0 引言
支气管炎(tracheitis)是一种由于感染性病原体或微生物感染或化学刺激等非感染因素引起的软骨管和软骨管膜的炎症性改变,支气管炎分为两类,一类是急性支气管炎,另一类是慢性支气管炎。慢性支气管炎(Chronic Bronchitis,CB)是一种慢性、非特异性的慢性炎症,主要表现为咳嗽、咳痰、喘息
[1]。这种炎症性改变不仅会导致黏液分泌物的分泌量增多,还会导致软骨管膜绒毛中代谢过程酶的活性因缺乏负离子而降低及肺泡的分泌和呼吸功能下降
[2]。
目前在西医中治疗慢性支气管炎主要予以抗炎、止咳和祛痰等,虽然在短期内症状可以缓解,但长期使用易出现耐药性,无法从根源上解决慢性支气管炎疾病
[3]。而从中医的角度来看,中药具有副作用小、不易出现耐药性,更好地调节身体脏器的显著特点,更容易被更多患者接受
[4]。
慢性支气管炎在中医被称为“咳嗽”或者是“喘证”,该病的发生与发展通常与外邪的反复侵袭,肺、脾、肾三脏功能失调密切相关
[5]。Wu等
[6]运用临床实践与实验结合的方法,得出补脾肺法对CB有显著的防治作用。Huang等
[7]运用网络药理学与转录组学等方法研究,得出毛橘红中存在的活性成分新橙皮苷和柚皮素对CB具有药理作用的结论。
治疗本病的处方较多,且根据具体症状可选择不同处方,如二陈汤与三子养亲汤合用,具有益气健脾、滋阴消痰之效
[8];小青龙汤,具有温肺化饮、解表散寒、平喘止咳的功效
[9];厚朴麻黄汤,具有开胸通气、平喘、化痰、除湿之效
[10]。本项研究通过数据挖掘得到基本处方的用药规律,得到治疗慢性支气管炎的核心药物,再通过网络药理学对核心药物治疗疾病的机制进行分析,为临床工作者的实验提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 数据来源
以“慢性支气管炎”“中医”和“慢性支气管炎”“中药”等为主题词在万方数据库、中国知网、维普数据库进行检索,时间为2010年1月至2023年3月,其他限制条件不变,检索利用中医中药的方式治疗慢性支气管炎的相关文献
[11]。
1.2 文献纳入和排除标准
(1)纳入标准:①明确诊断为慢性支气管炎;②有完整的处方记录且有具体使用剂量;③文献中有样本量且数量≥20;④治疗方式为汤剂内服;⑤有明确疗效。
(2)排除标准:①诊断不明确、效果不明确;②剂量不明确;③没有样本量或样本量<20;④文献形式为综述;⑤治疗方式为雾化吸入、穴位贴敷等与内服形式不相符的;⑥形式不同但内容相同的文章选取1篇。
1.3 处方数据标准化处理
经过以上纳入和排除标准得到的中药处方,根据《中国药典》2020年版
[12]对中药名称进行规范,例如“苏子”或“紫苏”规范为“紫苏子”,“熟地”规范为“熟地黄”,“川贝”规范为“川贝母”,“川厚朴”或“川朴”规范为“厚朴”等。规范处理工作由电脑校对和人工校对共同完成,确保录入原始数据的准确性。
1.4 数据库建立与挖掘
把整理得到的272首药方录入WPS Office中,建立治疗慢性支气管炎的汤剂处方,格式规范为“古今医案云平台”要求的医案格式后录入“古今医案云平台”分析池,对处方进行用药频数、四气、五味、归经和功效的分析;同时利用该平台可进行聚类分析。利用Excel表格中数据透视表功能,对每味中药的使用频率进行统计,使用频数≥1的替换为“Y”,频数为0的替换为“N”;利用SPSS Modeler(V18.0)软件进行关联分析和复杂网络分析,通过二项关联规则、三项关联规则、聚类分析和复杂网络分析选取核心药物。
1.5 网络药理学分析
1.5.1 本研究所涉及的相关数据库以及所有软件信息
1.5.2 核心药物中活性成分筛选和靶点预测
通过TCMSP数据库、HERB本草组鉴数据库,寻找核心药物的化学组成成分,再利用知网、维普等相关研究文献进行成分补充,在TCMSP平台进行活性成分筛选:主要筛选出生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18的成分,即可视为活性成分,并对对应的靶点进行预测,整合与去重并记录下来。
1.5.3 慢性支气管炎疾病相关靶点筛选
挖掘GeneCards数据库、OMIM数据库,输入“chronic bronchitis”,检索治疗慢性支气管炎的潜在靶点,并查阅有关文献,获取与慢性支气管炎相关的靶点,汇总、去重、取交集,并将这些靶点统一整合到uniport数据库中,对所得到的靶点进行标准化分析。
1.5.4 核心药物-慢性支气管炎交集靶点构建
将筛选的核心药物活性成分靶点与慢性支气管炎疾病靶点,输入“venny2.1.0平台”,利用此平台取交集绘制韦恩图,获取核心药物成分与慢性支气管炎交集靶点,保存图片并把交集靶点记录下来。
1.5.5 核心药物-疾病-成分-靶点网络构建
对经筛选的组分进行编码,并使用Cytoscape 3.8.0软件绘制核心药物-慢性支气管炎-成分-靶点网络图,并对其进行网络特征分析,以拓扑参数包括介度(Betweenness)、连接度(Degree)、紧密度(Closeness)等作为发挥药效的活性成分分析依据。
1.5.6 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及关键靶点筛选
为了明确核心药物相关靶点与慢性支气管炎靶点间的相互作用,把有关靶点的交集部分绘制成维恩图。再将交集靶点输入String数据库中,建立其PPI网络,将生物种类设置为“ Homo spaien”。然后在Cytoscape 3.8.0中加入MCODE插件,进一步分析PPI网络中可能存在的蛋白功能模块,再利用CytoNCA插件对交集靶点中的每个节点进行属性值的大小分析。通过对交集PPI网络拓扑特征的属性值分析,筛选出相应的目标即可得到关键靶点。
1.5.7 核心药物成分-慢性支气管炎靶点功能与通路的富集分析
将筛选得到的核心靶点录入Metascape 3.8.0平台,进行基因本体论(Gene Ontology, GO)的CC、BP、MF分析(细胞定位、生物学过程、分子功能)及KEGG通路分析,以完成生物学过程与代谢的转移和富集,将实验数据的结果记录在“微生信”平台上,并将其可视化。
1.6 分子对接预测
分析完成后,选取核心药物的有效成分与慢性支气管炎靶点中网络中度值前5的靶点与前5的有效成分,利用RCSB PBD平台将核心药物活性成分和这5个靶点分别通过AutoDock Vina进行分子对接预测分析,以对接得分(Docking Score)值的大小为基础,评估靶点与活性化合物结合强度与活性的强弱,对评分较高的进行PyMOL可视化。
2 结果
2.1 文献及处方整理结果
在中国知网、万方、维普数据库中检索初步获得文献309篇,有效文献188篇,其中部分文献处方存在多样性,经过反复的纳入和排除标准比对,得到有效方剂272首。
2.2 数据挖掘结果
2.2.1 用药频次及性味统计
运用“古今医案云平台”对方剂基本信息进行统计,得到223味中药,总使用频率2 699次,对使用频次≥45的16味中药进行分析,其中使用频率前五位分别是甘草、茯苓、苦杏仁、半夏、陈皮,见
表1。对272首方剂中药物的属性进行分析,包括四气、五味、归经、功效。其中四气中温性药使用次数最多,达764次,其次是平性药575次和寒性药290次;五味中使用频次最高的是甘味药,达1 112次,其次是辛味药971次和苦味药652次,见
图1。
2.2.2 方剂的归经功效统计
对272首方剂的223味中药进行归经分析,得到归经中频次最高的是肺经,达1 939次,其次是脾经1 133次和心经809次,见
图2;对233味中药进行功效分析,功效中频次最高的是燥湿化痰,达282次,其次是清热解毒255次及补脾益气229次,见
表2。
2.2.3 方剂的用药关联规则分析
利用SPSS Modeler软件(V18.0)中“建模-关联-Apriori”功能对方剂中治疗慢性支气管炎的高频中药进行关联规则分析,二项关联规则,设置支持度≥12%,置信度≥80%,见
表3,三项关联规则设置支持度≥20%,置信度≥80%,见
表4。
2.2.4 方剂的用药聚类分析
利用“古今医案云平台”,对使用频次排名前15的中药进行聚类分析,设置距离类型:欧氏距离,聚类方法:最长距离法。显示方式选择圆形竖向聚类图。聚类结果显示,治疗慢性支气管炎的方剂主要可分为三类,第一类为半夏、甘草、陈皮、茯苓;第二类为厚朴、紫苏子、桔梗、麻黄、苦杏仁;第三类为山药、熟地黄、五味子、白术、党参、黄芪。聚类分析表明不同功能的中药不仅含有不同的活性成分,也含有相同的活性成分,其活性成分之间相互作用,通过多靶点、多途径发挥药效,实现对疾病的治疗,见
图3。
2.2.5 方剂的复杂网络分析
将272首方剂中的中药导入SPSS Modeler软件(18.0)中,绘制治疗慢性支气管炎的复杂网络图,设置强链接线较粗,选择“链接大小连续变化”显示,可显示的最大链接数为100,弱链接上限30,强链接下限80,核心药物之间相互关系,实线表示关联性强,边越粗,药物之间的关系就越紧密,该网络具有连通性,不包含孤立的节点。由此可知,甘草与半夏、甘草与茯苓、甘草与苦杏仁、甘草与陈皮、甘草半夏与陈皮的关联性较强,结果见
图4。
2.3 方剂的网络药理学结果
2.3.1 核心药物活性成分及靶点
目前,呼吸道疾病的诱因众多,且病理过程也很复杂,无法从症状上判断是哪种诱因导致发病,现阶段认为,这种疾病主要与环境、病毒感染、遗传以及物理化学刺激等因素关系密切
[13]。从中医治疗角度来看,慢性支气管炎主要包括风寒侵袭肺、痰湿壅肺、痰热壅肺、脾肺两虚、肺肾气虚五个证型,因此治疗主要以肺为主,以补脾补肾为辅进行治疗
[14]。结合数据挖掘结果,本研究选取具有健脾益气、祛痰止咳功效的甘草,具有镇咳止痰、燥湿化痰功效的半夏,具有理气健脾、燥湿、化痰功效的陈皮,作为治疗慢性支气管炎的核心药物,进行网络药理学分析。运用化学专业数据库、HERB本草组鉴数据库初步获得甘草化学成分401个、半夏化学成分179个、陈皮化学成分150个。采用TCMSP平台对有效成分进行筛选,其中OB≥30%(甘草OB≥60%),DL≥0.18,得到甘草23个活性成分、半夏13个活性成分、陈皮5个活性成分,利用收集到的活性成分在TCMSP中寻找对应靶点,结果合并后排除重复值,获得甘草靶点66个、半夏靶点100个、陈皮靶点69个。所得靶点在Uniport数据库中转化为相应的基因型。将靶点信息合并,去重后得到靶点140个。
2.3.2 慢性支气管炎疾病相关靶点
通过查阅GeneCards、OMIM数据库,分别得到慢性支气管炎相关靶点1 371个、77个,筛选并去除重复值得到气管炎疾病总靶点1 439个。
2.3.3 核心药物-疾病交集靶点
利用Venny2.1网站画出韦恩图,得到核心药物与慢性支气管炎交集靶点共46个,见
图5,得到治疗慢性支气管炎的活性成分14种,见
表5。
2.3.4 核心药物-疾病-成分-靶点网络构建
利用Cytoscape 3.8.0把三味中药的活性成分与交集靶点及疾病的关系绘制成网络图,并对其进行分析,一共得到179个节点(包含核心药物甘草、半夏、陈皮3个,活性成分14种,慢性支气管炎疾病1个,交集靶点46个),边数300条,见
图6。由表格和图片可知,甘草、半夏、陈皮以不同的活性成分中存在的相同或不同的靶点对慢性支气管炎起着治疗作用。其中甘草通过PTGS1、CHRM3、SCN5A等靶点发挥作用,半夏通过PTGS1、CHRM3、PIK3CG等靶点发挥作用,陈皮通过SCN5A、PIK3CG、HSP90AB1等靶点发挥作用,见
表6。
2.3.5 核心药物治疗慢性支气管炎的PPI网络
交集靶点录入string数据库构建PPI网络,导入Cytoscape 3.8.0的MCODE插件进一步分析,结果显示44个节点,261个边,见
图7,根据大于平均Degree值11.86、平均Betweenness值40.82、平均Closeness值0.012进行筛选,得到12个关键蛋白,见
表7。
2.3.6 交集靶点功能与通路的富集分析
采用Metascape平台对上述的46个交集靶点进行基因富集分析,其中包括GO的CC、BP、MF(分别为细胞定位、生物学过程、分子功能)以及KEGG通路,并将其结果保存,取
值排名前10的结果,将其进行可视化。将CC、BP、MF的结果用三合一柱状图表示,见
图8,KEGG通路的结果以气泡图的形式显示,见
图9。通过对GO的MF分析发现治疗疾病的分子功能主要包括蛋白质同二聚体活性、抗氧化活性、蛋白质结构域特异性结合、乙酰胆碱结合等;BP分析发现生物学过程包括氧化应激反应、对肽的反应、对细菌来源分子的反应、对外来刺激的反应、凋亡信号通路的负调控等;CC分析发现细胞定位主要有薄膜筏、血小板α颗粒管腔、受体复合体、分泌颗粒腔等参与调节治疗疾病。通过KEGG分析发现治疗慢性支气管炎的主要通路有AGE-RAGE信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、血小板活化、Th17细胞分化、JAK-STAT信号通路等。
2.4 分子对接结果
预测中度值排名前五的靶点AKT1、TP53、VEGFA、PTGS2、CASP3,有效成分为baicalein(黄芩素)、formononetin(芒柄花黄素)、nobiletin(川陈皮素)、naringenin(柚皮素)、Cavidine(消旋卡文定碱),见
表8,进行分子对接预测。在分子对接的结果中,受体与配体结合能越小,结合能力越强
[15],由
表8可知,结合能在-9.5 kcal/mol到-5 kcal/mol之间,Docking Score≤-8.5的有5种,表明五种有效成分与核心靶点之间结合活性较强,见
图10。将Docking Score≤-8.5的对接结果利用PyMOL可视化,见
图11。其中PTGS2靶点蛋白与五种有效成分均存在较强的结合作用。
3 结论
慢性支气管炎在传统中医学中并无一个独立而清晰的疾病名称,具有国医大师之称的刘祖贻教授
[16]从症状上将其归入“咳嗽”“喘证”“痰饮”等范畴,经刘教授多年临床诊疗经验总结,认为慢性支气管炎应以“痰浊”为主,病位涉及肺脾肾三大脏腑,于是便有了《杂病源流犀烛·咳嗽哮喘源流》中所讲的:“盖肺不伤不咳,脾不伤不久咳,肾不伤,火不炽,咳不甚。”
[17]数据挖掘到的数据显示,治疗慢性支气管炎的高频药物有甘草、茯苓、苦杏仁、半夏、陈皮、麻黄等,根据三项关联规则显示“甘草、陈皮、茯苓”“甘草、陈皮、半夏”“陈皮、半夏、茯苓”等同时出现的频率较高。基于数据挖掘及文献收集,本研究选取具有补中益气、祛痰止咳、缓急止痛之效的甘草,燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之效的半夏以及理气健脾、燥湿化痰之效的陈皮为研究对象,探讨其治疗慢性支气管炎的作用机制。邓蓉燕等
[18]在给予CB患者西药的同时,加用黄芪半夏汤,包含半夏、甘草、陈皮,一周后与只用西药治疗的病人对比,咳痰喘消失,其他伴随症状明显好转,复查血细胞分析正常,CT正常。石燕平等
[19]指出对CB痰热壅肺证的患者,在给予西药的基础上,研究组添加加味黄芩温胆汤进行治疗,此汤剂同样包含半夏、陈皮、甘草,在治疗一周、两周后检测患者血清hs-CRP水平和血清PCT水平,发现均有明显下降。
从网络药理学的结果中看出,甘草中治疗慢性支气管炎的有效成分有芒柄花黄素、新甘草酚等,半夏中有效成分有黄嘌呤核苷、β-谷甾醇等,陈皮中包含的有效成分有柚皮素、川陈皮素、橙皮素等。Zhou等
[20]研究指出橙皮素不仅可抑制AKT1、VEGFA等蛋白的表达,还能上调TP53蛋白的表达,从而达到降低病情进展为肺癌的目的。杨雅静等
[21]研究指出,芒柄花黄素可能是通过上调Th2型细胞因子IL-4的分泌,提高小鼠血清中IgG类抗体和IL-4含量,从而增强机体的体液免疫能力,提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力,促进溶菌酶的合成与分泌,增强小鼠的固有免疫功能。王坚迪等
[22]研究发现,柚皮素可以下调患有哮喘的大鼠肺组织中VEGFA蛋白表达水平,由此可以得到柚皮素能抑制哮喘大鼠中上调的VEGF信号通路的活化。根据PPI网络图分析,三种药物中治疗慢性支气管炎的核心靶点有AKT1、TP53、VEGFA、PTGS2、CASP3、MMP9、IL4等,AKT1异常表达常发生于各种病理状态,如癌症、炎症和自身免疫性疾病
[23],TP53具有调控细胞周期,诱导细胞凋亡的作用,对有缺陷的细胞进行调节。结合董娅慧等
[24]研究,此三种中药在慢性支气管炎模型中能下调AKT、VEGFA、IL-4在大鼠肺组织的表达,从而发挥治疗作用。KEGG的分析显示,Th17细胞分化和TNF信号通路在抗炎、抗氧化、影响黏液分泌等方面发挥显著作用,这是治疗慢性支气管炎的关键作用
[25],尤其是TNF信号通路在维持机体、组织器官及细胞的稳态方面起着重要作用,参与并调节机体炎症与免疫反应
[26]。根据GO分析得出的结论显示,药物主要通过氧化应激反应、对肽的反应、对细菌来源分子的反应、对外来刺激的反应等生物学过程发挥他们的治疗作用。
分子对接的结果显示,中度值排名靠前的靶点与有效成分结合能力均较好,且PTGS2与五个有效成分的Docking Score值均小于等于-8.5,表明其与这五种有效成分结合能力更强,具有很好的结合活性。
综上,本研究运用数据挖掘、网络药理学及分子对接的技术详细地分析了中药治疗慢性支气管炎的用药规律以及甘草、陈皮、半夏三味中药多成分、多靶点、多途径治疗慢性支气管炎的作用机制。由于研究数据完全来自于数据库,具有一定的局限性,有待后续进一步的实验验证。希望本研究可以为临床工作者提供理论依据,为中医药的发展做出贡献。