模拟水环境中Fe²⁺浓度促进抗生素抗性基因的接合转移

Promotion of Antibiotic Resistance Gene Conjugative Transfer by Fe²⁺ Concentration in Simulated Aquatic Environments

摘要

聚焦模拟水环境中Fe²⁺对RP4质粒介导的接合转移的影响及其作用机制，分析Fe²⁺对供（受）体细胞氧化应激、膜通透性调控及ATP合成等反应过程的影响。结果表明，模拟水环境中，Fe²⁺对大肠杆菌活性有抑制作用，且抑制程度与Fe²⁺浓度相关，当ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L时，Fe²⁺促使抗生素抗性基因ARGs（antibiotic resistance genes）的接合转移频率提升0.48倍，而高浓度Fe²⁺则显著抑制该过程，并呈现出浓度依赖趋势。在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，Fe²⁺提高了细胞活性氧物种（reactive oxygen species，ROS）及相关酶的水平，增强了膜通透性，增加了细胞接触频率，促进了ATP合成，从而加速了ARGs的接合转移发生。研究揭示了水环境中Fe²⁺在促进ARGs水平转移方面的规律和机制，可为ARGs的环境风险评估与防控研究提供理论支持。

Abstract

This study focuses on the impact of Fe²⁺ on RP4 plasmid-mediated conjugative transfer in simulated aquatic environments and its underlying mechanisms. The effects of Fe²⁺ on oxidative stress， membrane permeability， and ATP synthesis in donor， and recipient cells were analyzed. The results show that Fe²⁺ inhibits the activity of Escherichia coli in the simulated aquatic environment， with the degree of inhibition being positively correlated with Fe²⁺ concentration. When the concentration of Fe²⁺（ρ（Fe²⁺）） was 0.64 mg/L， Fe²⁺ promoted a 48% increase in the frequency of antibiotic resistance gene（ARG） conjugative transfer， while higher concentrations of Fe²⁺ significantly inhibited this process in a concentration-dependent manner. At ρ（Fe²⁺）= 0.64 mg/L， Fe²⁺ enhanced the levels of reactive oxygen species（ROS） and related enzymes， increased membrane permeability and cell contact frequency， and promoted ATP synthesis， thereby accelerating the occurrence of conjugative transfer. This research reveals the patterns and mechanisms by which Fe²⁺ promotes the horizontal transfer of ARGs in aquatic environments， providing theoretical support for environmental risk assessment and management of ARGs.

Graphical abstract

关键词

抗生素抗性基因 / Fe²⁺ / 接合转移 / 影响机制

Key words

antibiotic resistance genes / Fe²⁺ / conjugative transfer / mechanism of influence

抗生素具有预防疾病和促进动物生长的效果，被广泛用于畜禽养殖。但由于抗生素在动物体内代谢不完全，大量抗生素以原药或代谢产物形式排出，进入环境后难以降解，促使环境微生物产生抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs），加速耐药菌演化，带来潜在生态风险^［1-2］。据统计，2019年全球因耐药菌感染导致的死亡人数达127万。世界卫生组织已将抗生素耐药性列为十大公共卫生威胁之一，预计到2050年，与其相关的死亡人数将超1 000万^［3］。ARGs主要通过整合质粒、转座子、整合子和噬菌体等可移动遗传元件，以转导、转化和接合3种方式水平转移^［4-5］。其中，接合是最常见的基因转移机制，通过形成“接合桥”完成基因转移^［6］。近年来，受矿山开采、金属冶炼、大气沉降及农业活动等影响，全球多地面临不同程度的重金属污染，我国土壤、水体和大气均受到波及^［7］。重金属污染不仅危害人体呼吸、免疫与神经系统，还常与抗生素、农药等形成复合污染物，进而产生更复杂的毒理效应，严重威胁生态与人类健康。sul基因常位于质粒或整合子上，易通过水平转移扩散。研究结果显示，某些重金属（如Hg， Zn， Cu）可通过施加选择性压力促进此类基因传播，导致ARGs含量显著增加^［8］。此外，抗生素与金属离子可络合形成毒性更强的污染物，对微生物和藻类产生协同毒性。复合污染的主导作用不容忽视，亟需关注其对环境与生物安全的潜在风险^［9］。研究结果显示，重金属对ARGs的传播具有显著促进作用^［10］。张淑红等^［11］指出，重金属胁迫是ARGs扩散和转移的重要驱动因素。例如，亚抑制浓度的Ag⁺可依赖性地促进大肠杆菌内ARGs的接合转移^［12］，而V³⁺，Hg⁺，Ca²⁺等在一定浓度下可增强海洋光杆菌与大肠杆菌间的转移频率，且在抑制浓度下，可显著降低该频率^［13］。水体中常见的金属Fe²⁺，因在抗性控制方面表现出正面效应而受到关注。研究结果显示，Fe²⁺不仅在污泥水热处理过程中能显著促进ARGs的削减，还通过调控细胞内氧化还原状态，影响细菌活性与基因水平转移^［14］。相比之下，Cu²⁺在亚抑制浓度下可促进RP4质粒接合转移，而Cd²⁺则随着浓度升高而抑制该过程^［15］。此外，重金属还诱导细菌群落间ARGs的转移频率和抗性水平提升，进而促进ARGs在环境中扩散与增值。

ARGs在环境中的传播主要依赖于水平基因转移（horizontal gene transfer， HGT），其中，接合转移方式具有高效率和广泛适应性，被认为是最关键的传播途径。金属离子作为普遍存在的环境因子，可能在ARGs的迁移扩散过程中发挥重要调控作用。目前，相关研究多聚焦金属离子的毒性效应，而对金属离子在细胞膜通透性变化、供（受）体细胞接触效率及能量代谢调控等接合转移关键环节中的作用，关注较少。此外，多数实验采用远高于环境背景值的金属离子浓度，可能夸大了其生态影响，限制了研究结果在真实环境中的适用性。作为微生物必需的微量元素及氧化还原过程的核心介质，Fe²⁺在ARGs接合转移中的潜在作用尚未被系统揭示。因此，文中以RP4质粒为模型，系统评估Fe²⁺在环境相关质量浓度（未污染）与污染质量浓度下，对ARGs接合转移频率的影响和潜在机制，以期为金属离子介导ARGs传播的环境行为研究提供理论依据。

1 实验方法

1.1 细菌活化

供体菌株为携带RP4质粒的大肠杆菌DH5α，具有氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）和四环素（Tet）耐药性；受体菌株为具有链霉素（Str）抗性的肠产毒素性大肠埃希菌（ETEC），这两个菌株均购自北京百灵威生物技术有限公司。分别将上述菌株置于LB液体培养基中，于37℃、120 r/min下培养过夜至对数生长期，离心分离（离心力（F）为5 000g）10 min，收集菌体。细胞经磷酸盐缓冲液（PBS，pH =7.2）洗涤3次，通过重悬操作调整菌株浓度至初始浓度，即10⁸ cfu/mL（D₆₀₀ ≈ 0.8~1.0），备用。

1.2 细菌灭活和接合转移

为模拟不同水环境中Fe²⁺对细菌活性和基因水平转移的影响，分别进行细菌灭活与接合转移实验。在灭活实验中，将20 mL供体菌液加入组培瓶，再分别加入ρ（Fe²⁺）=0，0.64，1.28，3.20 mg/L，混匀后置于37 ℃、120 r/min摇床中培养16 h。ρ（Fe²⁺）的设置参考中国地表水环境质量标准，其中， ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L为环境相关水平（未污染），ρ（Fe²⁺）=3.20 mg/L则为污染情景。培养完成后，菌液经PBS缓冲溶液梯度稀释。取100 μL稀释液（约10² cfu/mL）平板涂布于LB固体培养基，在37 ℃培养24 h。计数菌落数并采用直接计数法计算细菌灭活率。所有实验均设置3组平行实验，结果取平均值。

在接合转移实验中，将供体菌液与受体菌液按体积比为1∶1混合，并构建模拟水环境条件下的PBS缓冲体系（pH=7.4）。再分别加入ρ（Fe²⁺）=0，0.64，1.28，3.20 mg/L，混匀后于37 ℃培养16 h。培养结束后，将混合液接种至含10 mg/L Tet、50 mg/L Kan和100 mg/L Amp的选择性LB琼脂平板。计数抗性转化菌落，并计算接合转移频率 ^［16］。为探究ROS在Fe²⁺影响接合转移过程中的潜在作用，在部分实验组中添加100 μmol硫脲作为ROS捕获剂。接合转移频率（f）的计算式：

f=\frac{\rho }{{\rho }_{\mathrm{t}}}\mathrm{。}（1）

式中：ρ，ρ_t分别为接合子细胞、总受体细胞的浓度（cfu/mL）。

1.3 活性氧物种(ROS)和酶活性

使用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测供体菌与受体菌内ROS水平^［17］。将菌液（ρ=10⁸ cfu/mL）与c（DCFH-DA）=20 μmol/L在避光条件下培养30 min，随后用PBS清洗两次去除多余染料。以50 mg/L Rosup为阳性对照、以Milli-Q水为阴性对照。荧光强度（λ_ex=488 nm，λ_em =525 nm）用酶标仪测定，实验重复3次。

取1.0 mL细菌培养液，离心分离（F=8 000g）10 min。回收细胞，再经PBS洗涤后加入细胞裂解液。离心分离（F=10 000g）5 min，取上层清液进行超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性与过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测。相关操作依据商品化试剂盒说明书进行^［18］。

1.4 丙二醛

丙二醛（Malondialdehyde， MDA）浓度反映了细胞膜脂质过氧化程度^［19］。向1.0 mL菌液中加入硫代巴比妥酸，超声破碎，在4 ℃离心分离（F=10 000g）5 min。将上层清液在沸水浴中加热60 min，冷却至室温后，再次4 ℃离心分离（F=10 000g）10 min。分别测定λ=450，550 nm时的光密度D，进而计算MDA浓度c（10^-13 mol /^L）。

c=\frac{(D_{\mathrm{450}}–D_{\mathrm{550}})}{\epsilon \times L}\times \frac{V_{\mathrm{1}}}{V_{\mathrm{2}}}\times n\mathrm{。}（2）

式中：\epsilon为复合物的摩尔吸光系数（通常为 1.53×10⁵ L/（mol·cm））；L为比色皿的光径（cm，通常为1 cm）；V₁为反应体系总体积（mL）；V₂为加入反应体系中的样本体积（mL）；n为样本稀释倍数。

1.5 黏附性和疏水性

加入不同质量浓度Fe²⁺后，将菌液离心分离（F=4 500g）5 min、洗涤两次，在540 nm处检测上层清液的光密度（D₀）。沉淀经涡旋混匀，再次测定上层清夜的光密度（D₁），黏附率（r）的计算式为

r =（D₁‒D₀）/D₁。（3）

疏水率测定，将1 mL二甲苯加入4 mL菌悬液，剧烈混匀1 min，于37 ℃水浴中静置30 min，检测上层清液在600 nm处的光密度（D₁），计算式为

D=（D₀‒D₁）/D₀。（4）

所有实验数据均以“平均值-标准差”表示，采用SPSS 21.0进行单因素方差分析，显著性水平设定为p<0.05。图表绘制在Excel 2019，Origin 2025中完成。

2 实验结果与讨论

2.1 Fe²⁺对大肠杆菌活性与基因转移的影响

不同ρ（Fe²⁺）对大肠杆菌浓度（ρ₀）的影响见图1（a）。与对照组相比，ρ（Fe²⁺）= 0.64 mg/L时对大肠杆菌生长的影响不显著（p>0.05），ρ₀=7.89×10^‒5 cfu/mL。但在ρ（Fe²⁺）=1.28，3.2 mg/L下，ρ₀显著下降，分别下降至5.65×10^‒5，4.31×10^‒5 cfu/mL，较对照组分别减少了29.46%，46.19%，说明ρ（Fe²⁺）在超过一定限值时，对大肠杆菌生长表现出显著的抑菌作用（p<0.05）。

研究结果显示，Fe²⁺对细菌的抑制作用主要与其诱导的氧化应激过程相关^［20］。Fe²⁺作为具有强氧化还原活性的金属离子，可参与Fenton或类Fenton反应生成羟基自由基（·OH），进而诱发细胞内ROS积累，造成脂质过氧化、蛋白质氧化修饰及细胞膜损伤，最终导致细菌死亡^［20-23］。当环境中ρ（Fe²⁺）处于高浓度时，大肠杆菌的蛋白表达水平、抗氧化酶活性（如LPO）明显降低，细胞修复能力受限，进而影响细菌存活^［24］。

Fe²⁺对细菌接合转移频率（f）也表现出浓度依赖性的双重调控作用（图1（b））。在环境相关浓度（ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L）下，RP4质粒的f显著高于对照组，可以达到6.3×10^-6，提升约0.48倍，提示在该浓度下，Fe²⁺具有促进ARGs转移的潜力。然而，随着ρ（Fe²⁺）升高至1.28，3.2 mg/L，f分别下降至3.32×10^-6，8.51×10^-7，较对照组分别下降约0.22，0.80倍（p＜0.05）。该实验结果显示，在高ρ（Fe²⁺）下，Fe²⁺对ARGs的水平转移具有显著抑制作用。这种趋势可能与高浓度下ROS过度积累引发细胞严重损伤有关。

2.2 氧化应激和细胞膜通透性

细胞内ROS水平是诱导SOS反应（应急性修复机制）的关键因素之一，其变化对ARGs的水平转移有重要影响^［25-27］。加入不同ρ（Fe²⁺），ROS质量浓度总体呈现出先增加后减少的趋势，存在浓度依赖性（图2（a））。与对照组相较，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L时，Fe²⁺可诱导细胞产生大量ROS，使ROS质量浓度达35.45 μg/mL（p<0.05）。同时，Fe²⁺引起CAT，SOD的活性显著升高（图2（b）~图2（c）），说明Fe²⁺可通过激活氧化应激通路增大f^［28-29］。

此外，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下添加ROS捕获剂（图3（a）），细胞内ROS水平显著下降（p＜0.05），f随之降低（图3（b）），进一步验证了ROS在ARGs转移调控中的作用^［29］。

Fe²⁺诱导生成的过量ROS还会破坏细胞膜的完整性。MDA质量浓度随着ρ（Fe²⁺）也呈现出先增加后减少的趋势（图2（d））。在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，MDA的质量浓度升高0.3倍，表明膜脂质过氧化反应增强（p<0.05）。研究结果显示，MDA质量浓度的增加与细胞膜损伤程度呈正相关^［28］。该实验结果显示，ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L可增强细胞膜通透性，进而为ARGs的转移提供了条件。

因此，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，Fe²⁺可通过诱导ROS生成和调控细胞膜通透性，促进ARGs水平转移；但当ρ（Fe²⁺）升高至阈值以上，ROS积累引发细胞不可逆损伤，导致细胞死亡（图1（a）），从而终止ARGs转移。

2.3 细胞间接触

供体细胞与受体细胞之间的紧密接触是实现接合转移的前提^［30］。胞外聚合物（extracellular polymeric substances， EPS）主要由蛋白质、多糖、DNA和脂质构成，不仅有助于生物膜结构发育，还可增强细菌的附着能力并提供保护屏障^［31］。EPS通过调控细胞表面电荷及其黏附特性，影响细胞间的物理接触^［32］。

加入不同ρ（Fe²⁺）后，细胞间接触变化见图4。与对照组相比，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，大肠杆菌细胞中蛋白质与多糖的质量分数比值（w（PN）/w（PS））最高（图4（a）），升高0.78倍。同时，该条件下细胞之间的黏附性和疏水性分别增加0.86，1.21倍（p<0.05），与w_PN/w_PS的变化一致（图4（b）~4（c））。研究结果显示，ROS的生成可上调细菌上外膜蛋白的关键基因表达，同时诱导EPS产生^［33］。外膜蛋白表达上升可促进膜孔形成，为供体细胞附着和进入受体细胞创造通道，从而增加ARGs的接合转移可能性^［34］。

此外，通过细胞膜水力学直径可判断膜流动性和物质迁移能力。在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，细胞的水力学直径达1 388 nm，与对照相比，升高0.34倍，进一步表明，Fe²⁺增强了细胞间的物理接触（图4（d））。水力学直径的变化趋势与接合转移频率高度一致，说明在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，Fe²⁺可有效促进供体细胞与受体细胞结合，从而加速ARGs转移。

2.4 能量驱动及其机理

在细菌接合转移过程中，RP4质粒需依次经历复制、分配和转移等阶段，整个过程以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）为能量来源。ATP的供能能力越强，f也越高^［35-36］。不同ρ（Fe²⁺）下供体细胞与受体细胞内ATP质量含量的变化趋势见图5。随着ρ（Fe²⁺）的增大，细胞内ATP质量含量呈先上升后下降的趋势。在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，细胞内的ATP质量含量显著高于对照组，增加了1.1×10^-14 μmol/cell。而随着ρ（Fe²⁺）=1.28，3.2 mg/L，ATP质量含量分别下降0.29，0.64倍，该趋势与f变化一致（p<0.05）。研究结果显示，RP4质粒上的全局调控基因、系统基因及与DNA复制和转录相关的基因均参与接合过程^［37］。在低质量浓度ρ（Fe²⁺）下，全局调控基因受到抑制，而系统基因及mRNA的表达水平则上调，促进了蛋白质合成，提高了胞内ATP质量含量，从而促进ARGs接合转移发生^［38-39］。

综合看， Fe²⁺通过多种机制影响细菌间的接合转移。ROS质量浓度的增加，被认为是驱动ARGs传播的关键因素：一方面，Fe²⁺通过诱导氧化胁迫产生大量ROS，进而激活细胞内SOS反应及相关基因表达，增强细胞膜通透性并提高细胞间接触概率，从而促进ARGs转移；另一方面，ROS还通过调控基因表达，诱导蛋白质和DNA合成，提升细胞内ATP质量含量，从而从能量层面驱动ARGs接合转移发生（图6）。

3 结论

模拟水环境中，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，ARGs转移频率提高0.48倍；而在ρ（Fe²⁺）=3.2 mg/L下，ARGs转移频率则降低0.80倍。机制研究结果显示，在ρ（Fe²⁺）=0.64 mg/L下，Fe²⁺通过诱导ROS生成、增强细胞膜通透性、促进供受体细胞接触以及影响ATP合成等多途径，协同调控ARGs接合转移过程。该研究结果揭示Fe²⁺在ARGs传播中的浓度依赖性调控机制，为分析水环境中金属离子介导的ARGs扩散提供了理论依据，并为ARGs的控制策略制定提供了重要参考。

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基金资助

宁夏重点研发计划基金资助项目(2023BSB03019)

宁夏重点研发计划基金资助项目(2023BEG02047)

国家自然科学基金资助项目(42377388)

宁夏银川中小企业创新发展专项基金资助项目(2024ZXHZC002)

宁夏自然科学基金资助项目(2023AAC05004)