一种近红外AIE荧光探针用于肿瘤脂滴成像及光动力治疗研究

A Near-Infrared AIE Fluorescent Probe for Tumor Lipid Droplet Imaging and Photo Dynamic Therapy

摘要

聚集诱导发光（aggregation induced emission，AIE）材料凭借其独特的光学特性与结构可调控性，在生物医学领域展现出巨大的应用潜力。针对当前恶性肿瘤诊疗的严峻形势，AIE材料在肿瘤诊疗中表现出优异性能。该研究聚焦AIE诊疗剂的设计制备及其生物医学应用探索，通过 Knoevenagel 缩合反应合成TTM荧光分子，并对其相对分子质量及光物理特性进行表征测试。随后，利用纳米自组装技术对其进行包覆，制备得到纳米粒子（TTM NPs），系统测试其粒径大小与稳定性，并通过细胞毒性实验、共聚焦成像、CCK-8法及活死细胞染色等实验，评估其细胞摄取行为及光动力治疗（PDT）效果。结果表明，TTM 分子被有效合成，且具有优异的AIE性能； TTM NPs 则具备适宜的药物递送粒径、良好的稳定性、高效的活性氧（ROS）生成能力、较低的生物毒性、优良的荧光成像特性和显著的PDT疗效。综上，该研究成功合成了AIE纳米诊疗剂TTM NPs，其优异的抗肿瘤效果为AIE材料在生物医学领域的应用提供了重要的理论依据，未来有望在临床研究中发挥重要价值。

Abstract

Aggregation Induced Emission （AIE） materials have demonstrated significant potential in the biomedical field due to their unique optical properties and structural tunability. Addressing the current challenges in cancer diagnosis and treatment， AIE materials exhibit remarkable performance in oncological applications. This study focuses on the design， synthesis， and biomedical applications of AIE theranostic agents. The TTM fluorescent molecule was synthesized via the Knoevenagel condensation reaction， and its molecular weight and photophysical properties were characterized. Subsequently， nano-self-assembly technology was employed to encapsulate the molecule into nanoparticles （TTM NPs）. The hydrodynamic diameter and stability of TTM NPs were evaluated， and their cellular uptake behavior and photodynamic therapy （PDT） efficacy were assessed through cytotoxicity assays， confocal imaging， CCK-8 assays， and live-dead cell staining. The results show that the TTM molecules were successfully synthesized and exhibited excellent AIE properties. Furthermore， TTM NPs demonstrated an appropriate size for drug delivery， good stability， efficient reactive oxygen species （ROS） generation， low biotoxicity， favorable fluorescence imaging characteristics， and notable PDT efficacy. In conclusion， this study successfully synthesized the AIE nanotheranostic agent TTM NPs， whose superior antitumor effects provide important theoretical support for the biomedical applications of AIE materials， and are expected to hold significant value in future clinical research.

Graphical abstract

关键词

聚集诱导发光 / 荧光成像 / 光动力治疗 / 恶性肿瘤

Key words

aggregation-induced emission / fluorescence imaging / photodynamic therapy / malignant tumors

癌症是源于上皮组织的恶性肿瘤，对人类的生命健康造成了极大的危害和影响^［1-2］。近年来，生物成像引导的光动力治疗（photodynamic therapy， PDT）作为一种新型微创肿瘤治疗方法^［3-4］，凭借快速高效、创伤小、成本低等显著优势，可实现肿瘤的高效可视化诊断及多位一体化精准治疗^［5-6］，在肿瘤诊疗领域展现出广阔应用前景^［7-9］。光动力治疗是基于光、光敏剂和氧气之间的相互作用的一种疾病治疗方式^［10-11］，其原理是光敏剂（photosensitizer，PS）在特定波长激发光的激活下，局部产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），后者可氧化或破坏生物分子以杀死肿瘤细胞，达到抗肿瘤效果^［12-13］。在光动力治疗过程中，光敏剂是其中的关键要素，对光敏剂的优化设计是提高光动力治疗效果的有效措施^［14-15］。

在过去几十年的研究中，光敏剂的开发取得了长足的进展^［16］。然而，传统光敏剂存在聚集诱导猝灭（aggregation-caused quenching，ACQ）效应、易光漂白、背景信号高、组织穿透深度浅和活性氧产率低等缺陷，限制了其在生物医学领域的广泛应用。2001年，唐本忠团队提出了聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）的概念，即AIE分子在稀溶液中不发光或发光强度较弱，而在高浓度或聚集状态下发光效果显著增强^［17-18］，这在很大程度上克服了传统光敏剂的ACQ效应。因此，基于AIE特性的新型纳米诊疗剂的开发，引起了研究者们的广泛关注和深入研究^［18-21］。

本研究通过Knoevenagel缩合反应合成了具有AIE特性的三苯胺基荧光分子（TTM），利用质谱技术验证了该分子的有效合成，并测定了其紫外吸收光谱、荧光发射光谱及AIE特性。为增强TTM分子的生物安全性和生物相容性，采用纳米共沉淀技术将其组装形成TTM纳米粒子（nano particles， NPs），通过测定其水合粒径、Zeta电位和细胞毒性，初步明确了其生物应用潜力。最后，在MDA-MB-231细胞中探究了TTM NPs的细胞摄取能力及抗肿瘤效果（如图1所示）。

1 实验方法

1.1 TTM 的合成与表征

将5'-（4-（二苯基氨基）苯基）-［2，2'-联噻吩］-5-甲醛（TTC）、丙二腈和三乙胺在25 ℃下搅拌反应24 h后，经旋蒸法除去溶剂后，采取柱层析法纯化，得到红褐色固体（即TTM）。将TTM固体溶解于乙醇中，通过质谱技术测定其相对分子质量；同时，将TTM固体溶解于乙醇/正己烷混合溶液（体积分数为f_h）中，分别测定 f_h在 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%时溶液的荧光光谱，通过其荧光发射强度的变化分析AIE性能。

1.2 TTM NPs的制备

分别称取TTM样品15.7 mg和DSPE-PEG 230.3 mg置于蒸馏瓶中，加入四氢呋喃（THF）使其溶解并混匀，超声处理30 min。连接冷凝装置，设定旋蒸仪水温为45 ℃、转速为58 r/min，旋蒸至蒸馏瓶中液体呈半干状态时停止旋蒸。向蒸馏瓶中加入40 mL蒸馏水，再次超声至样品完全溶解，随后用滴管转移至经活化处理的透析袋中，排尽袋内气泡后用夹子密封，透析24 h。最后通过0.22 μm滤膜过滤，收集到的滤液即为制备完成的TTM NPs^［22］。采用动态光散射仪（DLS）测定TTM NPs的水合粒径分布和Zeta电位。

1.3 单线态氧产率检测

采用化学法测定TTM NPs的单线态氧（¹O₂）产率。以9，10-蒽基-二丙酸二钠盐（Disodium-9， 10-anthracendipropionic acid，Na₂-ADPA）作为¹O₂捕获剂，玫瑰红（Rose Bengal，RB）作为标准光敏剂。分别取1 mL相同浓度的TTM NPs水溶液与RB水溶液，各加入1 mL Na₂-ADPA 溶液，充分混合后，在白光照射下分别于不同时间点（0，60，120，180，240，300，360，420，480，540，600 s）进行检测。使用紫外分光光度计记录Na₂-ADPA在380 nm附近的最大紫外吸收强度随着光照时间的变化，最终依据公式Φ_NPs=Φ_RB×K_NPs×A_RB/（K_RB×A_NPs）计算¹O₂产率。其中，Φ_NPs和Φ_RB分别为TTM NPs和RB的¹O₂产率，K_NPs和K_RB分别为TTM NPs和RB体系中Na₂-ADPA的降解常数，A_NPs和A_RB分别为TTM NPs和RB在激发光波长下的紫外吸收值^［23］。

1.4 细胞毒性实验

选用MDA-MB-231和MCF-7细胞，通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验评估纳米粒子的细胞毒性。将细胞以5×10⁵ cells/cm²的密度种植于96 孔板中，在37 ℃恒温培养箱培养过夜。更换为含不同浓度TTM NPs（2.5，5，10，20，40，80 μg/mL）的DMEM培养基，孵育细胞24 h后，换用CCK-8试剂继续孵育 45 min，最后利用酶标仪测定492 nm处的吸收强度，据此评估细胞活力^［24］。

1.5 细胞成像实验

将MDA-MB-231细胞以 1×10⁴ cells/cm² 的密度接种于共聚焦皿中，培养至细胞贴壁后，更换为含TTM NPs的培养基，分别与细胞共孵育2，4，6，8 h，随后利用激光共聚焦显微镜成像，检测不同时间点细胞对TTM NPs的摄取情况。以相同方法将细胞接种于共聚焦皿中，加入含TTM NPs 的培养基与细胞共孵育6~8 h后，弃去培养基；加入细胞核、线粒体、溶酶体及脂滴特异性探针（分别为Hoechst 33258、Mito-Tracker Green、Lyso-Tracker Green、BODIPY 493/503）孵育 45 min，用PBS缓冲液洗涤2~3次，更换为无血清无色DMEM培养基，通过激光共聚焦显微镜成像观察细胞对TTM NPs的摄取及定位情况^［25］。

1.6 光动力治疗效果评估

将生长状态良好的MDA-MB-231细胞接种于96 孔板中培养过夜，弃去原培养基，加入含不同浓度TTM NPs的新鲜DMEM 培养基；孵育8 h后移除培养基，在60 mW/cm²光照强度下照射细胞10 min，更换新鲜DMEM培养基继续孵育 8~12 h。随后每孔加入10 μL CCK-8试剂与90 μL无色 DMEM 培养基的混合液，孵育45 min后，用酶标仪测定细胞活力。此外，将MDA-MB-231细胞接种于共聚焦皿中，加入含不同浓度TTM NPs的新鲜DMEM培养基孵育8 h（与前文孵育时间保持一致），在60 mW/cm² 光照强度下照射10 min，更换新鲜DMEM培养基继续孵育3 h。最后用 Calcein-AM（钙黄绿素-乙酰甲氧基甲酯）与 Propidium Iodide（碘化丙啶）共染30 min，经PBS缓冲液洗涤后成像，用于检测细胞活力。

2 结果与讨论

2.1 TTM 分子的合成及其光学性能的表征

TTM分子由5'-（4-（二苯基氨基） 苯基）-［2，2'-联噻吩］-5-甲醛（TTC）与丙二腈通过Knoevenagel 缩合反应合成。经核磁共振氢谱（¹H NMR）确认其结构，数据如下：¹H NMR （500 MHz， CDCl₃） δ 7.79 （s， 1H）， 7.68~7.67 （m， 1H）， 7.52~7.50 （m， 2H）， 7.45~7.44 （m， 1H）， 7.36~7.30 （m， 6H）， 7.19~7.11 （m， 8H）。为验证 TTM（C₃₀H₁₉N₃S₂）的分子量，采用质谱仪进行检测，结果显示其相对分子质量为 485（如图2所示），与理论计算值基本一致。

随后，将少量TTM固体溶解于乙醇中，通过紫外分光光度计和荧光光谱仪测定其分子的紫外吸收光谱和荧光发射光谱（图3）。结果显示，TTM的紫外吸收峰位于510 nm处（图3（a）），荧光发射峰位于830 nm处（图3（b））。这表明TTM分子具有优良的光学特性，其发射波长可覆盖近红外区域。

此外，为探究TTM分子的聚集诱导发光（AIE）特性，在不同体积比的乙醇/正己烷混合溶剂中对其荧光发射光谱进行了测定。结果显示，随着不良溶剂（正己烷）比例的增加，即TTM分子的聚集程度逐渐升高，其荧光发射强度也随之增强。这表明该纳米颗粒（TTM分子）具有优异的AIE特性（如图4所示）。

2.2 TTM NPs制备及其水合粒径检测

为推动TTM分子在生物体系中的高效应用，采用纳米共沉淀法，将TTM分子与包封剂DSPE-PEG₂₀₀₀复合，通过制备得到TTM纳米颗粒（TTM NPs）。为明确TTM NPs的粒径特征和稳定性，通过动态光散射仪（DLS）测定其水合粒径和Zeta电位（图5）。结果显示，TTM NPs水溶液的水合粒径约为80 nm（图5（a）），Zeta电位为-34.41 eV（图5（b））。上述测试结果表明，TTM NPs具有适宜的药物递送尺寸和良好的稳定性。

2.3 光激活下的ROS生成能力测定

活性氧产率（ROS）是评估纳米诊疗剂光动力治疗效果的关键指标，直接决定其能否有效发挥治疗作用。因此，采用化学法对TTM NPs产生¹O₂的能力进行定量测定。实验以9，10-蒽基-二丙酸二钠盐（disodium-9， 10-anthracendipropionic acid，Na₂-ADPA）作为¹O₂捕获剂，以玫瑰红（RB）作为标准的光敏剂；在白光照射不同时间（0~600 s）后，Na₂-ADPA在380 nm附近的最大紫外吸收强度随着光照时间的延长而下降（如图6所示）。经计算，TTM NPs的¹O₂产率为84.6%。上述结果表明，TTM NPs在光激活下展现出良好的ROS生成能力，具备潜在的肿瘤细胞杀伤活性。

2.4 生物安全性评估

光诊疗剂的暗毒性是评估其生物相容性及能否用于生物体系的关键指标。为明确TTM NPs的生物安全性，选取MDA-MB-231和MCF-7细胞，采用CCK-8试剂盒进行细胞毒性测试。结果如图 7 所示：将浓度为 20，40，80，160 μmol/L的TTM NPs与细胞共孵育24 h后，检测发现细胞存活率均维持在90%以上。这表明，TTM NPs在不大于160 μmol/L的浓度范围内未表现出明显细胞毒性，具有良好的生物安全性，可满足后续实验的应用要求。

2.5 细胞成像能力检测

为探究MDA-MB-231细胞对TTM NPs的摄取能力，将TTM NPs与MDA-MB-231细胞共孵育后，采用激光共聚焦显微镜（CLSM）进行成像分析，结果如图8所示。结果显示，随着共孵育时间的延长，细胞内TTM NPs的荧光信号逐渐增强（图 8 （a）），表明肿瘤细胞对TTM NPs的摄取呈现时间依赖性。

进一步，为明确TTM NPs进入肿瘤细胞后的主要富集部位，将TTM NPs与MDA-MB-231细胞共孵育6 h后，分别加入Hoechst 33258、Lyso-Tracker Green、Mito-Tracker Green及BODIPY 493/503 荧光探针，依次对细胞核、溶酶体、线粒体及脂滴进行特异性标记，继续共孵育30 min后进行成像。结果显示，脂滴的绿色荧光与TTM NPs的红色荧光重合度高（图 8 （b）），表明大量TTM NPs富集于脂滴中，仅有少量进入溶酶体。该结果为肿瘤的诊疗一体化应用提供了重要依据。

2.6 光动力治疗效果评估

基于上述优良的研究结果，进一步评估了TTM NPs的光动力治疗（PDT）效果。实验首先将TTM NPs与MDA-MB-231细胞共孵育，随后采用功率密度为60 mW/cm²的白光对细胞进行照射处理，最后通过CCK-8试剂盒检测细胞存活率。结果如图 9 所示：与未光照组（对照组）相比，光照组细胞的存活率随着TTM NPs浓度的升高显著降低，表明TTM NPs在光照条件下可诱导肿瘤细胞发生浓度依赖性凋亡。

此外，为进一步验证TTM NPs的光动力抗肿瘤效果，将 MDA-MB-231 细胞接种于共聚焦培养皿中，设置4组实验：对照组（Control）、PBS+光照组（PBS+Laser）、TTM NPs组（NPs）、TTM NPs+光照组（NPs+Laser）。实验中将浓度为4 μmol/L的TTM NP与细胞共孵育6 h，对光照组（PBS+Laser组、NPs+Laser组）采用功率密度为60 mW/cm²的白光进行照射处理；随后采用AM/PI双荧光探针染色，其中钙黄绿素-AM（Calcein-AM，AM）标记活细胞，碘化丙啶（PI）标记死细胞，通过激光共聚焦显微镜观察细胞存活状态。结果如图 10 所示，与对照组（Control）相比，4 μmol/L TTM NPs 孵育后经光照处理的细胞（NPs+Laser组）中死细胞数量显著增多，大量细胞发生凋亡。这表明，TTM NPs在光照条件下可发挥优异的光动力抗肿瘤活性。

3 结论与展望

3.1 结论

本研究通过简便的一步Knoevenagel缩合反应，成功合成了AIE分子TTM，该分子兼具优良的光物理特性与优异的AIE性能。为推动其在生物体系中的高效应用，采用纳米共沉淀技术组装制备了TTM 纳米颗粒（TTM NPs）。表征结果显示，TTM NPs的水合粒径约为 80 nm，Zeta电位为-34.41 mV，具有适宜的药物递送尺寸及良好的胶体稳定性。

随后，在细胞水平对该纳米诊疗剂的暗毒性进行评估。结果表明，TTM NPs在测试浓度范围内（不大于160 μmol/L）未表现出明显细胞毒性，具备良好的生物相容性，为其生物体系应用提供了安全保障。进一步的细胞成像实验证实，TTM NPs可被肿瘤细胞以时间依赖的方式摄取，且展现出优异的荧光成像能力与脂滴靶向特性。

最后，细胞水平的光动力治疗（PDT）效果评估结果显示，TTM NPs在白光照射下对肿瘤细胞具有显著的杀伤抑制效果。综上，TTM NPs在肿瘤诊疗一体化领域具有巨大的应用潜力

3.2 展望

AIE材料在生物医学成像、诊断和治疗等领域展现出巨大的应用潜力，但目前仍面临诸多亟待解决的关键难题。首先，在AIE诊疗剂的制备方面，需进一步改进合成策略、优化反应条件，引入新型功能化官能团，开发兼具高稳定性、高活性、特定生物功能及靶向性的AIE诊疗剂。这将有助于提升其在复杂生物微环境中的稳定性与靶向精准性，进而更好地满足临床应用的实际需求。其次，需拓展AIE诊疗剂的疾病诊疗应用范围。除当前研究较为深入的肿瘤诊疗领域外，还可探索其在心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病等重大慢性疾病的诊断与治疗中的应用价值。此外，需加快推动AIE诊疗剂的临床转化进程，包括系统开展临床前安全性评价、诊断灵敏度与治疗有效性评估，以及深入探究其作为手术导航工具的作用机制与应用方案。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(52303189)

国家自然科学基金资助项目(U22A20144)

宁夏自然科学基金优秀青年项目(2023AAC05027)

银川市科技支撑重点项目(2024SFZD004)