基于ND2基因的西北地区密点麻蜥系统发育分析

Phylogenetic Analysis of Eremias multiocellata in Northwest China Based on the ND2 Gene

摘要

密点麻蜥（Eremias multiocellata）是中亚干旱生态系统的代表性蜥蜴，在我国北方及西北地区分布广泛，对维持荒漠生态系统结构与功能稳定具有重要作用。本研究以中国西北4个地理区域（内蒙古、宁夏、甘肃和新疆）的112份样本为研究对象，基于线粒体ND2基因序列，分析其遗传多样性、系统发育关系及遗传分化格局。结果显示：ND2基因序列A + T平均含量达60.7%，具有AT偏倚性；共检测到58个单倍型，单倍型多样性（H_d）为0.759～0.941，核苷酸多样性（π）为0.041～0.070，总体遗传多样性水平较高（H_d = 0.969，π = 0.072）。系统发育分析显示，密点麻蜥分化为两大跨区域演化支系，单倍型分布混杂，未形成与地理区域严格对应的单系结构；共检测到6个跨群体共享单倍型。遗传分化分析表明，群体间总体F_ST达0.510 89，存在较高的遗传分化，其中新疆群体与宁夏、内蒙古群体间的分化程度相对较高。中性检验与错配分布分析表明，甘肃、内蒙古和宁夏群体在演化历史上种群规模相对稳定，未经历显著的群体扩张事件，新疆群体存在历史扩张的生物学信号，但未达到统计学显著水平。研究结果可为西北地区密点麻蜥的保护策略制定提供科学依据。

Abstract

Eremias multiocellata is a representative lizard species of the arid ecosystems in Central Asia， widely distributed across northern and northwestern China and contributing significantly to the structural and functional stability of desert ecosystems. In this study， we analyzed 112 individuals from four geographic regions in northwestern China （Inner Mongolia， Ningxia， Gansu and Xinjiang） using mitochondrial ND2 sequences to assess genetic diversity， phylogenetic structure and population differentiation. The ND2 sequences showed an average A + T content of 60.7%， indicating a notable AT bias. A total of 58 haplotypes were identified. Intrapopulation haplotype diversity （H_d） ranged from 0.759 to 0.941， and nucleotide diversity （π） ranged from 0.041 to 0.070. Overall genetic diversity across all populations was relatively high （H_d = 0.969， π = 0.072）. Phylogenetic analysis resolved two cross-regional lineages， with haplotypes showing a mixed geographic distribution and failing to form geographically monophyletic clades. Six haplotypes were shared among populations. Genetic differentiation analysis revealed a high overall level of population differentiation （F_ST = 0.510 89）， with relatively strong differentiation between the Xinjiang population and the Ningxia and Inner Mongolia populations. Neutrality tests and mismatch distribution analyses indicated that most populations have remained relatively stable demographically， with no evidence of significant population expansion； however， the Xinjiang population showed signs of historical expansion， although there were not statistically significant. These findings provide a valuable genetic basis for understanding the population structure of E.multiocellata in northwestern China and for informing regionally tailored conservation strategies.

Graphical abstract

关键词

密点麻蜥 / ND2基因 / 遗传多样性 / 遗传分化 / 系统发育 / 西北地区

Key words

Eremias multiocellata / ND2 gene / Genetic diversity / Genetic differentiation / Phylogeny / Northwest China

中国西北地区以其独特的地理位置和复杂的气候条件塑造了极其脆弱的荒漠生态系统^［1-2］。荒漠化是该区域最突出的生态问题，影响范围广、风险等级高，在全球气候变化与人为活动加剧的双重胁迫下，区域生态退化加速，生物多样性保护压力持续增大^［3-5］。尽管环境条件严苛，西北地区仍孕育了大量特化生物类群，诸多物种通过长期进化形成了独特的适应策略，维系了荒漠生态系统的稳定与平衡^［6］。

爬行动物是荒漠生态系统的优势类群，它们通过优化温度调节、水分平衡和运动相关的形态生理特征，成功适应了干旱环境并得以生存^［7-8］。但近年来栖息地破碎化^［9］、气候变暖和环境污染^［10］等因素导致全球爬行动物生存危机加剧。目前，爬行动物已成为陆生脊椎动物中受威胁程度和灭绝风险最高的类群之一，已有超过21%的物种被列为受威胁物种^［11-16］。我国爬行纲（Reptilia）物种约占全球总量的5%，在世界范围内排名第八^［17］，但同时其正经历种群数量快速下降和物种灭绝的危机。对1950—2000年物种分布情况的对比研究发现，中国县级重点保护的两栖爬行动物物种数量平均下降了28.8%^［18-19］。根据2023年生态环境部和中国科学院发布的《中国生物多样性红色名录——脊椎动物卷（2020）》，我国爬行类共517种，其中被评估为极危（CR）、濒危（EN）和易危（VU）的物种共159种，占爬行纲总数的30.75%^［20］。

密点麻蜥（Eremias multiocellata）是中亚干旱生态系统的代表性蜥蜴，在我国北方及西北地区分布广泛。该物种广谱食性可有效控制农林害虫，在半荒漠与荒漠草原生态系统稳定性维持中扮演着重要的调控角色^［21-22］，已于2023年被列入《有重要生态、科学、社会价值的陆生野生动物名录》^［23］。目前关于密点麻蜥的研究多集中于药用价值^［24-26］、食性^［22］、生理代谢^［27-28］及形态学^［29］等方面。但密点麻蜥在分类学上存在诸多复杂性与争议，其所在的密点麻蜥复合体物种界定模糊，种内形态变异复杂，且与近缘种形态相似，仅依据鳞片排列、体表斑纹模式等传统形态学指标难以实现亚种的准确划分^［30］。中国西北地区复杂的地形地貌（如不断扩张的戈壁沙漠）可能通过地理隔离驱动密点麻蜥群体分化，但这一重要假说仍缺乏充分的遗传学证据支持^［31］。

线粒体基因具有高突变率和严格的母系遗传特性，已成为解析种内分化格局及近缘种系统发育关系的常用分子标记，其中NADH脱氢酶第二亚基（NADH dehydrogenase subunit 2，ND2）基因在蜥蜴类线粒体基因组中进化速率较快、核苷酸变异水平较高，已被证实是解决麻蜥属（Eremias）复合体物种分类难题的有效分子标记^［32-34］。此外，ND2基因在公共数据库中序列资源丰富，便于与已有研究进行比较分析。

遗传多样性是物种进化潜力与环境适应能力的基础，其水平直接影响群体应对环境变化和长期存续的能力^［35］。已有研究从形态分化、环境适应、近缘种关系及线粒体基因系统发育等方面探讨了密点麻蜥及相关麻蜥类群的演化特征^［36-38］。针对西北部分地区密点麻蜥的研究显示，不同地理群体间虽存在一定基因流，但该研究样本量较小，尚未系统评估其遗传多样性水平和群体分化格局^［39］。因此，有必要扩大采样范围和样本量，结合群体遗传学指标进一步解析西北地区密点麻蜥的遗传结构及其演化历史。

鉴于密点麻蜥在西北地区生态系统中发挥的关键生态功能，深入探究其遗传多样性现状、群体结构及分化格局具有突出的紧迫性和重要的科学价值。本研究选取线粒体ND2基因作为分子标记，对采自宁夏、内蒙古、甘肃和新疆4个关键地理区域的密点麻蜥群体开展测序分析。通过整合系统发育分析、单倍型网络构建及遗传距离计算等多种研究方法，本研究明确了密点麻蜥的群体遗传多样性水平及分化格局，以期为西北地区密点麻蜥保护策略的制定及资源的可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究共采集密点麻蜥112只（研究方案已通过西北民族大学动物实验伦理委员会审查，批件号：xbmu-sm-2018050），分别来自内蒙古（29只）、宁夏（46只）、甘肃（20只）及新疆（17只）。采集后，测量其体长、尾长和头长等形态学指标，并于尾部后端切取约5 mm²的组织样本，置于保存液［V（无水乙醇）∶V（生理盐水）=1∶1］中，-20 ℃保存备用。各样本的详细采集信息（包括具体采样点及编号）见图1和附录A。

1.2 DNA提取与检测

使用长沙艾科瑞生物科技有限公司的SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒，提取密点麻蜥全基因组DNA。提取产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，将检测合格的基因组DNA样品于-20 ℃保存，并用于后续PCR扩增的模板。

1.3 PCR扩增及测序

基于麻蜥属线粒体基因组保守区（GenBank登录号：MZ516517.1），采用Primer Premier 5.0软件^［40］设计ND2基因特异性扩增引物，引物序列为ND2-F：5'-TAATCATCACCGCCACCAGC-3'，ND2-R：5'-AGG GGGCAATTAGTGGTAGT-3'。PCR反应体系总体积为25.0 μL，包含5 mmol/L上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL Premix Taq酶12.5 μL，基因组DNA模板2.0 μL，无菌超纯水补足。PCR扩增程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55.1 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；最后72 ℃终延伸10 min。扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，合格产物送至奥科生物科技有限公司（陕西杨凌）进行双向测序。

1.4 数据处理与分析

原始测序数据（AB1格式）经Geneious Prime 2023.1.1（https：//www.geneious.com/）进行序列质量评估与剪接处理，以密点麻蜥ND2基因参考序列为参照进行比对，对所有样本统一截取一致性较高的保守区域，并纳入遗传多样性和系统发育分析。

通过MEGA-X^［41］对ND2基因序列的碱基组成进行统计分析，使用DnaSP 6.10^［42］对群体遗传多样性进行量化分析，包括各群体的单倍型数量、变异位点数、单倍型多样性（haplotype diversity，H_d）、核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异（K），并将所有个体序列转换为单倍型格式，按内蒙古、宁夏、甘肃和新疆4个地理群体分组。群体遗传距离及遗传分化系数（F_ST）通过Arlequin 3.11^［43］计算，以评估遗传分化水平，并进行分子方差分析（AMOVA），解析群体遗传结构及变异来源。在系统发育分析中，从GenBank下载42条密点麻蜥ND2序列，并选取8条近缘麻蜥物种序列作为外群（表1）。基于BIC（Bayesian information criterion）准则，使用ModelFinder 2.2.2^［44］筛选最优核苷酸替代模型。在此基础上，分别应用贝叶斯推断（Bayesian inference，BI）与最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。BI分析在MrBayes 3.2^［45］中完成，对密码子第1、2位点采用GTR + F + I + G4模型，对第3位点采用GTR + F + G4模型；马尔可夫链运行5 000 000代，每100代采样1次，弃除前25%的老化样本，最终通过后验概率（posterior probability，PP）评估节点的支持度。ML分析在IQ-TREE 2.2.2^［46］中执行，对密码子第1、2位点选用GTR + F + R2模型，对第3位点选用GTR + F + I + G4模型，采用1 000次自举重复（bootstrap，BP）检验分支可信度。使用Popart v1.7软件^［47-49］，采用中介法（median-joining method，MJ）构建单倍型网络，直观展示单倍型间亲缘关系及其地理分布格局。群体历史动态通过Arlequin 3.11进行Tajima’s D和Fu’s F_S中性检验及核苷酸错配分布分析，所有检验均以P < 0.05为统计显著性阈值。

2 结果

2.1 线粒体ND2基因序列的碱基组成及变异特征

以GenBank中密点麻蜥线粒体ND2基因序列（登录号：MZ516517.1）为参考，通过Geneious Prime软件对112条样本测序原始序列进行质量校正、比对和剪切筛选，最终获得785 bp的ND2基因有效序列。基于MEGA-X的Statistics功能及DnaSP 6.10软件统计分析结果显示，碱基A、T、C、G平均含量分别为29.5%、31.2%、8.7%和30.6%，A + T总含量（60.7%）显著高于G + C含量（39.3%），呈现明显的AT碱基偏倚。全序列共检测出102个变异位点，其中单一变异位点18个，简约信息位点84个。

2.2 密点麻蜥群体遗传多样性分析

基于线粒体ND2基因序列分析，共鉴定出58个单倍型（由于存在跨群体共享单倍型，各地理群体单倍型数量之和为64）。4个地理群体的遗传多样性参数统计结果（表2）显示，H_d为0.759～0.941，其中新疆、内蒙古和宁夏群体分别达到0.941、0.926和0.919，均表现出较高的单倍型丰度特征；π为0.041 ~0.070，甘肃群体（0.070）高于其他地理群体。K以甘肃群体最大（54.410），新疆、宁夏和内蒙古群体依次为40.169、39.714和32.148。从总体水平看，密点麻蜥群体的H_d为0.969，π为0.072，K为55.502，表现出较高的遗传多样性水平。

2.3 密点麻蜥群体间的遗传距离和遗传分化

通过对线粒体ND2基因序列的遗传距离分析发现（表3），群体间两两遗传距离为0.056 67～0.109 38，其中，新疆群体与内蒙古、宁夏群体间遗传距离相对较大，分别为0.109 38、0.104 59。群体内遗传距离为0.018 31～0.084 72，其中新疆群体最小（0.018 31），甘肃群体最大（0.084 72）。

F_ST分析结果表明（表3），群体间F_ST为0.318 72 ~0.720 76。其中，新疆与宁夏群体间F_ST最高（0.720 76），新疆与内蒙古群体间次之（0.686 41），表明新疆群体与这两个群体间存在较高遗传分化。相比之下，宁夏与内蒙古群体间F_ST最低，仅为0.318 72，说明二者遗传分化程度相对较低。为进一步探讨遗传变异和进化关系，基于ND2基因序列进行了AMOVA，结果显示：群体间遗传变异占总变异的51.09%，群体内遗传变异占48.91%，二者比例相近，表明该物种遗传结构同时受群体间分化与群体内遗传变异的影响。总体F_ST为0.510 89，说明该物种总体遗传分化程度较高（表4）。

2.4 ND2基因系统进化树分析

基于线粒体ND2基因序列，分别采用贝叶斯推断法（BI，图2）和最大似然法（ML，图3）构建系统发育树。两种方法所得拓扑结构总体一致，外群序列与密点麻蜥主体分支明显分离；本研究序列与GenBank中密点麻蜥参考序列共同归入进化树主体分支，表明其系统发育归属明确。

密点麻蜥主体类群分化为支系A、支系B两大跨区域演化支系。支系A以新疆塔里木盆地南缘群体（民丰、和田、叶城）和甘肃河西走廊区域种群（盐池湾、金昌、马繁山等）为主体，支系中零散嵌入少量宁夏（甘塘、沙坡头）和内蒙古（鄂前旗、乌审旗）个体，呈现跨省（区）混杂聚类特征；支系B占据进化树主体范围，优势类群为宁夏（陶乐、沙坡头、甘塘）和内蒙古（鄂前旗、乌审旗、乌前旗、二连浩特）群体，支系内零星分布甘肃个体（张掖东大山），新疆塔什库尔干个体M349也聚类于该分支中，未与其同区域多数新疆样本一同归入支系A。两个支系内部均未形成与单一省（区）或具体采样点严格对应的地理单系结构。

2.5 群体间单倍型组成与分布

在4个地理种群样本中共检测出58个单倍型，其中52个为特有单倍型，6个为跨群体共享单倍型。单倍型网络拓扑结构显示，所有单倍型可明确划分为两大进化分支。一支以新疆单倍型为主体，少量甘肃单倍型穿插分布；另一支由宁夏、内蒙古单倍型构成主体，零散镶嵌部分甘肃单倍型。共享单倍型存在明确跨区域分布模式，Hap3、Hap8和Hap9为内蒙古和宁夏群体共享，Hap14、Hap40为宁夏和甘肃群体共享，Hap18为宁夏和新疆群体共享，提示不同地理群体间可能存在历史母系基因交流，也可能与祖先多态保留或不完全谱系分选有关（图4）。

2.6 群体历史动态分析

中性检验结果显示（表5），Tajima’s D在所有群体中均为负值，且均未达到显著水平（P > 0.05）；Fu’s F_S在不同群体间呈现差异，甘肃（6.806）和内蒙古（2.994）群体为正值，宁夏（-1.493）和新疆（-1.040）群体为负值，但均未达到显著水平（P > 0.05）。核苷酸错配分布分析显示（图5），甘肃、内蒙古和宁夏群体的观测错配频率呈不规则多峰锯齿分布，无扩张特征的光滑单峰；新疆群体观测值则在低核苷酸差异区间形成优势宽主峰，仅附带一处低矮次级峰，整体趋近单峰分布，且其Tajima’s D（-2.217 61）为较大负值，提示该群体可能存在群体历史扩张的生物学信号，但中性检验未达显著水平。将所有样本作为整体进行分析时，Tajima’s D和Fu’s F_S分别为-0.593 70和1.512，同样未达到显著水平。综合上述结果，西北地区密点麻蜥整体未检测到跨地理群体一致的大范围扩张；甘肃、内蒙古和宁夏群体历史种群规模整体保持稳定；新疆虽无统计学层面的显著扩张证据，但遗传参数与错配图谱共同暗示其存在历史扩张趋势，后续需扩大样本量进一步验证。

3 讨论与结论

3.1 ND2 序列特征及其群体遗传分析的适用性

本研究对中国西北4个地理群体的密点麻蜥线粒体ND2基因序列开展遗传多样性分析，共获得785 bp的有效序列。碱基组成分析发现，A + T碱基含量为60.7%，G + C含量为39.3%，表现出明显的AT碱基偏倚性。该结果与韩晨等^［55］的研究结论相似，且与多数脊椎动物线粒体基因的编码模式高度契合，如鹌鹑（Coturnix japonica）^［56］、龙头鱼（Harpadon nehereus）^［57］、少鳞鱚（Sillago japonica）^［58］、崖沙燕（Riparia riparia）^［59］和攀鲈（Anabas testudineus）^［60］等。线粒体基因组高A + T含量通常与高突变率和快速进化相关^［61］，这可能增强了密点麻蜥对多变荒漠环境的适应能力，使其在长期进化过程中维持了较高的遗传多样性水平。本研究共检测到102个变异位点，其中简约信息位点84个，占变异位点总数的82.35%，表明ND2基因在密点麻蜥种内具有较高的遗传变异水平，适宜作为群体遗传学和系统发育研究的分子标记。

3.2 西北地区密点麻蜥群体遗传多样性的形成因素

遗传多样性是构成生物进化与生态适应性的基础，其丰富程度与物种应对环境变迁的能力呈正相关，进而保障群体的长期存续^［62］。作为群体遗传学分析的关键参数，线粒体DNA的π与H_d共同揭示群体的遗传特征与分化水平，为解析物种进化历程提供重要依据，在生物遗传结构研究领域具有广泛应用价值^［63-64］。Grant et al.^［65］指出，以H_d阈值为0.5和π > 0.005作为高遗传多样性的判断标准，数值越高意味着群体遗传多样性越高。K反映样本序列间平均差异程度，在序列长度一致的情况下，数值越大，说明群体内样本间累积的核苷酸差异越多，也指示该群体具有较丰富的遗传多样性^［66-67］。

在本研究中，密点麻蜥4个地理群体的H_d为0.759～0.941，π为0.041～0.070，这一数据显示其遗传多样性处于较高水平。其中，甘肃群体的H_d（0.759）为四者中最低，但其π（0.070）和K = 54.410均高于其他群体，说明该群体累积了较大的核苷酸差异，提示甘肃群体内线粒体遗传变异水平较高，并可能存在较深的母系谱系分化。新疆群体呈现高H_d（0.941）与高π（0.057）的组合模式，表明其单倍型组成丰富，且群体内保留了较高水平的序列变异。整体而言，4个密点麻蜥群体均呈现高水平的遗传多样性，说明该物种在西北地区具有较丰富的群体内遗传变异。

3.3 遗传分化与母系谱系结构的区域格局

遗传距离和F_ST是衡量群体间遗传分化程度的重要指标^［68-69］。本研究中，密点麻蜥群体间遗传距离为0.056 67～0.109 38，群体间F_ST为0.318 72 ~0.720 76，总体达0.510 89，显示出高度的遗传分化水平。其中，新疆群体与宁夏、内蒙古群体间的遗传距离和F_ST值均较高，表明新疆群体与其他群体间存在较强的遗传隔离；而宁夏与内蒙古群体间的F_ST最低（0.318 72），遗传距离也最小（0.056 67），表明二者亲缘关系较近，可能存在较频繁的历史基因交流。AMOVA分析结果显示，群体间遗传变异占总变异的51.09%，群体内遗传变异占48.91%，在群体内部和群体间均有分子变异发生。

系统发育分析从母系谱系层面进一步揭示了该群体遗传结构的复杂性。BI树和ML树在主要拓扑结构上总体一致，密点麻蜥群体并未严格按照单一地理来源聚类，而是形成了跨区域组成的支系A和支系B。其中，支系A主要由新疆群体和甘肃部分群体组成，同时包含少量宁夏和内蒙古个体；支系B则以宁夏和内蒙古群体为主，并嵌套了少量甘肃个体及新疆塔什库尔干的个体（M349）。两个支系均未形成与省（区）或采样点完全对应的独立地理单系结构，说明ND2母系谱系关系与现有地理采样格局并非完全一致。

综合群体遗传分化和系统发育分析结果可见，西北地区密点麻蜥群体已形成较明显的遗传分化，但其母系谱系并未严格按照现有地理区域分化为对应的单系结构。宁夏与内蒙古群体遗传差异相对较小，并在系统发育树中构成支系B的主体；新疆群体与宁夏、内蒙古群体间分化较高，但未形成完全独立的地理单系。该格局提示，密点麻蜥的区域遗传结构可能受到历史地理隔离、母系谱系保留、不完全谱系分选及局部历史基因交流等多重过程共同影响。

3.4 密点麻蜥群体动态的区域差异

在群体遗传学研究领域，核苷酸错配分布分析与中性检验（Tajima’s D和Fu’s F_S）是解析群体历史动态的核心工具^［70-71］。若Tajima’s D为显著负值且核苷酸错配分布呈单峰曲线，提示群体经历过扩张；反之，若错配分布曲线呈双峰或多峰形态，则表明群体状态历史相对稳定，未经历显著扩张。本研究中，甘肃、内蒙古和宁夏群体的Tajima’s D均为负值但未达到显著水平，Fu’s F_S未显示一致的显著负偏离，错配分布呈不规则多峰或锯齿状，表明这3个群体在历史上未经历显著的群体扩张事件，种群规模整体保持相对稳定。与上述群体相比，新疆群体的Tajima’s D为-2.217 61，负偏离幅度较大，Fu’s F_S亦为负值，提示其母系谱系中可能存在低频变异积累；其错配分布在低核苷酸差异区间形成优势宽主峰，仅伴有一处低矮次级峰，形态上趋近单峰分布。综合来看，新疆群体可能存在历史扩张相关的生物学信号。干旱中亚荒漠蜥蜴的历史动态研究表明，更新世气候波动和荒漠生境演变可能影响区域类群的谱系扩张过程^［72-73］。考虑到新疆群体样本量相对有限，且Tajima’s D和Fu’s F_S均未达到统计学显著水平，该结果仍应限定为扩张相关的提示性证据。在物种整体水平上，总体Tajima’s D和Fu’s F_S均不显著，错配分布也未呈现单峰扩张特征，说明西北地区密点麻蜥整体上未发生跨地理分区的一致性大范围种群扩张。这一结论对于理解该物种在中亚干旱生态系统中的进化历程具有重要意义。密点麻蜥群体在历史上长期保持相对稳定的种群规模，可能与其对荒漠环境的特殊适应策略有关，也可能反映了该区域环境波动尚未达到驱动物种大范围扩张的阈值。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(32060311)

中共甘肃省委组织部省级人才项目(51202506)

兰州市城关区科技计划项目(2023RCCX0002)

中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920240109)

中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920260094)

中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920260131)

西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划项目(202510742009)