湖北发现大耳菊头蝠

Rhinolophus episcopus Found in Hubei Province， China

摘要

本研究组于2013年4月在湖北省十堰市使用手抄网采集到2只菊头蝠（Rhinolophus sp.）。该种体型较小，耳相对头部较大，鼻叶发达，前臂长分别为46.15、47.77 mm；体毛短而细密，背面淡棕色，腹面米黄色；马蹄叶中部具明显缺刻，前端两侧下方各有一小附叶；鞍状叶宽大，呈舌形；连接叶起自鞍状叶背部，顶部高于鞍状叶；顶叶长，顶端呈圆形；颅骨较为扁平，颅全长分别为19.52、19.72 mm，脑颅高7.32、7.55 mm，矢状嵴不明显，额凹较浅；齿式为1.1.2.3/2.1.3.3 = 32。基于COI基因序列的系统发育分析表明，本次所获标本与大耳菊头蝠（R.episcopus）聚为一支。结合形态特征与分子数据，将其鉴定为大耳菊头蝠，为湖北省翼手目（Chiroptera）分布新纪录种。标本（标本号：FX13216、FX13221；均为雄性）现保存于广东省科学院动物研究所。

Abstract

In April 2013， two individuals of a horseshoe bat （genus Rhinolophus） were captured using hand nets in Shiyan City， Hubei Province. The specimens are small in size， with large ears relative to the head， well-developed nose leaf， and forearm lengths of 46.15 mm and 47.77 mm. They possess short and dense fur， with light brown dorsal pelage and creamy-buff ventral pelage. There is an obvious notch in the middle of the horseshoe， and a small supplementary leaf on each side of the lower front end. The sella is wide and roughly tongue-shaped. The connecting process starts from the back of the sella and is higher than the sella at the top. The lancet is long， with a rounded tip. The skull is relatively flat， greatest length of skull is 19.52 mm and 19.72 mm， and braincase height is 7.32 mm and 7.55 mm. The sagittal crest is not obvious， and the frontal depression is shallow. The dentition formula was 1.1.2.3/2.1.3.3 = 32. Phylogenetic analysis based on the COI gene sequence indicated that the captured specimens clustered with R.episcopus. Combining with morphological characters and molecular evidence， we identified them as R.episcopus， representing a new distribution record for the order Chiroptera in Hubei Province. The voucher specimens （voucher numbers： FX13216， FX13221； both males） are deposited in the Institute of Zoology， Guangdong Academy of Sciences.

Graphical abstract

关键词

大耳菊头蝠 / 翼手目 / 湖北省 / 新纪录

Key words

Rhinolophus episcopus / Chiroptera （bats） / Hubei Province / New record

大耳菊头蝠（Rhinolophus episcopus）是隶属于翼手目（Chiroptera）菊头蝠科（Rhinolophidae）菊头蝠属（Rhinolophus）的小型蝙蝠，其常栖息于洞穴及人造建筑内，目前在中国及越南有发现^［1］301。国内分布于四川、广东、广西、江西、云南、浙江、福建、湖南、重庆、贵州、陕西^［2］、河北^［3］、辽宁^［4］和山西^［5］。

本研究组于2013年4月在湖北省翼手目资源调查中，于十堰市捕获2只菊头蝠属小型蝙蝠，标本使用75%乙醇浸泡保存。根据外形及头骨特征，并结合GenBank数据库中的COI基因序列进行系统发育分析，经鉴定后确认其为大耳菊头蝠。Li et al.^［6］在湖北宜昌地区进行蝙蝠病毒调查时，有大耳菊头蝠的捕捉记录，但未报告详细的标本数据和序列信息；而魏辅文^［2］与蒋志刚^{［7］328-329}的著作均未收录该种。本次发现进一步确认了大耳菊头蝠在湖北省的分布，扩展了其在国内的已知分布范围，为该物种的保护和研究提供了基础数据，同时丰富了湖北省翼手目类群的本底资料。现将标本形态数据及系统发育分析结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集

在2013年4月对湖北省进行翼手目物种多样性调查的过程中，在十堰市房县野人洞（31°55′00″N，110°44′15″E；海拔282 m）捕获2只菊头蝠属个体。在野外拍照、称体质量后，制作成乙醇浸制标本（2 ；标本号：FX13216，FX13221）。标本现保存于广东省科学院动物研究所。本研究方案已通过广东省科学院动物研究所动物实验伦理审查（批件号：GIZ20220301）。

1.2 标本测量

参考潘清华等^［8］、杨奇森等^［9-10］的测量方法，采用电子数显卡尺（精度0.01 mm，桂林迪吉特电子有限公司，中国）对2号标本进行测量。测量指标包括9项外部形态指标（如头体长、前臂长和耳长等）和13项头骨测量指标（如颅全长、颅基长和犬枕长等）。

1.3 DNA提取与扩增

分别剪取标本FX13216、FX13221的翼膜组织约1 cm²，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。以提取的DNA为模板，使用引物COI-F（5'-CCTACTC RGCCATTTTACCTATG-3'）与COI-R（5'-ATCTCTGG GTGTCCAAAGAATCA-3'）扩增COI基因（658 bp）片段。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min，10 ℃保存产物。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将符合测序条件条带的PCR产物送至天一辉远生物科技有限公司（广州）测序，测序结果使用Seqman7.1进行裁剪后与GenBank数据库中的数据进行BLAST比对，判断该物种的类别信息。

1.4 基于COI 基因序列的系统发育分析

BLAST比对结果显示，所获序列与大耳菊头蝠的相似度最高。从GenBank数据库中下载大耳菊头蝠3个亚种及菊头蝠属其他5个物种的COI序列，并以大蹄蝠（Hipposideros armiger）及安氏小蹄蝠（H.gentilis）作为外群进行系统发育分析，用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树，自举重复（bootstrap replications）1 000次，计算节点支持度。基于K2P（Kimura 2-parameter）模型对COI基因序列进行遗传距离分析^［11］，其方差估计选用Bootstrap法，重复1 000次。

2 结果

2.1 形态学特征

本次在湖北省采集的菊头蝠属标本体型小，前臂长分别为46.15、47.77 mm（表1），耳相对头部较大，对耳屏相对较小；马蹄叶宽且中部存在明显缺刻，覆盖上唇，前方两侧下方各有一小附叶；下唇具3条沟；鞍状叶宽大，鞍长，宽而圆，大致呈舌状，基部扩大形成杯状叶；联接叶起自鞍状叶背面亚顶端上方，呈圆弧形，顶部高于鞍状叶；顶叶高度稍低于联接叶与鞍状叶，顶端呈舌形（图1A、B）。毛短而细密，背面淡棕色，腹面米黄色（图1A、B）。尾尖稍伸出尾膜外。头骨狭长，颅全长分别为19.52、19.72 mm，脑颅高分别为7.32、7.55 mm（表2）。矢状嵴不明显，鼻隆高似半圆形，前额部中央有凹陷（图1D、G）。齿式为1.1.2.3/2.1.3.3 = 32。上门齿小，上犬齿无附尖，第二上前臼齿极度退化，但未偏离齿列线；第三上后臼齿相对第一、第二上后臼齿较小（图1C）。下门齿齿冠分叶明显，第二下前臼齿小，下臼齿齿冠呈“W”形，且大小由第一至第三下后臼齿依次减小（图1C、G）。

2.2 系统发育分析

由于标本保存时间较长，仅成功从一份标本（FX13216）中扩增出COI序列。基于该序列构建的系统发育树（图2）显示：湖北标本与GenBank数据库中的大耳菊头蝠序列聚为一支（支持率99%）。遗传距离分析进一步表明：本研究标本与大耳菊头蝠指名亚种（河北和辽宁）的序列遗传距离最近，近乎为0，与大耳菊头蝠未命名亚种（云南）和福建亚种（湖南）的遗传距离分别为2.95%、3.31%，但与清迈菊头蝠（广东）的遗传距离仅为2.24%。相比之下，本研究标本与菊头蝠属其他物种的遗传距离为13.29%～16.95%，与外群安氏小蹄蝠和大蹄蝠的遗传距离分别高达18.85%、20.07%（表3）。

3 讨论

菊头蝠属在全球共有109种^［1］260，中国境内目前已记录20种^［14］。大耳菊头蝠由Allen^［15］首次报道，其标本采集于四川和福建，主要鉴别特征为具较大的耳及舌形鞍状叶。Allen^［15］同时指出，所捕获的个体有两种表型，在体型上有明显差异，其中大体型的个体为指名亚种（Rhinolophus episcopus episcopus），小体型的个体为福建亚种（R.e.caldwelli）。R.macrotis于1840年在尼泊尔被发现^［16］，其同样具有较大的耳及舌形鞍状叶。由于当时分类学的不完善，分类学家将所有具有相似特征的菊头蝠均归入R.macrotis种下。由于大耳菊头蝠和R.macrotis具有相似的特征^{［1］300-301}，在此后的分类中其也被归入该种，作为亚种R.m.episcopus或R.m.caldwelli^［17］。在这种分类方法下，随着越来越多的具有这一特征的菊头蝠被发现，R.macrotis的亚种数目逐渐增多。Tate^［17］统计菲律宾种组时，该种已包含6个亚种：指名亚种（R.m.macrotis）、印尼亚种（R.m.dohrni）、四川亚种（R.m.episcopus）、福建亚种（R.m.caldwelli）、清迈亚种（R.m.siamensis）和菲律宾亚种（R.m.hirsutus）。此后，Csorba et al.^［18-19］又将巴基斯坦亚种（R.m.topali）归入，并在后期将其修订为R.m.topalius^［20］。由于清迈亚种与R.macrotis在体型、鼻叶形态和超声峰值频率等方面存在明显差异，分类学家建议将其划分为独立种^［21-22］，Duckworth et al.^［21］ 将其暂定名为R.siamensis。此后，进一步研究发现，尽管该亚种与R.macrotis广泛共栖，但未观察到无杂现象，支持其作为独立物种的地位。Wilson et al.^{［1］301-302}正式将其命名为R.siamensis，即清迈菊头蝠。同年，Liu et al.^［12］发现大耳菊头蝠与尼泊尔的R.macrotis在线粒体Cyt b上的遗传差异（3.83%～4.23%）高于大耳菊头蝠种内差异的水平（0.83%～3.43%），因此恢复其种级地位，并根据表型和遗传特征划分为3个亚种，分别为指名亚种（R.episcopus episcopus，大体型）、福建亚种（R.e.caldwelli，小体型）和一未命名亚种（R.e.ssp.，小体型）。在R.episcopus种级地位恢复后^{［1］301，［12］}，刘彤^［23］根据其模式产地四川万县（今重庆万州）将其中文名暂拟为万州菊头蝠，后经魏辅文等^［24］审定，最终确定其中文名为大耳菊头蝠。

中越地区的大耳菊头蝠及其近缘种在表型和分子特征上具有诸多相似性，致使在早期的研究中对这些物种的鉴定常出现混淆^{［12，25-31］}，学界曾将其统称为“R.macrotis物种复合体”（R.macrotis complex）^{［12，25-26］}。直到2019年，Liu et al.^［12］结合不同遗传模式的传统遗传标记、基因组水平SNPs以及多种形态和声波参数发现，中越地区的“R.macrotis物种复合体”实际上包含大耳菊头蝠、清迈菊头蝠和丽江菊头蝠（R.osgoodi）3个独立的近缘种。Liu et al.^［12］认为，该复合体内各物种的线粒体基因分歧水平较低可能是杂交和基因渗入导致，再加上大耳菊头蝠福建亚种和未命名亚种在形态上与清迈菊头蝠相似，这也导致在以前的一些研究中鉴定错误。

本次在湖北采集的大耳菊头蝠标本，其外部形态与清迈菊头蝠和丽江菊头蝠有明显区别：第一，在量度特征上，本研究标本的前臂长、颅全长均大于丽江菊头蝠和清迈菊头蝠，且耳明显大于丽江菊头蝠（表1，表2）；第二，在鼻叶结构上，丽江菊头蝠鼻叶无小附叶^［1］301，而本研究标本明显具备该结构（图1B）；第三，在牙齿特征上，清迈菊头蝠的第二上前臼齿较大^［1］302，而本研究标本的则极度退化；第四，在鞍状叶形态上，大耳菊头蝠的鞍状叶呈舌状^{［1］301，［19］}，而清迈菊头蝠鞍状叶非舌形^［28］。基于上述差异，大耳菊头蝠与清迈菊头蝠、丽江菊头蝠能够予以区分。

大耳菊头蝠分布于中国和越南，常栖于洞穴及矿井中^［1］301，亦见于人造建筑^［7］328。该物种的3个亚种在中国均有分布。其中，指名亚种模式产地为四川万县（今重庆万州），分布于广东、江西、湖南、贵州、陕西、四川、重庆、河北和辽宁；福建亚种模式产地位于福建，在贵州、云南、福建、江西、浙江、广东、广西和湖南有分布；未命名亚种在云南和越南有分布^［1］301。本次在湖北采集的菊头蝠标本形态特征与已报道的大耳菊头蝠基本相符，其前臂长46.15、47.77 mm及颅全长19.52、19.72 mm等参数与文献中大耳菊头蝠指名亚种^{［1］301，［3-5，12］}相近，其COI基因序列也与该指名亚种表现出极高的亲缘关系，因此鉴定湖北标本属于大耳菊头蝠。

湖北省曾记录有翼手目4科23种，其中菊头蝠科有6个种^［32］。本次发现的大耳菊头蝠使该省菊头蝠科的物种数增至7种。本研究的捕获点为天然溶洞，洞内有水流，大耳菊头蝠种群数量较小，与大耳菊头蝠共栖的还有中华菊头蝠（R.sinicus）及尼泊尔鼠耳蝠（Myotis nipalensis）。本次在湖北记录到大耳菊头蝠，不仅丰富了湖北省翼手目的本底资源数据，也为后续该物种分化历程的研究和保护提供了基础数据。

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基金资助

国家科技基础资源调查专项项目课题(2021FY100303)