微生物转录因子工程的研究进展

Research Advances in Microbial Transcription Factor Engineering

摘要

随着合成生物学的快速发展，微生物细胞工厂成为绿色生物制造的重要方式.转录因子工程作为一种通过转录因子来调控基因表达的技术，具有可同时调控代谢途径的多个基因的功能，在微生物代谢工程和合成生物学研究中发挥着重要作用.介绍转录因子及其调控机制，综述当前微生物中转录因子的研究进展和转录因子工程的应用进展等，讨论转录因子工程面临的挑战和未来发展趋势.

Abstract

With the rapid development of synthetic biology， microbial cell factories have emerged as a pivotal platform for green biomanufacturing. Transcription factor engineering， a technology that utilizes transcription factors to regulate gene expression， enables simultaneous modulation of multiple genes within metabolic pathways. This approach plays a crucial role in microbial metabolic engineering and synthetic biology research. This review introduces the fundamental concepts and regulatory mechanisms of transcription factors， summarizes recent advances in microbial transcription factor studies and their engineering applications， and discusses current challenges and future directions in this field.

Graphical abstract

关键词

转录因子 / 转录因子工程 / 调控机制 / 耐受性 / 生物传感器

Key words

transcription factors / transcription factor engineering / regulatory mechanism / tolerance / biosensors

随着代谢工程和合成生物学的快速发展，通过微生物细胞工厂可实现高附加值产品的合成^［1］，如生物医药、生物能源、生物基化学品和生物材料等.为了提高微生物细胞工厂中靶点化合物的合成效率，传统的调控策略是直接上调、下调或敲除代谢途径中的基因^［2］.然而，在产品的合成过程中，由于合成途径和代谢网络的复杂性，少数基因的调控往往难以达到共同修饰的目的，并且对单个基因的修饰可能会破坏细胞的生理或代谢平衡，即对细胞的应激反应、生长和分裂造成破坏性影响，进而导致产品的合成效率降低 ^［3］.同时，调控多个代谢途径中的多个基因，或者动态调控代谢途径中的关键基因，是构建理想微生物细胞工厂的重要策略.转录因子可同时调控代谢途径中多个基因的功能，转录因子工程逐渐成为构建高效微生物细胞工厂的新策略.目前，通过对转录因子进行调控，已经实现了转录因子工程在提高微生物抗逆性^［4］、产品合成^［5］和生物传感器^［6］等方面的应用.鉴于转录因子工程在微生物细胞工厂构建中发挥的重要作用，文中从转录因子及其调控机制入手，综述当前微生物中转录因子工程的研究进展，总结转录因子调控策略及其应用，并展望其发展前景.

1 转录因子及其调控机制

1.1 转录因子

转录因子（transcription factors，TFs）是一种DNA结合蛋白，能与基因启动子区域中的顺式作用元件结合，也被称为反式作用因子^［7］.转录因子的典型结构主要包括DNA识别或结合结构域（DNA binding domain，DBD）、转录调控结构域（effector binding domain，EBD）和调节结构域（activation/repression domain，AD/RD）3个功能区域^［8］（图1）.DNA结合结构域的结构多种多样，多由60~100个氨基酸残基组成的亚区构成^［9］.特定的氨基酸序列和三维结构与特定的DNA碱基序列互补，使转录因子能够高度特异性地结合到基因的启动子或增强子上.相同类型转录因子的DNA结合结构域的氨基酸序列较为保守，决定了转录因子的特异性.转录调控结构域则负责转录激活或抑制功能的执行.转录激活域可与RNA聚合酶Ⅱ或其他转录因子的辅助因子结合，以增强转录起始的效率.相反，转录抑制域可能阻止RNA聚合酶与启动子结合，或者吸引沉默复合体，从而抑制转录.在某些情况下，转录因子可同时具有激活与抑制功能，这取决于它们与特定DNA序列结合的方式以及与其他蛋白的相互作用.DNA结合结构域和转录调控结构域之间的相互作用决定了转录因子的功能和性质^［10］.对于抑制型转录因子，如调控基因（LacI），其编码乳糖操纵子的阻遏蛋白^［11］，转录调控结构域可与操纵子的启动子区域结合，导致转录因子的构象变化，阻止RNA聚合酶结合，从而抑制下游基因的表达.对于激活型转录因子，如阻遏蛋白（LexA），其转录调控结构域与RNA聚合酶相互作用^［12］，将RNA聚合酶招募到由转录因子调节的启动子DNA区域，以激活转录.转录调控结构域通常包含其他功能蛋白的结合位点，这些位点通过与辅助转录因子和其他分子结合发挥作用，如一些诱导转录因子，包括信号感应结构域（signal sensing domain，SSD）^［13］.SSD是一种可选的结构单元，通过与配体结合来感知细胞内和细胞外信号，并将信号传递到转录复合物的其他区域，从而调节靶向基因的表达^［14］. SSD，DNA结合结构域存在于不同的蛋白质分子上，并形成转录复合物，以协调靶基因的表达调控^［15］.

原核生物和真核生物都具有金字塔式的等级调控网络，按照调控等级分为全局、中层以及特定转录因子^［16］.全局转录因子是调控水平最高的转录因子，位于金字塔顶端，可同时正向或负向调控含有相应DNA操作区域的多个基因和操纵子的表达^［17］.目前，在大肠杆菌中发现至少7种全局转录因子^［18］，即环AMP受体蛋白（CAMP receptor protein，CRP）、延胡索酸和硝酸盐还原蛋白FNR（fumarate nitrate reduction）、融合宿主因子IHF（integration host factor）、反转刺激因子Fis（factor for inversion stimulation）、厌氧呼吸调控蛋白ArcA（aerobic respiration control protein A）、硝酸盐/亚硝酸盐应答调控蛋白NarL和亮氨酸应答调控蛋白Lrp（Leucine responsive regulatory protein），这些转录因子负责调控大肠杆菌50%以上的基因.特定转录因子通常是调控单个基因转录的蛋白因子^［19］，一般包括转录激活因子和抑制因子，决定着基因表达的时间和空间特异性.根据调控机制的不同，转录因子可以分为正向转录调控因子和负向转录调控因子^［20］.正向转录调控因子通过促进RNA聚合酶与启动子的结合，增强基因的转录活性^［21］；负向转录调控因子则通过阻止RNA聚合酶与启动子的结合或招募抑制蛋白，抑制基因的转录活性^［22］.

1.2 转录因子的调控机制

转录因子的调控机制是其在基因表达调控网络中发挥功能的关键.转录水平的调控通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成，主要指通过反式作用因子结合顺式作用元件影响转录起始复合物形成的过程.

常见的转录调控机制：在转录因子中，DNA结合结构域与启动子序列中的特定序列之间存在亲和力.转录因子结合蛋白后会结合到启动子TATA盒上，形成转录起始复合物.转录因子结合到DNA上后，可以招募RNA聚合酶及其他辅助蛋白质，组建转录起始复合物.该复合物能够识别并结合到基因的转录起始位点，然后启动转录.激活型转录因子通过与共激活蛋白质相互作用来改变染色质结构，从而促进转录起始复合物的装配和转录.而抑制型转录因子则阻碍转录起始复合物的装配或影响转录进程，从而抑制基因的表达^［23］（图1）.

随着研究的不断深入，越来越多转录因子的调控机制被解析.中国科学院上海免疫与感染研究所报道了古菌转录终止因子FttA（factor that terminates transcription in Archaea）依赖型转录终止复合物的三维结构^［24］，揭示了FttA介导古菌RNA聚合酶转录终止的分子机制.FttA结合在RNA退出通道的外侧，使RNA可直接从RNA聚合酶退出通道进入FttA的切割活性中心.FttA首先利用核糖核酸内切酶活性对mRNA进行切割，随后利用外切酶活性进行5'→3'切割mRNA，并沿着mRNA进行5'→3'转位，对转录延伸复合物（transcription elongation complex，TEC）施加机械力，最终使转录终止.Zhu等发现热纤梭菌转录调控因子σ^I具有一种独特的组装和启动子识别机制^［25］，并揭示了σ^I进行启动子特异识别并调控纤维小体基因转录的分子机制.σ^I的C端结构域（SigIC）通过螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）与启动子-35元件的DNA大沟（即启动子上的特异性识别区）结合，结合方式与σ⁷⁰家族其他成员σ₄结构域中HTH在大沟中的结合方式呈现180°的旋转效果.同时，SigIC通过一个保守的组氨酸插入到-35元件的DNA小沟（即启动子中保守的A-tract区域），显示出SigIC端结构域对启动子-35元件的一种独特识别模式.

2 转录因子工程

2.1 转录因子工程

转录因子工程是指通过基因工程手段对转录因子进行设计和改造，以实现对其功能的优化或赋予新的功能.转录因子工程概念并非由单一个体提出，而是随着代谢工程和合成生物学的发展以及对基因表达调控机制的深入理解逐渐形成的.转录因子工程的早期研究主要集中在鉴定和理解转录因子的功能，随着高通量筛选技术和计算生物学的发展，转录因子工程开始进入一个新的阶段.研究人员设计和构建人工转录因子（artificial transcription factor，ATF）^［26］，ATF由DNA结合结构域和效应结构域组成，通过合理组装这些结构域可调控目标基因的表达.近年来，转录因子工程的研究重点逐渐从以基因敲除和过表达为主要策略的静态调控转向构建动态调控系统^［27］，即通过动态调控菌株的碳氮代谢转录网络和氧化还原代谢网络来提高菌株的性能.

2.2 转录因子的表达与调控

转录因子工程的关键环节是转录因子的表达与调控，直接影响转录因子的功能实现和调控基因的表达.为了确保改造后的转录因子在目标细胞中高效且特异性地发挥作用，需精细控制转录因子表达的时间和空间分布，这主要包括对转录因子蛋白表达量^［28］和转录因子与DNA序列结合的调控^［29］.

转录因子通过结合到DNA上的特定序列来调节基因表达，这不仅影响RNA聚合酶的活性，还决定了基因是否会被转录和表达.同源或异源转录因子利用其DNA结合域和活性域的互补性组成多种不同的复合物，这些复合物对于特定基因的调控可能表现出协同作用，即多个转录因子同时作用于同一基因，从而增强基因表达；也可能表现出竞争作用，即不同转录因子竞争结合到同一启动子，从而导致基因表达受到抑制.

2.2.1 转录因子突变

转录因子与DNA上特定序列结合的强弱受到多种因素的影响，如转录因子结合位点的间距、方向、拷贝数和转录因子的翻译后修饰等，其中，突变是一个重要的因素，突变可改变与DNA结合转录因子的结构，进而影响转录因子与DNA的结合强度.具体来说，突变对转录因子与DNA结合的影响主要体现在以下几个方面（图2）.

1）结合亲和力改变.突变可能增强或减弱转录因子与DNA结合位点之间的亲和力.例如，在酿酒酵母中，GAL4转录因子的突变可导致其与DNA结合位点的亲和力发生变化，进而影响糖代谢基因的表达.Zhou等^［30］通过定向进化得到具有改进活性的Gal4蛋白突变体，该突变体促进了GAL启动子驱动基因的转录，导致番茄红素的积累相对于野生型Gal4的高48%.

2）DNA结合特异性改变.突变可能导致转录因子与DNA结合特异性改变.大肠杆菌中LacI，GalR家族转录因子的突变，可改变对乳糖操纵子的调控特异性^［31］，导致转录因子与操纵序列的结合更加紧密或松散，从而增强或减弱了对乳糖操纵子的抑制程度.

3）转录活性变化.突变可能影响转录因子的转录活性，导致功能增强、功能丧失或获得新功能.例如，陈绮艺等^［32］通过同源重组等实验方法，发现转录因子PaPho可以吸收和利用丝状真菌Podospora anserina中P元素，这使PaPho1，PaPho2双突变体中无机磷的含量和酸性磷酸酶的活性比野生型菌株的分别下降25.0%，61.9%.

4）蛋白质稳定性变化.突变可能影响转录因子蛋白质的稳定性，在极寒环境中，微生物需要调整其转录因子以适应低温.例如，冷适应细菌，通过增长外部环状结构的长度、减少脯氨酸的含量降低蛋白质的稳定性，从而提高细菌在低温下的稳定性和活性^［33］.

5）结合位点空间配置的影响.结合位点相对于转录起始位点TSS（transcription start site）的位置，是转录因子功能的关键因素.例如，Cabezas等^［34］在沙门氏菌中通过gTME（global transcriptional regulation engineering）改造ArcA得到突变株Arc-D54.这种突变使ArcA转录因子结合位点发生改变，进而影响下游acrB，tdcB，fadB，cyoE等基因的激活，从而改变微生物的代谢和抗逆性.

转录因子的突变可通过以上机制影响其与DNA的结合能力，从而改变基因表达的调控特性，这不仅有助于理解基因调控的分子机制，还为基于转录因子的代谢工程研究提供了理论基础.

2.2.2 与修饰DNA的互作

通常，转录因子可通过与特异DNA序列基序结合，进而决定基因表达的活性.然而，研究结果显示，与DNA修饰的互作可能阻止转录因子与DNA结合，从而抑制基因的表达^［35］.DNA甲基化通常发生在基因启动子区域的CpG岛上，这种修饰可阻止转录因子与DNA结合，从而抑制基因表达.DNA腺嘌呤甲基转移酶（DNA adenine methyltransferase，Dam）是一种甲基转移酶.Oshima等^［35］对大肠杆菌的Dam缺失突变株进行全局基因调控变化研究，实验结果表明，与野生型相比，在Dam缺失突变株中，一些与有氧呼吸、氨基酸代谢、核酸代谢、鞭毛合成、趋化性和SOS反应相关的基因表达量发生变化，说明这些基因受Dam甲基化调控.综上所述，转录因子与修饰DNA的互作是基因表达调控中的关键环节，通过多种实验技术和生物信息学方法，可深入研究转录因子与修饰DNA的互作机制，为代谢工程和生物技术研究提供理论基础.

3 转录因子工程的应用

转录因子作为基因表达调控网络的重要组成部分，在生物体的转录调控中起着至关重要的作用，转录因子工程也逐渐成为一种强大且应用灵活的工具，被广泛用于微生物工程和代谢工程.研究人员对微生物中的转录因子进行改造和操纵，通过调控特定代谢途径，提高了微生物的抗逆性，增强了产物合成能力并构建了生物传感器.近年来，构建高效的微生物细胞工厂（表1）取得较大进展.

3.1 转录因子工程提高微生物的抗逆性

微生物作为细胞工厂，能够将可再生原料转化成生物燃料、生物材料和化学品等.在生产过程中，菌株常常面临各种胁迫，如极端的温度、pH值、渗透压、氧化压力、有机溶剂、高浓度底物、有毒的产物或副产物等^［3］.在这些胁迫下，菌株的生长性能和代谢活力受到明显抑制，这严重影响了菌株的生产效率.转录因子因可调节多个基因的表达，所以在改善胁迫耐受性等复杂表型方面具有独特的优势.

通过全局转录机器工程（global transcription machinery engineering， gTME）可对全局转录因子进行改造^［52］，建立转录因子基因突变文库，并通过筛选获得目标性能突变株，从而有效提高细胞的代谢活力.中国科学院天津工业生物技术研究所利用碱基编辑技术对酿酒酵母的全局转录因子Spt15进行原位扫描核苷酸突变^［53］，成功提高了酿酒酵母的胁迫耐受性，并解析了Spt15突变影响胁迫耐受性的机理.通过这种方法，获得了多个胁迫耐受性存在差异的Spt15突变菌株，其中，一些突变菌株在高渗透压、高温和乙醇胁迫下的发酵能力提高1.5倍以上. 本课题组利用参与构建的CRISPR可追踪基因组工程（CRISPR-enabled trackable genome engineering， CREATE）技术，通过高通量实验分析23个全局调控因子突变文库与多种工业环境耐受性菌株的突变型-表型关系，结果表明， 31个与耐受性相关的全局调控因子发生新突变，获得耐受最高糠醛质量浓度（4.7 g/L）的大肠杆菌进化菌株，揭示了关键调控因子重要位点突变可大尺度扰动代谢网络以适应复杂环境的机制^［54-55］.

3.2 转录因子工程促进代谢物的生物合成

代谢调控受到基因转录调控、翻译调控及后转录调控等多方面的影响，其中，转录调控由于涉及多种转录因子、辅助因子、表观遗传修饰和染色质结构的变化，具有同时调节多个基因或实现动态基因调控的特点.近年来，对转录因子进行设计、改造并将其用于目标产物合成途径与代谢网络的调控，越来越受到人们的关注.转录因子工程通过改造微生物的转录调控网络，实现对微生物代谢途径的大尺度扰动，进而获得产品合成的最佳代谢状态，从而提高产品的生产性能.

通过构建人工转录因子（artifical transcription factor， ATF），合理组装DNA结合结构域（DBD）和效应结构域（ED），可更精细地调控基因表达或定量评估目标产物.例如，通过构建包含不同DBD，ED的ATF文库，可筛选出更高生产能力的菌株^［27］.如Naseri等在酵母中构建了一个与异源AD相偶联、来自拟南芥的一段基序或完整转录因子的人工转录因子库^［56］.该人工转录因子库与含有相应同源结合位点的启动子共同构成“正交开关”，可高效调控目标基因转录.同时，研究者还利用该人工转录因子库，创建了一种高通量组装方法COMPASS，通过这种正交转录方法可平衡多个基因的表达，并解耦生长和生产两种状态，从而实现酿酒酵母中目标产物产量的增加.陈坚院士团队刘龙教授课题组通过转录因子工程提高N-乙酰氨基葡萄糖的效价^［57］，通过表达组合突变型转录因子RamAM，GlcNAc（N-acetylglucosamine，N-乙酰氨基葡萄糖）的摇瓶效价提高到16 g/L.同时，进一步通过转录组测序及等温滴定量热（lisothermal titration calorimetry，ITC）实验解析突变菌株高产GlcNAc的原因.又在谷氨酸棒杆菌中开发了基于dCpf1的CRISPRi（CRISPR interference）系统，发现转录因子RamB，LldR，FruR，AmtR对GlcNAc的产生具有负向调节作用.CRISPRi系统干扰这些转录因子的表达，使GlcNAc的效价进一步提高至27.5 g/L.由此可见，转录因子工程在促进代谢物的生物合成中发挥着关键作用.

3.3 转录因子工程构建动态调控系统

转录因子工程在构建动态调控系统中的应用，主要是利用转录因子的多点调控和动态调控优势来实现对微生物代谢途径的全局性、高效性及特异性动态调控.为了实现动态调节，通常需要设计和构建生物传感器^［58］，以实现相关代谢途径的自发和动态调节.微生物利用环境传感元件来感知信号因子的变化，以动态调整代谢活动并改善生命活动.因此，通过构建基于转录因子的代谢物生物传感器动态控制系统，并根据细胞环境变化对代谢通量进行实时调控，可有效提高目标代谢物产量且不损害细胞生长.

动态调控系统能够响应特定浓度的代谢物信号^［59］，并将信号转换为特定信号输出，如荧光信号或生长速率信号，从而在代谢工程和合成生物学中发挥重要作用.例如，通过构建基于转录因子的生物传感器，可实现对目标代谢物浓度的实时监测和控制.将这些生物传感器用于高通量筛选，可从大量的变异体中筛选出高效生产的菌株.Xu等^［50］在枯草芽孢杆菌中设计并构建丙酮酸响应基因遗传回路，即基于大肠杆菌来源的丙酮酸响应转录因子PdhR，设计并构建丙酮酸响应基因回路，通过突变和改变 PdhR 在启动子上的结合序列与位置，优化丙酮酸响应基因回路的动态范围，并测试所构建基因回路的正交性和响应阈值.此外，还利用反义转录机制构建丙酮酸抑制型基因回路，并通过高通量筛选技术成功构建受胞内丙酮酸诱导的双功能基因回路.通过分别动态下调糖酵解和磷酸戊糖途径中的pgi，zwf基因，动态上调葡萄糖二酸合成途径中的ino1基因，葡萄糖二酸的滴度提高了154%.

此外，基于转录因子的动态调控系统还被用于自适应实验室的进化选择和动态控制，通过实时调控代谢通量，可有效提高目标代谢物的生产效率.Kim等^［60］开发了一种基于皮氏罗尔斯顿菌（Ralstoniapickettii） 的TbuT转录调控因子异戊二烯生物传感器.在这个系统中，TbuT转录调控因子被结合到特定的DNA序列上，以调控与异戊二烯合成相关的基因表达.当异戊二烯的浓度变化时，TbuT的结合活性可能受到影响，进而影响TbuT调控基因的表达水平.而绿色荧光蛋白GFP（green fluorescent portein）作为报告基因，其荧光强度的变化可以间接反映异戊二烯浓度的变化，可为研究人员提供一种直观、实时的监测方法.

4 结论与展望

研究人员通过对转录因子进行设计、合成和修改，实现了对微生物特定代谢途径的调控，从而提高了目标产物的产量等.随着研究的深入，转录因子工程逐渐涉及更广泛的领域，不仅可用于调控单个代谢途径或特定基因的表达，还可实现对整个代谢网络的重塑和优化.通过系统生物学方法，可建立微生物的转录调控网络模型，从而更好地理解转录因子在微生物代谢中的作用机制.同时，随着高通量测序技术和基因编辑技术的不断完善，转录因子工程的研究也迎来了新的发展机遇.

然而，在微生物转录因子工程的研究中还存在一些问题和挑战.由于代谢网络的复杂性，许多转录因子的功能和调控机制仍然不清楚，需要进一步研究其调控机制和相互作用网络.此外，尽管已经发现大量微生物细胞调节核心元件的功能和维持机制，但仍需要充分了解具体的过程和调节机制，以构建参与环境应激反应转录调控的特定调节元件或感觉元件.在这方面，未来的研究应侧重于基因和转录因子蛋白的协调调控机制，通过转录组学技术研究转录调控网络的变化、环境胁迫激活基因及其表达的精确分子机制等.此外，目前生物传感器存在可使用的转录因子少、对代谢物的反应阈值窄、调节范围有限及调节时间不确定等问题，这限制了生物传感器在代谢工程中的高效应用.未来可基于高通量筛选和底物相似性筛选策略，拓宽转录因子底物及响应范围，从而进一步拓宽生物传感器的种类.基于计算仿真和蛋白质工程方法的合理设计，开发在不同浓度和强度范围内能够自由响应的生物传感器，并探索更精确的调整次数和节点，调整传感器响应阈值的范围，以为传感器的动态控制研究提供新思路.因此，未来的工作需要致力于构建精密度更高的转录因子生物传感器，以更准确地检测代谢物的浓度、改变代谢物的特异性，并为构建更复杂的遗传回路提供全面的数据资源.

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(NSFC-22278312)

宁夏回族自治区中央引导地方科技发展专项基金资助项目(2024FRD05057)

宁夏重点研发基金资助项目(2024BEE02005)