治疗后，患病动物病情均得到有效控制，结痂逐渐脱落，创口愈合良好，未见继发感染。本次治疗实践表明，基于中医辨证与西医对症支持相结合的治疗方法对于管理动物园反刍动物的ORFV感染具有积极的临床应用价值。

3 讨论与结论

ORFV具有反复感染、跨地理和跨物种传播能力^［11-12］，自1955年在我国首次报告以来，已在各地的山羊、绵羊及多种野生反刍动物中广泛流行^［13］，山东^［2］、云南^［14］和江西^［15］等多个省份均有病例报道。本研究中，2021年岩羊种群感染是该病毒在济南当地动物园中的首次暴发，2023年塔尔羊种群再次感染，但其他反刍动物尚未发现临床症状。两次感染均呈现由成年雄性先发病，且症状最重，预后时间最长，继而向同群雌性及幼龄动物传播的模式。

F1L和B2L基因作为ORFV的高度保守区域，是病毒分子流行病学和进化分析中最常用的基因之一^［16-17］。研究显示，岩羊源毒株JNR21-5与塔尔羊源毒株JNT23-1的F1L和B2L基因相似性分别高达98.7%和99.2%，进化树分析进一步证实两者亲缘关系最近，并分别与中国东北地区绵羊源毒株JQ619904（F1L）和JQ619903（B2L）处于同一进化分支。该东北毒株由Li et al.^［18］于2011年从中国东北农安县农场的绵羊中分离获得，提示本次动物园疫情毒株与我国东北地区早期流行毒株存在密切的遗传关联。

ORFV主要通过引入患病或带毒动物个体，或接触污染的笼舍、饲料和饮水等途径传播。在本次疫情发生前，园区未引进新动物，也未调换笼舍，且岩羊与塔尔羊馆舍不相邻，因此病毒通过直接动物接触传入的可能性较低。ORFV在环境中抵抗力强，可通过污染的饲料、带刺植物等间接传播^［19-20］。结合进化分析结果，病毒来源存在与输入性饲料（如牧草）相关的可能性，但尚需进一步流行病学调查证实。此外，本研究中与分离株亲缘关系最近的参考毒株宿主为绵羊，而岩羊的形态介于绵羊和山羊之间，塔尔羊则属山羊。这一发现为进一步探讨ORFV在不同羊种间的宿主适应性与跨种传播潜力提供了新的实例。Zhou et al.^［21］的研究也提示ORFV可能在绵羊和山羊中存在宿主适应性差异，未来的研究需结合更多宿主来源的毒株进行综合分析。

ORFV感染后常无法诱导持久免疫，康复动物可能长期带毒或反复感染^［22-23］，因此对圈养野生动物种群实施持续监测至关重要。在本次疫情处置中，我们采取了隔离、中西医结合治疗及严格消毒的综合措施。对患病动物，使用清热解毒中药（如连翘、金银花和蒲公英）煎剂冲洗创面并涂抹碘甘油，对严重病例辅以抗生素防止继发感染，同时避免强行剥离痂皮；对于群体防控，将扶正祛邪的中药方剂混于饲料中投喂。这些措施有效控制了病情，促进了动物康复，也为动物园环境下处理类似传染病提供了实践经验。

综上所述，本研究从分子层面揭示了圈养岩羊和塔尔羊ORFV感染株的遗传特征，确认其与我国东北早期流行毒株密切相关。结果为ORFV的分子流行病学研究补充了重要数据，并强调在野生动物圈养管理中，需建立以主动监测、风险防范（如管控饲料来源）和综合干预为核心的防控策略，以最大限度降低此类病毒在敏感种群中的传播风险。

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