肠道共生菌Akkermansia muciniphila编码的重组蛋白Amuc_0119的表达与纯化

Expression and Purification of Recombinant Amuc_0119 Protein Encoded by the Gut Commensal Bacterium Akkermansia Muciniphila

摘要

粘蛋白降解肠道共生菌Akkermansia muciniphila因具有促进健康的效用而备受关注, 其蛋白组分在宿主-微生物互作中发挥着重要作用. 其中, Amuc_0119是一类尚未表征的假定蛋白, 具有潜在生物学功能. 本文旨在构建Amuc_0119的重组表达系统, 以促进其结构和功能研究. 将Amuc_0119编码序列克隆至N端和C端均带有6×His标签的pET-28a(+)载体中, 并转化至大肠杆菌BL21(DE3). 在37 ℃下以0.5 mmol/L IPTG过夜诱导表达, 经SDS-PAGE分析获得了46 kDa重组蛋白, 并通过Ni-NTA亲和层析纯化, 其纯度达92.08%. Western blot结果确认为目标蛋白, 通过BCA定量测得最终浓度为818.44 μg/mL. 本文建立了Akkermansia muciniphila来源Amuc_0119的高效表达与纯化体系, 为后续结构及功能研究提供了必要工具.

Abstract

The mucin-degrading gut commensal bacterium Akkermansia muciniphila has emerged as a promising probiotic due to its significant health-promoting effects， wherein its protein constituents mediate critical host-microbe crosstalk. Notably， Amuc_0119 represents an uncharacterized protein potentially with beneficial biological functions. In this study， we aimed to construct an expression system for recombinant Amuc_0119 to facilitate its structural and functional characterization. The coding sequence of Amuc_0119 was cloned into pET-28a（+） vector with an N-terminal 6×His-tag and successfully transformed into E. coli BL21（DE3） competent cells. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG overnight at 37 °C. SDS-PAGE analysis revealed successful expression of the 46 kDa recombinant protein， which was subsequently purified via Ni-NTA affinity chromatography with a purity of 92.08%. Western blot with anti-His antibodies confirmed the target protein identity， while quantitative BCA assay determined a final concentration of 818.44 μg/mL. This study establishes the first efficient expression and purification protocol for Akkermansia muciniphila-derived Amuc_0119， providing essential tools for forthcoming structural studies and functional investigations for this bacterial protein.

Graphical abstract

关键词

粘蛋白降解肠道共生菌(Akkermansia muciniphila) / 益生菌 / Amuc_0119 / 表达 / 纯化

Key words

Akkermansia muciniphila / Probiotic / Amuc_0119 / Expression / Purification

粘蛋白降解肠道共生菌Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）作为一种具有显著促进健康作用的益生菌而备受关注， 它是一种革兰氏阴性厌氧菌， 广泛存在于人类肠道中， 尤其是健康成人的肠道中^［1］. 近来研究表明， A. muciniphila在维持肠道屏障功能、 调节免疫反应和改善代谢健康方面发挥着重要作用^［2，3］， 这些功能使其成为肠道微生物组研究的热点， 而其蛋白组分在宿主-微生物互作中发挥着关键作用^［4］， A. muciniphila及其组分（外膜蛋白和细胞外囊泡）被发现可预防和改善肥胖、 糖尿病、 代谢综合征、 炎症、 衰老、 癌症治疗副作用及神经退行性疾病等^［5~8］.

A. muciniphila ATCC BAA-835基因组包含2176个蛋白编码基因， 其中许多功能已被初步研究^［9］. 如Amuc_2301和Amuc_2446已得到克隆并纯化^［10］， 细胞外蛋白Amuc_1100被证实可改善肥胖和 糖尿病， 且具有抗炎和抗肿瘤作用^［11~14］， Amuc_1686可保护组织再生^［15］， Amuc_0705， Amuc_0707， Amuc_1757和Amuc_2085具有神经氨酸酶活性^［16］. 此外， A. muciniphila分泌的苏氨酰tRNA合成 酶（AmTARS）具有调节免疫稳态的功能^［17］； 分泌的乙酰转移酶可以抑制结肠癌的发生^［18］； 分泌的P9蛋白可改善小鼠葡萄糖稳态并缓解代谢疾病^{［19，20］}， 而且实现了异源原核分泌表达^［21］， 具有治疗糖尿病、 肥胖症等疾病的治疗潜力， 分泌蛋白Amuc_1409可调节肠干细胞以改善肠道健康^［22］.

近年来关于A. muciniphila及其关键蛋白的研究不断深入， 多数工作集中在少数已报道的功能性分泌蛋白上， 而对于Amuc_0119等假定蛋白的研究很少. 而Amuc_0119作为A. muciniphila分泌的假定蛋白， 其分泌能发挥一定的生物学功能， 但目前尚无关于Amuc_0119结构、 功能及潜在生物学作用的研究报道， 这也限制了对A. muciniphila整体功能图谱的全面认知， 所以开发高效重组蛋白表达体系以研究Amuc_0119的功能特征尤为重要.

基于此， 本文通过构建Amuc_0119的重组表达体系， 实现了其在大肠杆菌中的高效稳定表达和纯化. 该研究不仅填补了Amuc_0119研究的空白， 也为其进一步结构解析和生物学功能奠定了基础， 有助于该蛋白的未来研究， 为A. muciniphila的具体益生机制提供了新的思路， 具有一定应用前景.

1 实验部分

1.1　试剂与仪器

胰蛋白胨（A.R.级）和酵母提取物（A.R.级）， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司； 氯化钠（A.R.级）和丙三醇（A.R.级）， 国药集团化学试剂有限公司； 琼脂粉（AR）、 硫酸卡那霉素（≥765 U/mg）、 Tris（≥99.5%）和甘氨酸（≥98.5%）， 北京Biosharp生物科技有限公司； IPTG（纯度≥98%）和SDS（纯 度＞93%）， 北京鼎国昌盛生物技术公司； 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞（CD601-02）、 6×Prorein Loading Buffer（DL101-02）、 Anti-His Rabbit Monoclonal Antibody（HT501-01）、 HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG （H+L）（HS201-01）和预染蛋白Marker（14-120 kDa）（DM111-02）， 北京全式金生物技术有限公司； 超敏ECL发光液（MA0186）， 大连美仑生物技术有限公司； 脱脂奶粉（0008443）， 美国 BD-Difco公司； 丙烯酰胺（A501033）， 生工生物工程（上海）有限公司； 甲叉双丙烯酰胺（BM0344）， 北京百奥莱博科技有限公司； 考马斯亮蓝R250（1912GR005）， 德国Biofroxx生物试剂公司； 镍柱填料（SA005GC05）， 常州天地人和生物科技有限公司； 改良型BCA蛋白质浓度检测试剂盒（KTD3001）， 亚科因（武汉）生物技术有限公司.

PB-10型pH仪， 德国Standardize仪器公司； JY92-IIN型超声波细胞粉碎机， 宁波新芝生物科技股份有限公司； D3024R型高速冷冻离心机， 大龙生物有限公司； Tanon 4800型化学发光成像分析系统， 上海天能科技有限公司； Infinite M200 Pro型全自动多功能酶标仪， 瑞士TECAN公司； UV1700型紫外分光光度计， 日本岛津公司.

1.2　实验过程

1.2.1　Amuc_0119生化信息分析

利用Expasy^［23］， SignalP， TMHMM2.0， ProtCompB， PredictProtein和AlphaFold 3等生物信息学工具预测并分析了Amuc_0119的理化性质、 疏水/亲水性、 信号肽、 跨膜螺旋、 亚细胞定位、 二级结构和三级结构.

1.2.2　质粒构建与转化

根据生物信息学预测结果， 去除了Amuc_0119 N端前16个氨基酸残基组成的天然信号肽. 选择pET-28a（+）作为重组蛋白表达载体， 宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）. 在基因两端分别加入Nco Ⅰ和 Xho Ⅰ限制性内切酶位点， 并在目标基因两端添加His标签. 基因设计完成后由上海生工公司合成. 取25 μL大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞加入无菌EP管中再加入5 μL质粒， 置于冰上放置30 min； 用42 ℃水浴热激45 s， 再冰浴2 min. 在无菌环境中向管中加入1 mL SOC培养基， 于37 ℃， 180 r/min条件下振荡培养1 h. 以4000 r/min转速离心5 min， 弃去上层清液， 用100 μL LB液体培养基重悬菌体. 将菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上， 于37 ℃恒温培养箱中过夜培养. 挑取单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基， 于37 ℃， 180 r/min条件下振荡培养12 h， 然后进行测序.

1.2.3　重组蛋白诱导与表达

将上述获得的菌液接种于200 mL含硫酸卡那霉素的LB液体培养基， 于37 ℃， 180 r/min条件下振荡培养4 h至对数生长期， OD₆₀₀值约0.6.加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L（IPTG 储备液浓度1.0 mol/L）， 于37 ℃， 150 r/min条件下诱导过夜. 诱导前后各取1 mL菌液， 用 SDS-PAGE分析重组蛋白表达.

1.2.4　SDS-PAGE

将诱导前、 诱导后及不同浓度咪唑洗脱的蛋白样品按1：5比例加入6×上样缓冲液中， 经100 ℃沸水浴10 min， 冰浴2 min. Marker（14-120 kDa）加样10 μL， 各样品加样15 μL， 在440 V， 80 mA条件下电泳1 h. 用考马斯亮蓝染色15 min， 弃去染色液， 加入脱色液振荡脱色过夜， 拍照记录.

1.2.5　Ni-NTA亲和层析

将诱导成功的菌液离心收集菌体， 用20 mL 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.0）重悬， 低温超声破碎30 min. 于4 ℃下以12000 r/min转速离心30 min， 收集上层清液， 用0.45 μm无菌滤膜过滤， 于冰上保存备用. 将Ni²⁺-NTA Beads 6FF重力柱固定于架上， 放尽保护液后用5个柱体积去离子水冲洗， 再用5个柱体积 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=8.0）平衡. 将冰上保存的上清液加入平衡好的柱子中， 轻轻混匀振荡1 h结合， 循环柱内2~3次. 用10~15个柱体积10和100 mmol/L咪唑溶液洗去非特异结合蛋白， 用5~10个柱体积250 mmol/L咪唑洗脱目标蛋白并收集. 柱子用Tris-HCl缓冲液和去离子水各5个柱体积依次洗涤后， 用等体积20%乙醇保存于4 ℃. 所有操作均在冰上或低温层析柜中进行， 所有溶液经预冷.

1.2.6　透析

剪取适当长度透析袋， 置于含1 L蒸馏水的烧杯中微波加热30 min， 冷却后于4 ℃ 保存. 使用前用蒸馏水检测封口性. 将1.2.5节获得的蛋白洗脱液加入透析袋中， 用透析夹密封， 置于 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中， 于4 ℃低温层析室透析24 h， 透析缓冲液中途更换一次.

1.2.7　Western blot鉴定

对待鉴定的蛋白样品进行SDS-PAGE分析， 根据目标蛋白分子量（30~50 kDa）按Marker指示位置剪下相应分离胶部分， 去离子水浸泡15 min. 测量胶的长宽， 剪取相应大小PVDF膜和6层滤纸， PVDF膜用甲醇浸泡10 min活化， 胶、 膜、 滤纸和海绵垫均置于预冷转膜缓冲液 中浸泡10 min平衡. 转膜时按阴极黑面顺序依次放置海绵垫、 三层滤纸、 胶、 PVDF膜、 三层滤纸和 海绵垫， 确保无气泡且完全接触. 设定恒电流为250 mA转膜1.5 h， 冰浴降温. 转膜后将PVDF膜于室温用5%脱脂奶粉振荡封闭1 h， 弃去封闭液， 用滤纸吸干残液. 用TBS缓冲液稀释抗His小鼠单克隆抗体（1∶8000）， 将膜蛋白面向下置于抗体溶液中于低温层析室孵育14 h. 用TBST溶液洗膜3次， 每次 15 min， 用TBS缓冲液稀释HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L） （1∶5000）于室温孵育1 h， 再用TBST溶液洗膜3次， 每次15 min. 将PVDF膜置于Tanon-5200自动化学发光成像系统中， 使用ECL超敏电化学发光试剂（溶液A和溶液B按体积比1∶1现配）覆盖膜表面检测目标蛋白.

1.2.8　BCA蛋白定量

使用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后的重组蛋白浓度. 按照说明书以0~2000 µg/mL的BSA浓度绘制标准曲线， 用酶标仪在562 nm处测量吸光度， 以蛋白浓度为横坐标、 吸光度为纵坐标计算标准曲线方程， 将蛋白样品在562 nm的吸光度值代入标准曲线计算蛋白浓度.

2 结果与讨论

2.1　Amuc_0119生化信息分析

利用多种生物信息学工具对Amuc_0119的理化性质和结构进行了分析. 通过Expasy门户的 ProtParam（表1）和ProtScale［图1（A）］预测， 显示Amuc_0119为亲水性蛋白， 平均亲水性指数为-0.333， 表明其可溶性良好. SignalP-6.0［图1（B）］和TMHMM-2.0［图1（E）］分析结果表明， 氨基酸残基1~16位为信号肽. ProtCompB预测结果提示Amuc_0119可能为分泌蛋白（表2）. InterPro保守结构域与功能位点分析显示， Amuc_0119不属于任何已知蛋白家族［图1（C）］. 同时， 通过SWISS-MODEL初步检索发现Amuc_0119氨基酸序列与已知蛋白相似性较低， 表明其同源性低［图1（D）］. 上述结果表明， Amuc_0119的生物学功能尚不明确. 然而， 作为一种假定的A. muciniphila分泌蛋白， 其潜在功能值得进一步研究. 最终， 利用AlphaFold 3对Amuc_0119进行了三维结构模拟［图1（F）］. 获得综合性生物信息学分析结果为Amuc_0119的潜在晶体结构和功能研究提供了参考.

2.2　质粒构建与转化

信号肽通常具有疏水性且可溶性差， 使其在原核系统中表达存在困难. 此外， 信号肽可能无法被表达系统正确识别并切除， 从而影响重组蛋白的空间构象和活性^［24］. 因此， 本文根据生物信息学预测， 删除了Amuc_0119 N端1~16个氨基酸残基组成的野生型信号肽并在N端和C端添加了6×His标签， 以便于亲和纯化， 随后使用AlphaFold 3预测删除信号肽并添加His标签后的蛋白质结构. 如 图2（A）所示， 其三维空间结构与原始结构相比除两端外其核心结构无显著变化， 结构相似， 所以信号肽的删除及His-tag的添加对蛋白质整体结构影响较小.

鉴于pET系列表达载体是重组蛋白表达的常用高效系统， 且pET-28a（+）最为常用， E. coli BL21（DE3）是与pET系统结合应用的经典宿主菌株^{［25，26］}， 因此选择其进行重组蛋白表达. 通过限制性内切酶位点筛选， 在5′端添加Nde I， 在3′端添加Xho I， 同时在基因两端添加His标签. 基因设计完成后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 成功构建质粒， 其图谱如图2（B）所示. 质粒转化后挑取单克隆菌落进行培养并送测序验证， 结果如图2（C）所示， 无移码突变和点突变， 表明质粒构建与转化成功， 可用于后续重组蛋白表达.

2.3　Amuc_0119重组蛋白的表达与纯化

pET-28a（+）-Amuc_0119（49-1320）表达的重组蛋白理论分子量为46 kDa. SDS-PAGE显示， 经IPTG诱导后， 在约50 kDa处出现明显且均一的条带， 占菌体总蛋白的1/2以上， 表明该条带为目标蛋白.

重组蛋白Amuc_0119 N端和C端均带有6×His标签， 采用Ni-NTA亲和层析进行纯化. 破碎后的菌体上清液与Ni²⁺-NTA 6FF重力柱混合后， 依次用10， 100及250 mmol/L咪唑洗脱. SDS-PAGE结果如图3所示， 在250 mmol/L咪唑洗脱条件下， Amuc_0119重组蛋白浓度和纯度较高， 通过 ImageJ软件对目的条带进行了灰度分析， 计算得到目的蛋白的纯度约为92.08%.

2.4　Amuc_0119重组蛋白的鉴定

采用Western blot对250 mmol/L咪唑洗脱液进行了鉴定. 由图4可见， 6×His标签可被抗His单克隆抗体识别， 膜上检测到对应条带， 证明洗脱蛋白即为重组Amuc_0119.

2.5　Amuc_0119重组蛋白浓度测定

将洗脱后的重组蛋白在Tris-HCl缓冲液中透析24 h除去咪唑， 并通过10 kDa超滤膜浓缩. 利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度， 得到标准曲线方程为y=0.0004x+0.0082， R²=0.9976， 代入标准曲线方程得到纯化后的Amuc_0119蛋白浓度为818.44 μg/mL （17.8 μmol/L）.

3 结 论

通过生物信息学分析表明， Amuc_0119为亲水性分泌蛋白， 无跨膜结构域， 分子量约46 kDa， 具有良好可溶性， 且去除了天然信号肽并在N端与C端添加6×His标签， 利用Ni-NTA亲和层析纯化目标蛋白， 其纯度达92.08%. SDS-PAGE与Western blot分析验证其策略有效， BCA定量测得浓度为818.44 μg/mL（17.8 μmol/L）. 研究结果证明pET-28a（+）/BL21（DE3）体系可实现Amuc_0119的可溶性表达且未形成包涵体， 成功构建了A. muciniphila源假定蛋白Amuc_0119的重组表达系统， 实现了其在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效稳定可溶表达， 从而为Amuc_0119的结构解析及进一步研究其生物功能奠定了基础， 有助于对该蛋白的持续和未来研究， 有望为揭示A. muciniphila的益生机制提供新的见解.

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基金资助

吉林省科技发展计划项目(20240401055YY)