宁夏枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因LbAPX1的克隆及耐盐功能分析

Cloning and Functional Characterization of the Ascorbate Peroxidase Gene LbAPX1 from Lycium barbarum L. in Salt Tolerance

摘要

抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植物抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的关键限速酶，在清除活性氧（ROS）、维持细胞氧化还原平衡中发挥核心作用。研究以宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）为材料，采用RACE技术克隆获得LbAPX1基因全长序列。该基因全长1 075 bp，开放阅读框753 bp，编码250个氨基酸。生物信息学分析表明，LbAPX1蛋白的分子质量为27.768 ku，理论等电点5.52；二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，为稳定的亲水性蛋白。系统进化分析显示，其与刺萼枸杞（Lycium ferocissimum）同源性最高。亚细胞定位证实，LbAPX1蛋白主要分布于细胞质。qRT-PCR分析表明，LbAPX1基因在NaCl胁迫下显著上调表达，200 mmol/L NaCl处理时表达量最高。对转LbAPX1基因烟草进行0、75、100、200 mmol/L NaCl盐胁迫处理，结果显示，与野生型相比，转基因烟草在盐胁迫下表现出更强的耐盐性。在200 mmol/L NaCl处理条件下，过表达LbAPX1显著增强了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，提高了羟自由基（·OH）清除能力；同时，过氧化氢（H₂O₂）与丙二醛（MDA）含量显著降低。综上，LbAPX1通过增强植物抗氧化防御能力、减轻氧化损伤，在盐胁迫响应中发挥重要的正调控作用。

Abstract

Ascorbate peroxidase （APX） is a key rate-limiting enzyme in the ascorbate-glutathione （AsA-GSH） cycle and plays a central role in scavenging reactive oxygen species （ROS） and maintaining cellular redox homeostasis. In this study， Lycium barbarum L. was used as the experimental material， and the full-length sequence of LbAPX1 gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends （RACE） technology. The gene was 1，075 bp in length， contained a 753 bp open reading frame （ORF）， and encoded a protein of 250 amino acids. Bioinformatic analysis revealed that the predicted molecular weight of the LbAPX1 molecular weight of the protein is approximately 27.768 ku， with a theoretical isoelectric point （pI） of 5.52. Its secondary structure was mainly composed of α-helices and random coils， and the protein was predicted to be stable and hydrophilic. Phylogenetic analysis indicated that LbAPX1 shared the highest similarity with its homolog from Lycium ferocissimum. Subcellular localization analysis confirmed that the LbAPX1 protein was primarily localized in the cytoplasm. Quantitative real-time PCR （qRTPCR） analysis showed that LbAPX1 expression was significantly up-regulated under NaCl stress and reached its highest level under treatment with 200 mmol/L NaCl. LbAPX1-transgenic tobacco plants were subjected to salt stress treatments with 0， 75， 100， and 200 mmol/L NaCl. Compared with wild-type （WT） plants， LbAPX1-overexpressing tobacco plants exhibited enhanced salt tolerance under salt stress. Under treatment with 200 mmol/L NaCl， LbAPX1 overexpression remarkably increased the enzymatic activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase（CAT） and ascorbate peroxidase （APX）， as well as the hydroxyl radicals （·OH）-scavenging capacity. Meanwhile， the contents of hydrogen peroxide （H₂O₂） and malondialdehyde （MDA） were significantly reduced. Taken together， LbAPX1 plays an important positive regulatory role in plant response to salt stress by enhancing antioxidant defense and alleviating oxidative damage.

Graphical abstract

关键词

LbAPX1 / 宁夏枸杞 / 氧化损伤 / 遗传转化 / 盐胁迫

Key words

LbAPX1 / Lycium barbarum / oxidative damage / genetic transformation / salt stress

盐胁迫作为一种典型的非生物胁迫，能够诱导植物体内活性氧（reactive oxygen species， ROS）过量积累，进而引发细胞氧化损伤。其中，过氧化氢（hydrogen peroxide， H₂O₂）作为ROS中化学性质相对稳定的组分^［1］，可干扰细胞代谢稳态，诱发膜脂过氧化与氧化损伤，最终抑制植物的正常生长发育^［2-3］。在这一过程中，抗坏血酸-谷胱甘肽（ascorbate-glutathione， AsA-GSH）循环作为植物的核心抗氧化机制，主要负责通过酶促反应清除H₂O₂。该循环的关键酶——抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）存在于高等植物、真核藻类及一些蓝细菌中，以抗坏血酸作为特异性电子供体，将H₂O₂还原为水，在源头上阻止羟基自由基等更具毒性的ROS形成^［4］。APX基因家族在植物响应逆境胁迫中发挥着重要作用：在拟南芥中过表达猕猴桃AcAPX1或AcAPX2的组成型基因，可显著提高总AsA和GSH水平，增强拟南芥的耐盐性^［5］；水稻OsAPX2的过表达能够介导紫花苜蓿体内ROS的高效清除，增强植株的耐盐能力^［6］；菠菜通过提高SoAPX的表达量以应对盐、干旱、低温及氧化胁迫对植物产生的影响^［7］。因此，氧化应激条件下，APX在维持细胞氧化还原平衡、保护蛋白质结构与功能、确保代谢途径正常运转等方面发挥着不可替代的核心作用，是对抗盐诱导氧化损伤的关键分子靶点^［8］。

宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科枸杞属多年生灌木，广泛分布于宁夏、新疆、内蒙古等干旱与半干旱地区。其果实富含多糖、黄酮类及维生素等生物活性成分，是重要的药食同源植物^［9-10］。宁夏枸杞对盐碱环境具有较强适应能力，不仅是盐碱地改良的优选物种，还是挖掘耐盐基因的重要资源^［11］。而APX作为调控植物耐盐性的关键基因，课题组前期研究发现宁夏枸杞LbAPX1基因在NaCl胁迫下呈现差异表达^［12］，然而其分子特性与调控机制尚不明确。研究以宁夏枸杞为材料，利用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends， RACE）克隆LbAPX1基因，通过烟草遗传转化及耐盐性表型分析，系统评估该基因在盐胁迫应答中的抗氧化功能，以期为解析宁夏枸杞LbAPX1响应盐胁迫的分子机制提供理论依据与试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

宁夏枸杞‘宁杞1号’种子由宁夏农林科学院枸杞工程中心惠赠。挑选颗粒饱满的种子，经消毒处理后播种于腐殖土∶蛭石∶珍珠岩（1∶1∶1，体积比）基质中；在温度（25±2）℃、湿度42%、光周期12 h / 12 h（光照/黑暗）、光照强度60 μmol / （m²·s）的条件下培养两个月后，选择长势一致的健康幼苗，分别用0、100、200、300 mmol/L NaCl溶液进行胁迫处理，处理7 d后，剪下叶片迅速置于液氮中冷冻，随后转移至-80 ℃冰箱中保存备用^［13］。每个处理设置3次生物学重复。

真核表达实验材料为本氏烟草（Nicotiana benthamiana）；植物双元表达载体pCAMBIA 2300-EGFP和农杆菌菌株GV3101均由本实验室保留。

1.2 宁夏枸杞LbAPX1基因克隆

采用TIANGEN多糖多酚植物总RNA试剂盒提取不同浓度NaCl处理的宁夏枸杞叶片总RNA。使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA第一链的合成。采用Primer 6.0软件，分别设计3' RACE引物3'LbAPX1-1和3'LbAPX1-2，5' RACE引物5'LbAPX1-GSP1、5'LbAPX1-GSP2、5'LbAPX1-GSP3以及中间片段引物LbAPX1-F，LbAPX1-R（表1）。使用逆转录酶SMARTScribe™ Reverse Transcriptase、SUPERSCRIPT ⅡRT 酶以及3' CDS primer A、5' LbAPX1-GSP1引物进行总RNA的逆转录，合成cDNA后进行PCR扩增；经凝胶电泳检测、切胶回收及测序后，分别获得中间片段、3' 端序列、5' 端序列。利用DNAMAN软件进行序列拼接，获得完整的mRNA序列，进而得到宁夏枸杞LbAPX1基因的全长cDNA序列。

1.3 宁夏枸杞LbAPX1基因序列分析

对克隆得到的宁夏枸杞LbAPX1基因序列进行生物信息学分析。利用ProtParam在线工具（https：//web.expasy.org/compute_pi/）分析该基因编码蛋白的理化性质；通过SMART在线工具（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对蛋白的保守结构域进行分析；蛋白质的二级与三级结构分别采用SOPMA在线工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）与SWISS-MODEL在线工具（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）进行预测分析；序列同源性比对及系统进化树构建采用MEGA Version 11.0.13软件完成。

1.4 盐胁迫下宁夏枸杞LbAPX1表达量及APX酶活性分析

宁夏枸杞叶片RNA的提取与cDNA第一链的合成按照1.2方法执行。qRT-PCR定量实验使用诺唯赞生物科技有限公司（中国，南京）的试剂盒完成。采用Primer 6.0设计宁夏枸杞目的基因扩增引物LbAPX1-QRT-F、LbAPX1-QRT-R（表1），以Actin基因为内参基因，采用2^-ΔΔCt法对基因相对表达量进行分析。采用苏州梦犀生物医药科技有限公司的抗坏血酸过氧化物酶活性试剂盒，对不同浓度NaCl处理的宁夏枸杞叶片APX酶活性进行测定。

1.5 烟草LbAPX1遗传转化

LbAPX1扩增后经PCR验证，凝胶电泳条带大小与预期位置一致。以pCAMBIA 2300-EGFP为真核表达载体，利用Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对其进行双酶切，采用NovoRec^® PCR一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）进行连接，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，利用扩增引物进行PCR验证及测序鉴定。提取测序正确且鉴定为阳性的pCAMBIA 2300-EGFP-LbAPX1重组质粒，将其转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，菌液复苏后挑选单菌落进行PCR验证，将检测为阳性的农杆菌菌落制备成甘油菌，置于-80 ℃冰箱中长期保存。

将含阳性重组质粒的农杆菌菌液置于28℃条件下活化，随后将本氏烟草外植体浸入重悬后的菌液中侵染8~10 min；侵染完成后，将外植体接种至MS培养基，于25 ℃黑暗条件下共培养2~4 d。共培养结束后，将外植体转移至含卡那霉素（Kana）的MS培养基中进行抗性初步筛选；待外植体分化出抗性芽后，转接至含Kana的1/2 MS培养基中，继续培养至形成完整再生植株。采用SDS法提取再生植株叶片基因组DNA，通过PCR技术鉴定转基因阳性株系。将鉴定获得的T₀代阳性植株进行自交，收获T₁代种子；T₁代种子经表面消毒后，播种于含Kana的MS培养基中进行抗性筛选，对筛选得到的T₁代转基因烟草幼苗再次提取基因组DNA并进行PCR验证；验证阳性的T₁代植株自交后，收获并保存T₂代种子。

利用Primer 6.0软件设计转基因烟草PCR鉴定引物LbAPX1-T-F与LbAPX1-T-R（表1），PCR扩增程序设置为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性 30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。用于野生型及7个转基因烟草株系（OE1~OE7）qRT-PCR 检测的引物为LbAPX1-O-F和LbAPX1-O-R（表 1）。

1.6 宁夏枸杞LbAPX1亚细胞定位

采用烟草表皮细胞瞬时转化法研究LbAPX1蛋白的亚细胞定位。将鉴定成功的含pCAMBIA 2300-EGFP-LbAPX1重组质粒的农杆菌菌液过夜扩大培养；取1.5 mL培养后的菌液离心，弃去上清液，加入1 mL渗透液重悬菌体，室温静置1 h后，用于侵染本氏烟草倒三叶和倒四叶。浸染完成后，向叶片表面喷水，套上保鲜袋，置于培养室黑暗条件下过夜培养，次日拆除保鲜袋。注射侵染3 d后，切取叶片浸染区域，撕取表皮并制片，采用奥林巴斯激光共聚焦显微镜观察LbAPX1-EGFP融合蛋白的荧光信号分布，确定其亚细胞定位。

1.7 转基因烟草NaCl胁迫处理及LbAPX1表达量检测

将野生型和T₂代转基因烟草种子（研究选取两种不同株系的转基因烟草，分别为OE2和OE3）撒播于腐殖土∶蛭石、珍珠岩（1∶1∶1，体积比）混合基质中，培养条件设置为：温度（25±2）℃，湿度42%、光周期12 h光照/12 h黑暗、光照强度60 μmol/（m²·s）。待种子萌发后，将幼苗移至5 cm×5 cm的花盆中，每盆移栽2株，浇灌Hoagland营养液；继续培养1个月后，选取长势一致的野生型和2种不同株系的LbAPX1过表达转基因烟草，进行NaCl胁迫处理。考虑到烟草为甜土植物，盐胁迫浓度不宜过高，实验设置0、75、100、200 mmol/L NaCl四个浓度梯度，每个处理设置3次生物学重复。处理组每隔2 d浇灌含对应终浓度（75、100、200 mmol/L） NaCl的Hoagland营养液，每盆每次浇灌200 mL；对照组每隔2 d浇灌等量不含NaCl的Hoagland营养液。胁迫处理7 d后，观察植株生长表型，取各处理组叶片样品迅速冷冻保存，备用。采用Primer 6.0软件设计用于检测野生型、OE2及OE3株系转基因烟草的qRT-PCR引物：LbAPX1-F-Y、LbAPX1-R-Y（表1），通过qRT-PCR技术检测盐胁迫后LbAPX1目的基因的相对表达量。

1.8 盐胁迫下转基因烟草的生理指标测定

采用苏州梦犀生物医药科技有限公司的对应试剂盒，分别测定野生型和转基因烟草（OE2、OE3株系）的APX、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、H₂O₂、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的质量浓度及羟自由基（·OH）清除率。

1.9 数据处理

所有实验均设置3次生物学重复。采用SPSS Statistics 27.0软件进行差异显著性分析，使用Microsoft Excel 2021和Origin 2024软件整理数据并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 宁夏枸杞LbAPX1基因克隆

宁夏枸杞叶片总RNA 的28S和18S条带清晰（图1（a）），OD₂₆₀/OD₂₈₀=2.11，OD₂₆₀/OD₂₃₀=2.23，浓度为0.57 μg/μL，表明所提取的RNA未降解且无杂质污染，纯度合格，可用于后续逆转录合成cDNA。

经PCR扩增获得宁夏枸杞LbAPX1基因的中间片段（图1（b））。将目的片段进行切胶回收、连接T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞后，经测序分析确定，LbAPX1基因中间片段长度为753 bp。采用巢式PCR与梯度PCR相结合的方法，克隆获得LbAPX1基因的5'端和3'端序列（图1（c）、图1（d）），对目的条带进行切胶回收、连接载体及转化测序后，获得3'端和5'端碱基序列，长度分别为269 bp和367 bp。利用DNAMAN软件，将测序获得的基因中间片段序列与3'端、5'端序列进行拼接，最终得到LbAPX1基因的全长序列为1 075 bp，其中开放阅读框（CDS）序列长度为753 bp。

2.2 宁夏枸杞LbAPX1基因序列生物信息学分析

利用Prot Param软件对宁夏枸杞LbAPX1基因编码的蛋白质的基本特性进行分析（图2）。结果显示，LbAPX1蛋白的分子质量为27.768 ku，理论等电点为5.52，脂肪指数为80.04，不稳定系数为32.43（小于阈值40），因此推测该蛋白为稳定蛋白；亲水性平均系数（GRAVY）为-0.474<0，预测该蛋白为亲水性蛋白；其分子式为C₁₂₅₂H₁₉₃₅N₃₃₁O₃₇₂S₆。

采用SOPMA在线工具对LbAPX1蛋白的二级结构进行预测分析（图2（a））。结果表明，二级结构各组分中，α-螺旋含91个氨基酸，占比36.40%；无规则卷曲含110个氨基酸，占比44.00%；延伸链含29个氨基酸，占比11.60%；β-转角含20个氨基酸，占比8.00%。在SWISS-MODEL在线工具中，选取预测相似度最高的2y6b.1.A作为模板序列，对LbAPX1蛋白的250个氨基酸进行同源建模（图2（b）），该同源模型覆盖了宁夏枸杞LbAPX1氨基酸序列的83.87%。由图可见，LbAPX1蛋白的空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，与二级结构预测结果基本一致。

将宁夏枸杞LbAPX1蛋白的氨基酸序列进行同源性比对，并利用MEGA Version 11.0.13软件构建系统进化树（图2（c））。结果显示，宁夏枸杞LbAPX1蛋白与刺萼枸杞（Lycium ferocissimum）的蛋白聚为一类，二者同源关系最近。

2.3 盐胁迫下宁夏枸杞LbAPX1表达量分析及APX酶活性

对不同浓度NaCl处理的宁夏枸杞叶片LbAPX1基因进行qRT-PCR分析，结果见图3。由图3（a））可知，随着NaCl胁迫浓度的升高，LbAPX1的相对表达量呈先上升后下降的趋势，在200 mmol/L NaCl处理下达到峰值；当NaCl浓度升高至300 mmol/L时，其表达量下降，且与对照组相比，差异不具有统计学意义。此外，对不同NaCl浓度处理下的宁夏枸杞叶片APX酶活进行测定。由图3（b）可知，与对照组相比，各NaCl处理组的APX酶活性均显著升高，且酶活性的变化趋势与LbAPX1基因的表达模式基本一致，表明LbAPX1基因转录水平的上调可增强APX酶的催化活性。

2.4 转基因烟草植株DNA鉴定及相对表达量分析

过表达LbAPX1烟草株系的DNA鉴定与目的基因的表达量分析结果见图4。转基因烟草PCR鉴定结果显示，转LbAPX1烟草的目的片段大小为300 bp，测序序列与pCAMBIA 2300-EGFP载体序列及部分LbAPX1目的基因片段序列相符，而野生型烟草未扩增出任何条带（图4（a）、图4（b））。上述结果表明，LbAPX1基因已成功连接至pCAMBIA 2300-EGFP载体内，且成功整合到烟草基因组中。采用qRT-PCR技术进一步检测7个转基因烟草株系中LbAPX1基因的相对表达量。结果显示（图4（c）），各转基因株系间LbAPX1表达水平存在明显差异，但均显著高于野生型烟草；其中，OE3株系的LbAPX1相对表达量最高，OE2株系的相对表达量最低。研究选取这两个表达量差异显著的转基因株系（OE2、OE3）进行后续相关实验。

2.5 宁夏枸杞LbAPX1亚细胞定位分析

亚细胞定位实验结果显示，实验组烟草表皮细胞的细胞质中可检测到明显的绿色荧光信号；同时，利用PSORT在线预测工具（https：//www.genscript.com/tools/psort）对LbAPX1蛋白的亚细胞定位进行预测，结果显示其定位于细胞质的占比最高（52.2%）。结合烟草表皮细胞瞬时转化实验与在线预测两种结果，表明LbAPX1蛋白定位于细胞质中（图5）。

2.6 盐胁迫下转基因烟草的表型分析

不同NaCl浓度处理下野生型及转LbAPX1基因烟草的表型变化和地上部鲜质量（FW）差异如图6所示。野生型烟草在100、200 mmol/L NaCl胁迫处理第7 天时已出现明显萎蔫现象，而转LbAPX1基因烟草（OE2、OE3株系）叶片生长状态良好，无明显异常。盐胁迫处理7 d后，转基因烟草植株的鲜质量显著高于野生型烟草。上述结果表明，盐胁迫对LbAPX1过表达转基因烟草的伤害显著小于野生型，LbAPX1基因的过表达可增强烟草的耐盐性。

2.7 盐胁迫下转基因烟草的LbAPX1表达量分析

对盐胁迫下野生型及OE2、OE3两种不同株系的转LbAPX1基因烟草叶片进行qRT-PCR表达量分析。结果显示，在各浓度NaCl胁迫处理下，转LbAPX1基因烟草的LbAPX1相对表达量均显著高于野生型烟草；对比两个转基因株系发现，OE3株系在各NaCl处理组中的LbAPX1相对表达量均显著高于OE2株系（图7）。

2.8 盐胁迫下转基因烟草相关抗氧化生理指标变化

对盐胁迫下野生型（WT）及LbAPX1过表达转基因烟草（OE2、OE3株系）的相关抗氧化酶活性及氧化损伤指标进行测定，结果如图8所示。NaCl胁迫处理后，与野生型（WT）相比，LbAPX1过表达转基因烟草的APX酶活性在各浓度盐胁迫下均显著升高（图8（a）），且H₂O₂含量均显著降低（图8（b））；在200 mmol/L NaCl胁迫下，转基因烟草的·OH清除率及SOD、POD、CAT三种抗氧化酶活性均显著高于野生型（图8（c）~（f）），而MDA含量显著低于野生型烟草（图8（g））。值得注意的是，在200 mmol/L NaCl胁迫条件下，OE3株系的SOD、POD、APX三种酶活性及·OH清除率均显著高于OE2株系。

3 讨论

宁夏枸杞是一种能够适应盐碱环境的药食同源植物，挖掘其耐盐基因并解析其功能，对阐明该物种响应盐胁迫的分子调控机制具有重要意义。研究利用RACE技术克隆获得宁夏枸杞LbAPX1基因，其全长1 075 bp，开放阅读框753 bp，编码250个氨基酸。生物信息学分析表明，LbAPX1蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞质。系统进化分析进一步揭示，宁夏枸杞LbAPX1与茄科枸杞属的刺萼枸杞（Lycium ferocissimum）相应基因同源性较高，提示二者在调控植物生长与胁迫响应中可能具有相似功能。

在逆境胁迫下，植物细胞内代谢失衡会导致ROS迅速积累，引发氧化胁迫，进而通过脂质过氧化、蛋白质氧化等途径对DNA及其他细胞组分造成损伤。因此，维持细胞内ROS的动态平衡至关重要。APX基因家族不仅参与植物生长发育调控^［14-15］，还在多种非生物胁迫（如干旱、低温和盐害）应答中发挥关键作用^［16-18］。APX能够高效清除H₂O₂，减轻ROS引起的细胞氧化损伤，并与其他抗氧化酶协同维持细胞内氧化还原稳态，抑制MDA等膜脂过氧化产物的生成，从而保护细胞膜结构的完整性^［19］。研究发现，200 mmol/L NaCl 胁迫下宁夏枸杞LbAPX1基因表达量达到峰值，而300 mmol/L NaCl胁迫下其表达量开始下降，但与对照组相比变化不显著（图3（a））。这一现象可能源于高盐胁迫超出了宁夏枸杞的生理耐受阈值：当盐胁迫强度过高时，细胞内ROS爆发速度超过抗氧化系统的清除能力，进而损伤转录系统，导致LbAPX1基因转录水平受到抑制。进一步分析表明，APX酶活性的变化趋势与LbAPX1基因表达模式高度吻合（图3（b）），提示低浓度盐胁迫可诱导LbAPX1基因转录上调，进而增强APX酶催化活性，而高浓度盐胁迫则会干扰该基因的正常表达，最终影响酶活性^［20］。

研究从7个转基因株系中，选取LbAPX1表达量最高的OE3和最低的OE2进行耐盐性分析。在NaCl胁迫处理7天后，野生型烟草叶片出现明显萎蔫（图6（a）），其地上部鲜质量也显著低于转基因株系（图6（b））。相比之下，转基因烟草叶片生长状态良好，OE3与OE2中LbAPX1的表达量显著高于野生型（图7）。在200 mmol/L NaCl胁迫下，转基因烟草的SOD、POD和CAT活性均显著高于野生型，而H₂O₂和MDA质量浓度在各浓度盐胁迫下均显著低于野生型。此外，转基因株系的·OH清除能力在200 mmol/L NaCl条件下也显著增强，同时伴随更高的APX活性（图8）。APX是AsA-GSH循环的核心酶类，可与SOD、CAT、POD协同维持细胞内氧化还原稳态，是植物抵御非生物胁迫的关键防线^［21］。在抗氧化防御过程中，SOD首先催化毒性较强的超氧阴离子发生歧化反应，生成H₂O₂与O₂；随后APX与CAT、POD协同作用清除H₂O₂。与此同时，APX在清除H₂O₂的过程中产生单脱氢抗坏血酸（monodehydroascorbate， MDHA），该物质可通过 AsA-GSH循环驱动GSH的合成。GSH不仅是抗坏血酸再生的关键底物，还能保护SOD、POD、CAT的蛋白结构免受氧化修饰，进而维持其催化活性的稳定性^［22］。由此可见，在盐胁迫条件下，过表达LbAPX1的转基因烟草中，APX可与其他抗氧化酶协同作用，构成植株抵御盐离子毒害与氧化损伤的重要防御机制之一。

此外，转基因株系OE3中LbAPX1的表达量显著高于OE2，且OE3株系的SOD、POD、APX酶活性及·OH清除率均显著优于OE2株系（图8）。这一结果表明，LbAPX1的表达水平差异可能影响其对抗氧化通路的调控效能^［23］。具体而言，OE3株系中LbAPX1的高水平表达可直接提升APX酶活性，促进H₂O₂的高效清除以减轻氧化损伤^［24］，最终实现植株抗氧化系统活性的稳定维持。

研究明确了宁夏枸杞LbAPX1基因的序列特征、表达模式，证实其异源过表达可提升植物耐盐性，为宁夏枸杞耐盐基因资源的挖掘与利用奠定了基础。但研究仍存在一定局限性：鉴于宁夏枸杞遗传转化体系尚未成熟，研究未在宁夏枸杞中开展过表达或基因敲除验证，仅通过烟草异源过表达系统间接阐明了LbAPX1在枸杞应答盐胁迫中的调控作用。因此，后续研究可重点构建高效的宁夏枸杞遗传转化体系，通过过表达与基因敲除相结合的策略，深入验证LbAPX1在宁夏枸杞自身应答盐胁迫过程中的调控机制。

4 结论

研究利用RACE技术从宁夏枸杞中成功克隆得到LbAPX1基因全长cDNA序列，该基因全长1 075 bp，开放阅读框753 bp，编码250个氨基酸。生物信息学分析表明，LbAPX1蛋白为稳定的亲水性蛋白，二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，定位于细胞质（与前文生物信息学分析结果一致）。系统进化分析显示，LbAPX1与刺萼枸杞中的同源蛋白亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明，盐胁迫可诱导LbAPX1基因上调表达，其中200 mmol/L NaCl处理时表达量达到峰值。将LbAPX1基因转化本氏烟草后，转基因烟草在盐胁迫下表现出更强的耐盐性，具体表现为：地上部鲜质量显著增加，APX、SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性显著升高，H₂O₂和MDA质量浓度显著降低，ROS清除能力显著增强。综上所述，LbAPX1基因在植物盐胁迫应答中发挥正调控作用，其通过提升抗氧化酶活性，促进ROS的高效清除，维持细胞内代谢平衡，并增强植株整体抗氧化防御能力，最终提高植物对盐胁迫的适应能力。研究为深入解析宁夏枸杞响应盐胁迫的分子机制提供了理论依据，也为耐盐植物品种的分子育种提供了候选基因资源。

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基金资助

宁夏自然科学基金资助项目(2023AAC05024)

宁夏自然科学基金资助项目(2024AAC03097)

国家自然科学基金资助项目(32301632)

国家自然科学基金资助项目(32560070)