异吲哚啉酮类ERK抑制剂的设计、合成及初步生物活性研究

Design， Synthesis and Biological Evaluation of ERK Inhibitors with Isoindolin-1-one Structure

摘要

以ERK抑制剂EK-I-22和MK-8353为先导化合物, 利用药效团融合策略, 设计合成了14个异吲哚啉酮类目标化合物. 初步的药理活性测试结果显示, 化合物19a(IC₅₀=16 nmol/L), 19b(IC₅₀=15 nmol/L), 19e(IC₅₀= 20 nmol/L), 27a(IC₅₀=19 nmol/L)和27b(IC₅₀=56 nmol/L)对ERK2激酶具有较好的抑制活性, 其中化合物27b对 4种人肿瘤细胞(Colo-205, A375, A2058和HT-29)均具有一定的抑制活性.

Abstract

Using the ERK inhibitor EK-I-22 and MK-8353 as the lead compounds， 14 compounds were designed and synthesized by pharmacophore fusion strategy. Preliminary pharmacological activity assessments revealed that compounds 19a（IC₅₀=16 nmol/L）， 19b（IC₅₀=15 nmol/L）， 19e（IC₅₀=20 nmol/L）， 27a（IC₅₀=19 nmol/L） and 27b（IC₅₀=56 nmol/L） exhibited significant inhibitory activity against ERK2 kinase. Notably， compound 27b demonstrated moderate inhibitory effects against four human tumor cell lines（Colo-205， A375， A2058 and HT-29）.

Graphical abstract

关键词

MAPK信号通路 / ERK抑制剂 / 合成 / 抗肿瘤活性

Key words

MAPK pathway / ERK inhibitors / Synthesis / Antitumor activity

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases， MAPKs）信号转导通路是将细胞表面信号转导至细胞核的重要信号通路， 该通路通过影响动物细胞内基因的转录和调控， 从而引起细胞增殖、 分化、 转化及凋亡等生物学反应^［1，2］. 在已发现的5条MAPKs信号通路中， RAS-RAF-MEK-ERK信号转导通路（ERK通路）是负责放大和调控有丝分裂信号的蛋白激酶级联反应通路， 其可被多种有丝分裂原或其它细胞外来源（如生长因子、 胰岛素、 渗透压和细胞因子等）激活^［3，4］. RAS-RAF-MEK-ERK级联信号转导通路在多种肿瘤细胞中处于激活状态， 已经成为癌症治疗的一大热点^［5~8］. 但在临床使用中， 上游激酶抑制剂会产生严重的耐药性， 从而导致治疗失败^［9~11］. 靶向下游关键节点细胞外信号调节激酶1/2（ERK）的抑制剂， 一方面可以逆转因抑制上游靶点而引起的获得性耐药； 另一方面， 相较于MAPK通路中其它上游激酶抑制剂， ERK抑制剂不易产生耐药性^{［10， 12， 13］}. 因此， 设计选择性好、 活性高的ERK抑制剂具有更大的临床潜力和前景.

前文^［14］得到了药理活性好且结构新颖的ERK抑制剂EK-I-22（ERK2： IC₅₀=0.7 nmol/L）. 本文在此基础上， 保留EK-I-22的异吲哚啉酮母核A结构， 利用药效团融合策略， 将取代苯环替换为ERK抑制剂MK-8353（ERK2： IC₅₀=1.7 nmol/L）的药效团侧链B结构（图1）， 设计合成了14个未见文献报道的目标化合物， 并对其进行了ERK2激酶抑制活性评价， 发现了活性良好的化合物19a， 19b， 19e， 27a和27b， 并对这5个化合物进行了肿瘤细胞抑制活性测试.

1 实验部分

1.1　试剂与仪器

自制磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液（0.1 mol/L， pH=7.4， 含3.00 mmol/L氯化镁和1.00 mmol/L EDTA）； 溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）， 纯度98%， 南京生兴生物技术有限公司； 人黑色素瘤细胞A375和A2058， 人结肠癌细胞Colo-205和HT-29， 上海细胞库； 其它常用试剂均为市售分析纯试剂.

TENSOR27型红外光谱仪， 瑞士Bruker公司； AVANCE 300M型和AVANCE AV 500型核磁共振波谱仪（NMR）， 瑞士Bruker公司； Waters Micros Q-TOF型高分辨质谱仪， 美国Waters公司； Molecular Devices ID5型多功能酶标仪， 美国Molecular Devices公司； LC20A型高效液相色谱仪， 日本岛津公司； HF safe 1500型连续加样器， 德国Eppendorf公司； Direct-Q with pump型超纯水仪， 美国Millopore公司.

1.2　实验过程

关键中间体3的合成通式见Scheme 1.

关键中间体8的合成通式见Scheme 2. 目标化合物19a~19j的合成通式见Scheme 3. 目标化合物25a和25b的合成通式见Scheme 4. 目标化合物27a和27b的合成通式见Scheme 5.

1.2.1　关键中间体2的合成

将化合物1（200 mg， 0.84 mmol）、 碳酸钾（234 mg， 1.68 mmol）、 碘化亚铜（8 mg， 0.042 mmol）和二乙胺（5 mL）加入到封管中， 加热至123 ℃反应18 h. 用薄层色谱（TLC， 二氯甲烷/甲醇体积比10∶1）监测反应完毕后， 减压蒸除溶剂， 残留物经柱层析（二氯甲烷/甲醇体积比 200∶1~30∶1）分离， 得70 mg淡黄色固体2， 产率38.4%， m. p. 86.8~88.5 ℃. ¹H NMR（300 MHz， DMSO-d₆）， δ： 8.35（s，1H）， 7.70（d， J=8.6 Hz， 2H）， 6.61（d， J=8.6 Hz， 2H）， 5.91（t， 1H， J=5.1 Hz， 1H）， 3.84（s， 3H）， 3.16~3.10（m， 2H）， 2.80（t， J=6.1 Hz， 2H）.

1.2.2　关键中间体12a的合成

将化合物11a（10 g， 38.1 mmol）和NBS（10.2 g， 57.11 mmol）溶于 150 mL苯中， 加入偶氮二异丁氰（1.3 g， 7.6 mmol）， 加热至80 ℃反应6 h. 用TLC（石油醚/乙酸乙酯体积比1∶1）监测反应完毕后， 冷却至室温， 经浓缩得红色油状物， 不经处理直接投入下一步反应. 采用相同方法合成化合物12b.

1.2.3　关键中间体14a的合成

将化合物12a（13.0 g， 38.1 mmol）、 甘氨酸甲酯盐酸盐（13， 4.8 g， 38.1 mmol）和三乙胺（11.6 g， 114.21 mmol）溶于100 mL乙腈中， 加热回流反应6 h. 用TLC（二氯甲 烷/甲醇体积比20∶1）监测反应完毕后， 减压蒸除去溶剂， 残留物经柱层析（石油醚/乙酸乙酯体积比 5∶1~1∶1）分离， 得5.6 g淡黄色固体14a， 产率46.3%. 采用相同方法合成化合物14b. 化合物14a和14b的理化数据和核磁共振数据分别列于表1和表2.

1.2.4　关键中间体17a~17h和21的合成

将化合物15a（200 mg， 0.66 mmol）、 化合物16d（159 mg， 0.66 mmol）、 EDCI（154 mg， 0.80 mmol）、 HOBt（108 mg， 0.80 mmol）和DIEA（104 mg， 0.80 mmol）溶于5 mL二氯甲烷中， 室温下搅拌反应24 h. 用TLC（二氯甲烷/甲醇体积比20∶1）监测反应完毕后， 补加二氯甲烷（5 mL）， 用水洗涤（5 mL×3）， 将有机层干燥、 过滤、 减压蒸除溶剂， 得到220 mg白色固体化合物17a， 产率63.4%.采用相同方法合成化合物17b~17h和21. 化合物17b~17h和21的理化数据和核磁共振数据分别列于表1和表2.

1.2.5　关键中间体24a和24b的合成

将化合物22（400 mg， 1.08 mmol）和丙炔醇乙氧基化合物（23a， 132 mg， 1.32 mmol）溶于乙腈（6 mL）/水（1 mL）混合溶液中， 在冰浴下缓慢分批加入碘化亚铜（48 mg， 0.24 mmol）， 搅拌10 min， 升温至40 ℃反应16 h. 用TLC（二氯甲烷/甲醇体积比20∶1）监测反应完毕

后， 减压蒸馏除去溶剂， 残留物经柱层析（二氯甲烷/甲醇体积比100∶1~20∶1）分离， 得到320 mg黄色固体化合物24a， 产率62.8%. 采用相同方法合成化合物24b. 化合物24a和24b的理化数据和核磁共振数据分别列于表1和表2.

1.2.6　目标化合物19a~19j， 25a和25b的合成

参照文献［20］方法， 将化合物17a（100 mg， 0.19 mmol）、 4-氨基四氢吡喃（18a， 39 mg， 0.38 mmol）和DIEA（50 mg， 0.38 mmol）溶于3 mL仲丁醇中， 封管加热至125 ℃反应12 h. 用TLC（二氯甲烷/甲醇体积比30∶1）监测反应完毕后， 冷却至室温， 减压蒸干溶剂， 经柱层析（二氯甲烷/甲醇体积比200∶1~40∶1）分离， 得到20 mg白色固体化合物19a， 产率17.8 %， m. p.>250 ℃. 采用相同方法合成化合物19b~19j， 25a和25b. 化合物19a~19j， 25a和25b的理化数据和核磁共振数据分别列于表3和表4.

1.2.7　目标化合物27a和27b的合成

将化合物26（100 mg， 0.24 mmol）， 化合物3（72 mg， 0.24 mmol）和DIEA（188 mg， 1.46 mmol）溶于2 mLDMF中， 升温至50 ℃反应12 h. 用TLC（二氯甲烷/甲醇体积比20∶1）监测至反应完全， 冷却至室温， 加6 mL水稀释， 用乙酸乙酯萃取（4 mL×3）， 合并有机层， 加入无水硫酸钠干燥， 抽滤， 减压蒸干溶剂， 经柱层析（二氯甲烷/甲醇体积比200∶1~40∶1）分离， 得到86 mg类白色固体化合物27a， 产率52.9%， m. p. 139.8~140.0 ℃. 采用相同方法合成化合物27b. 化合物27a和27b的理化数据和核磁共振数据分别列于表3和表4.

1.2.8　ERK2酶抑制活性实验

将14个目标化合物及阳性对照药MK-8353用DMSO溶解， 配制成浓度为10 mmol/L的母液.

激酶反应过程： （1） 配制1×Kinase buffer.（2） 化合物浓度梯度的配制： 受试化合物测试浓度为 10 μmol/L起始， 3倍稀释10个浓度， 在384孔板中梯度稀释成100倍终浓度的10个不同浓度的溶液. 然后， 用Echo550转移250 nL到384反应板中备用. 向阴性对照孔和阳性对照孔中分别加入250 nL的100% DMSO.（3） 用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液.（4） 在化合物孔和阳性对照孔分别加入10 μL 2.5倍终浓度的激酶溶液； 在阴性对照孔中加入10 μL 1×Kinase buffer.（5） 以1000 r/min转速离心30 s， 振荡混合均匀后于室温孵育10 min.（6） 用1×Kinase buffer配制 25/15 倍终浓度的ATP和Kinase substrate混合溶液.（7） 加入15 μL 25/15倍终浓度的ATP与底物的混合溶液， 起始反应.（8） 将384孔板以1000 r/min转速离心30 s， 振荡混合均匀后于室温孵育40 min.（9） 加入30 μL终止检测液停止激酶反应， 以1000 r/min转速离心30 s， 振荡混合均匀.（10） 用Caliper EZ Reader读取转化率.

抑制率（Inhibition， %）计算公式为

Inhibition=[(Conversion_max-Conversion_sample)/(Conversion_max-Conversion_min)]×100%(1)

式中： Conversion_sample是测试样品的转化率； Conversion_min为阴性对照孔均值， 代表没有酶活孔的转化率； Conversion_max为阳性对照孔均值， 代表没有化合物抑制孔的转化率.

1.2.9　细胞生长抑制实验

将化合物19a， 19b， 19e， 27a， 27b和MK-8353分别配成浓度为0.016， 0.049， 0.148， 0.444， 1.333， 4.00， 12和60 μmol/L的溶液备用.

细胞培养： 将细胞传代培养10~15代， 培养条件为含有青霉素（终浓度为100 U/mL）、 链霉素（终浓度为100 μg/mL）、 10%FBS的培养基（A2058， A375： DMEM， Colo-205： RPMI-1640， HT-29： McCoy’s 5A）， 当细胞融合至90%时， 弃去旧培养基， 用2 mL PBS缓冲液洗涤细胞2次， 弃去PBS缓冲液后加入2 mL 2.5 g/L Trypsin-0.53 mmol/L EDTA混合消化液， 置于显微镜下观察约30 s， 当细胞变圆后迅速加入2 mL完全培养基终止消化， 轻轻吹打， 收集细胞. 以800 r/min转速于4 ℃离心5 min， 弃去上层清液， 用完全培养基重悬细胞， 分瓶培养， 隔天换液.

MTT实验： 将对数生长期细胞以1×10⁵ cells/孔接种于96孔板中， 于37 ℃， 5% CO₂条件下培养， 直至细胞90%融合后， 用无血清的培养基孵育2 h使细胞同步化. 随后， 弃去上层清液， 分别加入含有各种化合物（0.016， 0.049， 0.148， 0.444， 1.333， 4.00， 12和60 μmol/L）的培养基孵育96 h； 孵育结束前4 h， 每孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）. 孵育结束后， 弃去各孔中上层清液， 每孔加入150 μL DMSO， 置于细胞振荡仪上振荡10 min， 待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD₅₇₀.

增殖抑制活性百分率（Proliferation Inhibition， %）计算公式为：

Proliferation Inhibition（%）=（OD_S-OD_B）/（OD_C-OD_B）×100%（2）

式中： OD_S是测试样品的吸光度读数； OD_B为空白组吸光度， 代表没有细胞组的吸光度读数； OD_C为对照组吸光度， 代表没有化合物处理的正常细胞组的吸光度读数.

以药物浓度作为横坐标， 各浓度对应的增殖抑制活性百分率为纵坐标， 使用Graphpd Prism5做非线性回归， 计算得出化合物IC₅₀值.

1.2.10　分子对接实验

参考文献［22］方法， 利用Schrodinger Suites 2021软件包中的Protein Preparation Wizard模块对ERK2（PDB ID： 6DCG）原始晶体结构进行预处理， 移除结构中所有水分子及其它溶剂分子. 再采用LigPrep模块对小分子配体进行构象优化， 通过能量最小化方法处理其离子化构型及互变异构状态. 然后， 在完成受体网格生成后， 借助Glide模块进行分子对接计算. 对接过程中优选能量最低构象， 并最终筛选出具有特征氢键的结合模式.

2 结果与讨论

2.1　中间体及目标化合物的合成

首先， 以2，4-二氯嘧啶类化合物和3-（甲氧基羰基）-4-甲基苯基硼酸频哪醇酯为原料， 经Suzuki 反应、 NBS溴代， 再与甘氨酸甲酯盐酸盐环合， 得到中间体14； 中间体14经水解后， 分别与关键中 间体2， 16a~16f缩合， 即得中间体17a~17h； 中间体17a~17h与4-氨基吗啉或4-氨基-N-甲基吡啶在高 温下发生取代反应， 即得目标化合物19a~19j（结构见图2）.

其次， 中间体15a与1-溴乙胺经缩合反应、 叠氮化钠还原， 得到中间体22； 再分别与丙炔醇乙氧基化合物（化合物23a）和3-甲基丁炔醇-3（化合物23b）发生Click反应得到关键中间体24； 中间体24与4-氨基吗啉在高温下发生取代反应， 即得目标化合物25a和25b（结构见图2）.

然后， 化合物26与4-氨基吗啉在高温下发生取代反应， 即得目标化合物27a和27b.

所有化合物的结构经¹H NMR， ¹³C NMR和HRMS确证.

2.2　对ERK2激酶抑制活性的筛选

初步的ERK2激酶抑制活性测试结果（表5）显示， R¹为四氢呋喃氨取代基的化合物（化合物19b）的活性优于甲基吡唑胺取代基化合物（化合物19d）. R²为氯原子或氢原子时， 对ERK2的抑制活性影响较小. 当R³为芳香长链取代基时， 活性较好， 尤其末尾为三氮唑芳香环时， 活性最佳（化合物19b和19j对比）； 随着长链取代基芳香性减弱， 活性逐渐降低， 改为脂肪侧链取代基（化合物19f和19g）时， 对ERK2的抑制活性几乎完全丧失； 当R³用N，N-二甲基氨基（化合物19i）替代1-甲基-1，2，4-三氮唑-3-基时， 或芳香侧链取代基过短时（化合物25a和25b）， 对ERK2的抑制活性显著下降. 将阳性药MK-8353的左侧母核保留， 引入化合物19e的R²侧链（化合物27a， 结构见图3）， 或缩短后的19e的R²侧链（化合物27b， 结构见图3）， 产物虽有较好的抑制活性， 但仍弱于阳性药MK-8353.

2.3　活性目标化合物的结合模式预测

挑选激酶抑制活性较好的化合物19a和27a， 分别对接入MK-8353与ERK2蛋白共晶结构中（PDB ID：6DCG）， 如图4所示， 2个化合物均可与关键氨基酸残基MET104， ASP106， LYS112及LYS52形成活性相关氢键， 同时R³长链取代基， 可以很好地模拟MK-8353药效团侧链B的走向， 深入到TYR62与TYR34形成的第二口袋中， 进一步验证了本研究化合物设计思路的可行性.

2.4　部分活性目标化合物抗肿瘤细胞增殖的初步结果

选取对ERK2抑制活性较好的化合物19a， 19b， 19e， 27a和27b， 测试了其对含有RAS-RAF-MEK-ERK突变的肿瘤细胞系人结肠癌细胞Colo-205、 人黑色素瘤细胞A375、 人皮肤癌细胞A2058和人结肠癌细胞HT-29的抗增殖能力. 实验结果（表6）表明， 化合物19a只对A375细胞的增殖具有一定的抑制活性； 化合物19b对A375， A2058和COLO-205均有一定的增殖抑制作用， 但对HT-29的活性较弱； 化合物19e对A375和COLO-205具有一定的增殖抑制作用， 对A2058的抑制作用较弱， 但对HT-29的增殖抑制活性基本丧失； 化合物27a对4种肿瘤细胞的增殖抑制活性均较差； 化合物27b对4种肿瘤细胞均具有一定的抑制活性， 其中对细胞COLO-205的增殖抑制活性为1.08 μmol/L.

3 结 论

以ERK抑制剂EK-I-22和MK-8353为先导化合物， 利用药效团融合策略， 设计合成了14个目标 化合物. 初步的药理活性测试结果表明， 化合物19a（IC₅₀=16 nmol/L）， 19b（IC₅₀=15 nmol/L）， 19e（IC₅₀= 20 nmol/L）， 27a（IC₅₀=19 nmol/L）和27b（IC₅₀=56 nmol/L）对ERK2激酶具有较好的抑制活性. 肿瘤细胞增值抑制活性测试结果显示， 化合物19b和27b对人肿瘤细胞Colo-205， A375， A2058和HT-29具有一定的增殖抑制活性.

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基金资助

2023年度省高校基础科学(自然科学)研究项目(23KJB350008)

2024年度太仓市基础研究计划面上项目(TC2024JC21)