蛇床子素肟醚衍生物的合成与抗菌活性

Synthesis and Antibacterial Activities of Osthole Oxime Ether Derivatives

摘要

在前期研究的基础上, 运用骨架跃迁原理, 对抗革兰氏阳性菌活性化合物A进行结构优化, 设计合成了18个蛇床子素肟醚衍生物, 经¹H NMR、 ¹³C NMR和元素分析确证其结构. 抗菌活性测试结果显示, 该类化合物对金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)的活性不显著, 但其对脆弱拟杆菌(B. fragilis)和厌氧消化链球菌(P. anaerobius)有较好的抑制作用, 尤以化合物5d和5g最为显著, 对B. fragilis的最小抑菌浓度(MIC)分别为 1 和2 μg/mL, 与对照药甲硝唑相当, 可作为先导化合物进行深入研究.

Abstract

Based on previous research， the structure of antibacterial active compound A were optimized using the scaffold hopping principle. Eighteen osthole oxime ether derivatives were designed and synthesized， and confirmed by means of ¹H NMR， ¹³C NMR and elemental analysis. The antibacterial activities test results revealed that these compounds had insignificant activity against S. aureus and E. coli. However， they unexpectedly exhibited good inhibitory effects against B. fragilis and P. anaerobius. Notably， the compounds 5d and 5g demonstrated the most significant activity， with minimum inhibitory concentrations（MIC） of 1 μg/mL and 2 μg/mL against B. fragilis， respectively. Its antibacterial activities are comparable to the control drug metronidazole， which will be extensively studied as novel antibacterial lead compounds.

Graphical abstract

关键词

蛇床子素衍生物 / 肟醚 / 合成 / 抗菌活性

Key words

Osthole derivatives / Oxime ether / Synthesis / Antibacterial activity

目前， 抗生素的耐药性已成为全球主要的医疗卫生问题， 急需新型抗菌药物来克服令人担忧的问题^［1~4］. 天然产物由于其独特的化学结构和多样的生物活性， 一直是抗菌药物研发的重要来源之一^［5，6］， 如黄连素、 大蒜素和伏立康唑等.

天然产物蛇床子素， 化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素， 具有抗菌、 抗炎、 抗肿瘤、 抗真菌和杀幼虫等多种生物活性^［7~11］， 尤其在抗菌方面的潜在作用受到关注^{［12，13］}， 值得进行结构改造以获取抗菌活性更好的候选化合物. 本课题组^［14~17］前期以蛇床子素为原料， 对其进行结构改造和修饰， 设计合成了多个系列的蛇床子素衍生物， 其中， 部分化合物具有较显著的抗菌活性， 对金黄色葡萄球菌（S.aureus）、 大肠杆菌（E.coli）、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐氟喹诺酮大肠杆菌（FREC）的活性远优于蛇床子素， 具有进一步研究的前景.

肟醚作为一种重要的官能团， 在药物设计中被广泛应用于改善药效、 增强稳定性和提高靶向性等功能^{［18，19］}. 其中， 肟醚类化合物可通过干扰细菌的细胞壁合成或影响细菌代谢发挥抗菌作用^{［20，21］}. 如， 在抗菌药物头孢克肟的结构中， 肟醚增强了对β-内酰胺酶的稳定性， 并延长其作用时间^［22］； 通过在吉米沙星的7位侧链引入肟醚结构， 增强与靶标的亲和力， 显著提高了对革兰阳性菌的活性； 同时， 肟基的亲脂性增强了对铜绿假单胞菌和厌氧菌的渗透性， 并显著减少其耐药性^［23］.

硝基咪唑类骨架因其独特的化学结构， 在药物设计中具有广泛潜力， 其衍生物具有抗菌、 抗肿瘤和靶向递送等多种作用^{［24，25］}. 尤其在抗菌方面， 可通过产生活性中间体及自由基破坏细菌DNA并引发氧化损伤， 从而发挥作用^［26］， 目前已上市的药物有甲硝唑和奥硝唑等.

基于此， 为获取有研究前景的抗菌候选化合物， 本文对前期研究^［14］获得的一个活性化合物A进行结构优化， 运用骨架跃迁原理， 将化合物A结构中的酯键官能团用肟醚替换， 并用硝基咪唑骨架代替其苯环结构， 设计合成了系列新型蛇床子素肟醚衍生物（设计思路见Scheme 1）， 并进行了抗菌活性与构效关系研究.

1 实验部分

1.1　试剂与仪器

蛇床子素、 二氧化硒（SeO₂）、 盐酸羟胺、 1，3-二溴丙烷、 1，4-二溴丁烷、 甲酸、 咪唑或取代咪唑、 对硝基邻苯二胺、 3-氨基-1，2，4-三唑和过硫酸氢钾（KHSO₅）等其它试剂， 纯度99%， 安徽泽升科技股份有限公司； 碳酸钾（K₂CO₃）、 氢化钠（NaH）、 碘化钾（KI）、 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、 二甲基亚砜（DMSO）、 盐酸、 硝酸和硫酸等其它试剂， 分析纯， 成都金山化学试剂有限公司.

X-4B型显微熔点仪， 上海仪电物理光学仪器有限公司； Bruker 400型核磁共振波谱仪（NMR）， 德国布鲁克公司； Vario EL 5型元素分析仪， 德国Elementar公司.

1.2　实验过程

目标化合物的合成路线如Scheme 2所示.

1.2.1　中间体1和2的合成

参照文献［14］方法合成中间体1. 将1.00 mmol（0.50 g）中间体1、 1.60 mmol（0.21 g）盐酸羟胺、 10.00 mL乙醇和10.00 mL蒸馏水加入至反应瓶中， 室温下搅拌反应， 用薄层色谱跟踪反应进程， 1 h后反应完毕， 加入适量蒸馏水， 用二氯甲烷萃取4次， 以无水硫酸钠 干燥， 浓缩溶剂， 经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯体积比2∶1）分离纯化， 得白色固体状中间体2， m. p. 184~186 ℃.

1.2.2　中间体3和4的合成

中间体3a~3g的合成参考文献［27］的方法， 中间体3h和3i的合成方法 分别参考文献［28］和［29］. 以中间体4a为例： 向反应瓶中依次加入1.00 mmol（0.20 g）化合物3a、 4.00 mmol（0.72 mL） 1，3-二溴丙烷、 2.00 mmol（0.49 g）碳酸钾和5.00 mL DMF， 室温下搅拌反应， 用薄层色谱跟踪反应进程， 2 h后反应完毕， 加入适量蒸馏水， 用乙酸乙酯萃取水相3次， 合并萃取液， 用饱和食盐水洗涤3次， 以无水硫酸钠干燥， 减压浓缩， 经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯体积比2∶1）分离纯化， 得白色固体状中间体4a， m. p. 50~52 ℃.

1.2.3　目标化合物5的合成

以化合物5a为例： 取1.00 mmol（0.10 g）中间体2a、 1.50 mmol（0.13 g）中间体4a、 2.00 mmol（0.03 g）氢化钠和5.00 mL DMF加入反应瓶中， 于5 ℃搅拌反应， 用薄层色谱跟踪反应进程， 30 min后反应完毕， 加入适量蒸馏水， 用乙酸乙酯萃取5次， 以饱和食盐水洗涤3次， 用无水硫酸钠干燥， 浓缩溶剂， 得粗品， 经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯体积比4∶1）分离纯化， 得白色固体状目标化合物5a. 化合物5b~5r采用类似方法制备. 化合物5a~5r的理化数据列于表1， ¹H NMR和 ¹³C NMR数据列于表2， 相关谱图见本文支持信息图S1~S36.

1.2.5　抗菌活性测试

金黄色葡萄球菌（S. aureus）、 大肠杆菌（E. coli）、 脆弱拟杆菌（B. fragilis）和 厌氧消化链球菌（P. anaerobius）均购于北纳创联生物科技有限公司. 以甲硝唑（Metronidazole）和诺 氟沙星（Norfloxacin）作为对照药， 参照文献［30］方法， 采用两倍稀释法测定目标化合物的最小抑菌 浓度（MIC）.

2 结果与讨论

2.1　目标化合物的合成及表征

蛇床子素被SeO₂氧化为中间体1， 再与盐酸羟胺反应制得中间体2； 在合成中间体4时， 以DMF为溶剂， 在K₂CO₃作用下， 有较高收率； 碱的强弱、 反应温度和时间等对化合物5的制备有较大影响， 以化合物5a为例， 在K₂CO₃和KI作用下， 副产物多， 反应时间长， 收率仅有15%， 而在NaH作用下， 室温反应30 min， 收率可达60%.

以化合物5a为例， 在其¹H NMR谱图中， δ 8.40处的单峰为碳氮双键H的信号峰， δ 7.95处的二重峰为香豆素环4号位H的信号峰， δ 7.82~7.67处的单峰为咪唑环上H的信号峰， δ 7.57处的二重峰为香豆素环5号位H的信号峰， δ 7.05处的二重峰为香豆素环6号位H的信号峰， δ 6.26处的二重峰为香豆素环3号位H的信号峰， δ 5.75处的三重峰为碳碳双键H的信号峰， δ 4.10~3.57处的多重峰为结构中NCH₂， OCH₂， OCH₃和=CH₂的信号峰， δ 2.08处的多重峰为丙基2号位的H信号峰， δ 1.90处的单峰为CH₃的信号峰. 在¹³C NMR谱图中， 芳基碳和双键碳的吸收峰在δ 160.61~108.49之间， δ 70.32和56.80处分别为OCH₂和OCH₃的碳信号峰， δ 45.14处为NCH₂的碳信号峰， 其余CH₂和CH₃的信号峰在δ 29.93~11.77之间.

2.2　晶体结构与解析

为了进一步确证目标物的结构， 通过室温溶剂缓慢挥发法获得了化合物5o的晶体， 其晶体结 构见图1. 该晶体为正交晶系， 空间群Pbcn（no.60）， a=2.32932（2） nm， b=1.122080（10） nm， c=1.735620（10） nm， V=4.53636（6） nm³， Z=8， T=298.81（10） K， μ（Cu Kα）=1.896 mm^-1， D_calc=1.391 g/cm³， F（000）=1984.0.

晶体结构分析表明， 分子结构中2个双键C（12）=C（13）和C（15）=N（1）的几何异构均为E构型， 可能具有位置互变异构的咪唑环上的硝基位于4号位. 其晶体学数据（CCDC： 2452087）可通过剑桥晶体数据库获得.

2.3　抗菌活性与构效关系

表3列出了目标化合物的抗菌活性测试结果， 可见目标化合物对所测细菌均有不同的抑制作用， 其中， 化合物5i和5r对S. aureus的MIC值分别为32和32 μg/mL， 化合物5c， 5i， 5j， 5o和5r对E. coli的MIC值分别为32， 16， 32， 32和32 μg/mL， 化合物5d， 5e， 5g， 5m和5p对B. fragilis的MIC值分别为 1， 8， 2， 8和8 μg/mL， 化合物5d， 5e， 5h， 5n和5p对P. anaerobius的MIC值分别为16， 32， 8， 32和 32 μg/mL， 尤以化合物5d和5g尤为突出， 抗B. fragilis活性远优于对照药诺氟沙星， 且与甲硝唑接近. 总体看来， 该类化合物在抗厌氧菌方面明显优于抗革兰氏阳性菌和阴性菌.

构效关系分析如下： 当R为不同类型环时， 苯并硝基咪唑化合物的抗菌活性远低于硝基三氮唑 和硝基咪唑类化合物， 如化合物5h的抗B. fragilis活性远低于化合物5a和5i， 推测可能与空间位阻 有关； 而硝基三氮唑类化合物的抗S. aureus和E. coli活性通常优于硝基咪唑类化合物， 如化合物5i优于化合物5a.

当R为硝基咪唑时， 大多4-硝基咪唑化合物的抗菌活性优于2-硝基咪唑化合物， 如化合物5a的抗B. fragilis和E. coli活性优于化合物5b； n=3时化合物的抗菌活性大多优于n=4的化合物， 如化合物5d和5g的抗B. fragilis和P. anaerobius活性分别优于化合物5m和5p； 在4-硝基咪唑环上， 2位连接给电子基的化合物的抗菌活性优于连接吸电子基的化合物， 如化合物5d的抗B. fragilis和P. anaerobius活性优于化合物5e和5f； 硝基咪唑环上取代基的个数对抗菌活性有较显著影响， 含双取代的化合物有更优的活性， 如化合物5g的抗B. fragilis和P. anaerobius活性明显优于化合物5a， 5c和5e， 可能与其空间效应有关； 与前期化合物A^［14］和其它蛇床子素衍生物^［15~17］比较， 该类化合物的抗S. aureus和E. coli活性均不显著， 但意外地发现该系列化合物对厌氧菌有较好的抗菌活性， 尤其对B. fragilis有较好的抑制作用.

3 结 论

运用骨架跃迁原理对前期活性化合物A进行结构改造和优化， 设计合成了18个结构新颖的蛇 床子素肟醚衍生物， 该类化合物对所测厌氧菌有较好抑制作用， 尤以化合物5d和5g的活性最优， 抗B. fragilis活性较显著， 可作为抗菌先导化合物进行深入研究.

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基金资助

贵州省科技计划项目(批准号: 黔科合基础-ZK[2024]一般265)和国家级大学生创新创业训练计划项目(202310661006)