基于网络药理学和体外实验探讨冠心宁注射液改善心肌肥厚的作用

Mechanism of Guanxinning Injection in Improvement of Cardiac Hypertrophy Based on Network Pharmacology and in vitro Experiments

摘要

本文采用网络药理学方法，对冠心宁（Guanxinning， GXN）注射液改善心肌肥厚的关键靶点及作用机制进行探讨，并在细胞水平上进行验证。首先，利用中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）对GXN注射液活性成分进行筛选，并结合BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction、OMIM、GeneCards和DisGeNet数据库分析其改善心肌肥厚的潜在靶点。通过String数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建潜在靶点间相互作用网络图并筛选核心靶点。将核心靶点输入Metascape数据库进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，探索GXN抗心肌肥厚的潜在机制。其次，采用Autodock平台进行分子对接，预测活性成分与关键靶点的结合度。最后，在细胞水平上对GXN注射液改善心肌肥厚的作用机制进行验证。网络药理学筛选得到GXN注射液活性成分68个，GXN注射液改善心肌肥厚的关键靶点100个，主要通路包括MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路、钙信号通路等。分子对接结果显示GXN注射液活性成分新隐丹参酮、米尔顿酮和脱氧隐丹参酮与MAPK1、SRC和MAPK3对接较为稳定。细胞实验结果显示，GXN可通过MAPK信号通路抑制心肌细胞肥大。本研究表明GXN注射液改善心肌肥厚具有多成分、多靶点和多途径的特点。

Abstract

This study aims to explore the targets and mechanism of Guanxinning (GXN) injection in the improvement of cardiac hypertrophy (CH) based on network pharmacology, and validate at the cellular level. Firstly, chemical constituents of GXN injection were collected through traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform (TCMSP) database. BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction, OMIM, GeneCards and DisGeNet database were used to analyze the targets of GXN injection for improvement of CH. The protein interaction network was obtained by the String database, and Cytoscape 3.9.1 was used to screen core targets. Gene ontology (GO) analysis and (Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) pathway enrichment analysis of core target genes were performed using Metascape database to explore the potential mechanism of GXN in improving CH. Secondly, molecular docking study was performed to predict the binding affinity of the main active ingredients to the core targets. Finally, the mechanism of GXN injection-induced improvement in CH was verified at the cellular level. The network pharmacologic analysis showed that there was a total of 68 active ingredients and 100 core anti-CH targets in GXN injection. These core targets were mainly enriched in MAPK signaling pathway, JAK-STAT signaling pathway, calcium signaling pathway and so on. The molecular docking results indicated that neocryptotanshinone Ⅱ, miltionone Ⅰ and deoxyneocryptotanshinone showed the highest affinity with MAPK1, SRC and MAPK3, respectively. Experimental results showed that GXN inhibited cardiomyocyte hypertrophy through the MAPK signaling pathway. Therefore, GXN injection could protect against CH via a multi-component and multi-target way.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 分子对接 / 冠心宁注射液 / 心肌肥厚 / MAPK信号通路

Key words

network pharmacology / molecular docking / Guanxinning injection / cardiac hypertrophy / MAPK signaling pathway

0 引言

近年来，我国心血管病的发病率与致死率仍高居榜首^［1］。心肌肥厚（cardiac hypertrophy， CH）是指由于左心室壁增厚或心室直径扩大引起的左心室质量增加。病理性心肌肥厚是由于长期高血压或瓣膜狭窄导致的压力超负荷，或者二尖瓣反流或主动脉瓣关闭不全、心肌梗死或遗传缺陷等导致的容量超负荷引起的，心肌组织发生代偿性增大^［2］，是许多常见的心血管疾病如高血压、心肌梗死和动脉粥样硬化等引起的心脏结构学上的改变^［3］。如果不及时进行干预，在持续和长期的压力作用下代偿的心肌会出现适应不良，导致心力衰竭甚至猝死等严重后果。目前临床上治疗心肌肥厚的药物主要是血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）和β肾上腺素受体阻滞剂（Angiotensin II Receptor Blocker， ARB）类药物，但由于其副反应多，疗效个体差异性大等问题，在临床上的使用率显著下降^［1］。因此，非常有必要寻找防治心肌肥厚的新的有效药物。

冠心宁（Guanxinning，GXN）注射液由丹参和川芎两味中药组成，具有通脉养心、活血化瘀的作用，目前在临床上主要用于冠心病、心绞痛患者的治疗，对于患者胸痛等症状具有辅助治疗作用。GXN中的丹参是心血管病治疗中的黄金草药，具有广泛的心脑血管保护作用，丹参及其成分可预防心肌梗塞、急性心肌缺血^［4］、心律失常、心脏肥大^［5］和心脏纤维化等在内的多种心血管疾病；另一主要成分川芎，是一种具有降低心血管疾病风险的巨大潜力的草药^［6］，广泛应用于心力衰竭^［7］、高血压和冠心病^［8］等的治疗。然而，GXN改善心肌肥厚的药效作用机制尚不明确。

本研究采用网络药理学技术和分子对接技术，筛选出了GXN注射液改善心肌肥厚的成分基础和作用靶点，预测了GXN注射液改善心肌肥厚的相关信号通路，并利用体外心肌细胞肥大模型，验证了GXN注射液改善心肌肥厚的潜在作用及其机制。本研究为临床上应用GXN注射液改善心肌肥厚提供了实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1　药物

冠心宁注射液（国药准字Z13020779，神威药业集团股份有限公司）。

1.2　试剂

H9C2细胞（购自武汉普诺赛生命科技有限公司），血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）（美国Sigma公司，批号：A9525），CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号C0038），逆转录试剂盒（日本TAKARA 公司，货号RR037A），实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒（日本TAKARA 公司，货号RR430B），引物购自上海生物工程股份有限公司，Western blotting所用化学试剂（美国AMRESCO公司），α-SMA抗体（美国abcam公司，货号ab5694），p-p38抗体（美国CST公司，货号4511T），p38抗体（美国CST公司，货号8690T），p-JNK1/2抗体（美国CST公司，货号4668T），JNK1/2抗体（美国CST公司，货号9252T），p-ERK1/2抗体（美国CST公司，货号4370T），ERK1/2抗体（美国CST公司，货号4695T）。

1.3　仪器

荧光显微镜（日本Nikon公司，型号TS2R-FL），超高灵敏度化学发光成像仪（美国Biorad公司，型号ChemiDoc），实时荧光定量PCR仪（美国Thermofisher公司，型号QuantStudio），超微量分光光度计（美国 Thermo 公司，型号Nanodrop ONE），基因扩增仪（德国Eppendorf 公司，型号5331），冷冻离心机（美国Beckman coulter公司，型号Allegra X-15R）。

1.4　GXN注射液活性成分的筛选以及潜在靶点的预测

利用中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索GXN注射液中“丹参”和“川芎”的化学成分，根据药物吸收、分布、代谢和排泄等药代动力学特性，以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，药物相似性（drug likeness， DL）≥0.18作为筛选标准，筛选活性成分。将活性成分，经由TCMSP数据库、BATMAN数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）和Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测其潜在作用的蛋白靶点，并将蛋白靶点输入至Uniprot蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）中进行基因名转换。将不同数据库中获得的蛋白靶点合并后删除重复信息，获得活性成分潜在的作用靶点。

1.5　疾病靶点的收集

以“cardiac hypertrophy”为关键词，在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）（设定Relevance score>5）筛选与心肌肥厚相关的潜在靶点，删除数据库合并后的重复靶点，即为心肌肥厚疾病的相关靶点。

1.6　“药物-成分-疾病-靶点”网络模型的构建

将GXN注射液活性成分的潜在靶点与心肌肥厚相关靶点进行交集并绘制韦恩图，交集部分为药物-疾病共同靶点，即为GXN注射液发挥抗心肌肥厚作用的潜在靶点。利用Cytoscape 3.9.1软件对GXN注射液活性成分和药物-疾病共同靶点进行映射，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络模型。利用Cytoscape 3.9.1软件中Network Analysis功能进行网络拓扑结构分析，计算网络模型中各个活性成分的度值，筛选GXN注射液抗心肌肥厚的主要活性成分。

1.7　蛋白质相互作用（Protein-protein interaction， PPI）网络的构建以及关键基因的筛选

将GXN注射液发挥抗心肌肥厚作用的潜在靶点，输入到String数据库（https：//string- db.org/）中进行PPI构建，设定物种为“Homo sapiens”，评分标准为大于0.9，筛选存在高频度相互作用的靶点蛋白质，用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化分析。利用Cytoscape软件中的CentiScape 2.2 Men插件，计算各节点的度值，度值表示与该节点直接作用的节点数量，度值越大说明该节点在网络中的重要性越大，设定度值大于2倍the Avg. number of neighbors的节点为关键靶点。

1.8　基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将GXN注射液抗心肌肥厚作用的关键靶点输入Metascape（http：//metascape.org/）网站进行基因功能注释分析。设定参数：最小计数为3、P<0.01、富集因子>1.5，筛选具有指导意义的生物学进程，并进行GO分析和KEGG通路分析。

1.9　活性成分与关键靶点的分子对接验证

将GXN注射液中活性排名前三的活性成分分别与PPI网络中度值排名前五的靶点蛋白进行分子对接。在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载得到GXN注射液活性成分的SDF文件格式的3D结构信息，并通过Open babel软件将其转换为pdb格式。通过PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取靶点蛋白pdb格式的三维晶体结构，应用AutoDockTool 4.0软件对靶点蛋白进行去除水分子和加氢等处理，并将GXN注射液活性成分与预处理后的靶点蛋白进行分子对接，通过结合能评估活性成分与靶点蛋白的结合活性，将结合能较低的对接结果利用PyMOL软件进行可视化处理。

1.10　细胞培养以及心肌细胞肥大模型的构建

将H9C2心肌细胞系以2×10⁵个/mL的密度均匀接种于细胞培养板中。将细胞分为空白对照组（Control组）、模型组（Ang Ⅱ组）、冠心宁组（GXN组）、GXN和模型组（GXN+Ang Ⅱ组）。H9C2细胞加入无血清的DMEM高糖培养基饥饿12 h，加入1 μmoL/L Ang Ⅱ及5 μL/mL、10 μL/mL和20 μL/mL剂量的GXN注射液，对照组则加入等体积的PBS。24 h后，收集细胞。

1.11　心肌细胞表面积的测量

弃去H9C2细胞的培养基，加入预冷的PBS清洗3次。质量浓度为4%多聚甲醛固定20 min后，继续用PBS清洗除去残留的甲醛。加入体积分数5%山羊血清室温封闭30 min后，加入一抗α-SMA（1∶ 250），4 ℃冰箱过夜。PBS清洗后加入荧光二抗（1∶200），室温避光孵育1 h；弃去二抗，用PBS清洗3次。避光滴加DAPI染核。在荧光显微镜下观察细胞形态，每张片子随机选取5个视野进行拍照。

1.12　实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

收集处理后的H9C2细胞，加入Trizol后提取总RNA，逆转成cDNA后，使用以下引物进行实时荧光定量PCR反应：

rANP-F：CTGGGACCCCTCCGATAGAT， rANP-R：TTCGGTACCGGAAGCTGTTG；rBNP-F：CAATCCACGATGCAGAAGCTG，rBNP-R：GGCGCTGTCTTGAGACCTAA；rGAPDH-F：TCCCATTCTTCCACCTTTGA，rGAPDH-R：ATGTAGGCCATGAGGTCCAC。

1.13　蛋白免疫印迹法（Western blotting， WB）

收集H9C2细胞，提取总蛋白。将蛋白悬液用质量浓度为10% SDS-PAGE电泳分离，转膜后用质量浓度为5%脱脂奶粉封闭1 h，之后加入一抗孵育过夜，TBS洗膜后，二抗室温孵育1 h，洗膜，显影，并运用Image Lab软件进行灰度分析。

1.14　统计学分析

数据采用 GraphPad Prism 软件进行统计学分析并绘图，结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示。两组之间的比较采用学生t检验分析；三组以上的数据分析采用one-way方差分析（ANOVA）。P<0.05被视为有统计学差异。

2 实验结果

2.1　GXN注射液活性成分的筛选

通过TCMSP数据库以及文献检索，对GXN注射液活性成分进行筛选，删除无靶点成分，共获得68个OB≥30%、DL≥0.18的活性成分，其中丹参含61个，川芎含7个。利用TCMSP数据库、BATMAN数据库和SwissTarget数据库，对这68个活性成分进行预测，得到1 281个靶点。

2.2　GXN注射液改善心肌肥厚潜在靶点预测

利用OMIM数据库、GeneCards数据库和DisGeNET数据库，以“心肌肥厚”为搜索关键词，检索心肌肥厚相关靶点。各数据库获得的结果合并后去除重复项，共获得2 972个疾病靶点。

2.3　GXN注射液抗心肌肥厚“药物-成分-疾病-靶点”网络模型的构建与分析

将上述的1 281个成分靶点与2 972个疾病靶点输入Venny 2.1软件绘制维恩图，得到交集靶点382个，即为GXN注射液改善心肌肥厚的潜在靶点（图1）。利用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络模型。其中，药物活性成分以TCMSP数据库中的“MOL”表示（图2）。利用Cytoscape 3.9.1软件中Network Analysis功能进行网络拓扑结构分析，其中度值越大说明该节点在网络中的重要性越大。排名前三的活性成分为：新隐丹参酮（neocryptotanshinone Ⅱ）、米尔顿酮（miltionone Ⅰ）和脱氧隐丹参酮（deoxyneocryptotanshinone）。

2.4　PPI网络模型的构建

将上述的382个交集靶点导入到String数据库中进行PPI网络的构建，即可获得蛋白质相互作用关系。用Cytoscape 3.9.1软件将其可视化（图3）。由图3可见，该网络由310个节点和3 478条边组成。

运用Network Analysis插件分析PPI网络的拓扑属性（表1）。以度值大于2倍the Avg. number of neighbors 的节点为关键靶点，共筛选出100个关键靶点，其中度值排名前10位的靶点分别是SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3、PIK3R1、PIK3CA、HRAS、CTNNB1、JUN和AKT1（图4）。

2.5　GO功能分析和KEGG通路分析

将筛选出的100个关键靶点输入Metascape数据库，进行GO功能分析和KEGG通路分析（图5）。结果显示，GXN注射液改善心肌肥厚的生物学过程（Biological Process，BP）主要集中在蛋白质磷酸化的正调节、蛋白质磷酸化、对激素的反应、细胞迁移的正向调节、MAPK级联和平滑肌细胞迁移的调节等（图5）。分子功能（Molecular Function，MF）集中在蛋白激酶活性、激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、转录共调节子结合、磷酸酶结合和MAP激酶激酶活性等方面。相关的细胞成分（Cellular Component，CC）有膜筏、转录调节复合物、受体复合物、囊泡腔、细胞质核周区和细胞-细胞连接等。KEGG富集分析结果显示，GXN注射液抗心肌肥厚主要涉及MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路、钙信号通路、Wnt信号通路和程序性坏死等通路（图6）。本研究将排名靠前的MAPK信号通路在H9C2细胞上进行验证。

2.6　分子对接

分别将新隐丹参酮、米尔顿酮和脱氧隐丹参酮和PPI网络中度值排名前5位的靶点SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3及PIK3R1进行分子对接，通过结合能评估活性成分与靶点蛋白的结合活性，结合能越低，说明活性成分与靶点蛋白之间的结合越稳定。一般认为，当结合能小于-\mathrm{7}\mathrm{k}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}/\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}时说明活性成分与靶点蛋白之间具有很强的结合能力。活性成分与靶点蛋白之间的分子对接结果见表2。对接结果显示，新隐丹参酮与MAPK1（结合能为-7.37 kcal/mol），米尔顿酮与SRC（结合能为-7.62 kcal/mol），脱氧隐丹参酮和MAPK3（结合能为-\mathrm{11.44} kcal/mol）的对接较为稳定，利用PyMOL软件将结果进行可视化（图7）。由图7可见，新隐丹参酮与MAPK1的氨基酸残基THR-157，米尔顿酮与SRC的氨基酸残基PHE-150、GLU-146、TYR-149、GLN-144，脱氧隐丹参酮和MAPK3的氨基酸残基ASP-345、THR-341、VAL-344、ARG-165、MET-342、TYR-219均可通过氢键建立连接。

2.7　GXN注射液对心肌细胞活力的影响

为了检测GXN注射液对于肥大的心肌细胞活力的影响，在H9C2细胞中，加入不同浓度的GXN注射液培养24 h，检测细胞存活率（图8）。结果显示，GXN注射液在浓度5 μL/mL~20 μL/mL范围内并未对心肌细胞表现出明显的细胞毒作用。在此范围内，选择浓度5 μL/mL、10 μL/mL和20 μL/mL分别作为低、中、高剂量进行进一步实验。

2.8　GXN注射液可抑制心肌细胞肥大

为了探索GXN注射液在Ang II刺激的心肌细胞肥大模型中的作用，以α-SMA染色标记心肌细胞，检测GXN注射液对心肌细胞形态学的影响。结果显示，Ang Ⅱ处理组心肌细胞面积明显高于对照组，而GXN注射液能够降低Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大（图9）。此外，RT-qPCR结果显示，Ang Ⅱ 刺激能够显著增加心肌细胞中肥大标志物ANP和BNP的mRNA 水平，而GXN注射液能够明显抑制肥大相关基因的表达，并且呈现浓度依赖性（图10）。这些结果表明，GXN注射液可抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

2.9　GXN注射液可通过MAPK信号通路抑制心肌细胞肥大

根据KEGG富集分析结果，MAPK信号通路可能是GXN注射液抗心肌肥厚的关键信号通路之一。为了探索GXN注射液抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的作用机制，利用WB法检测心肌细胞H9C2中MAPK信号通路关键蛋白的表达情况。如图11所示，Ang II刺激能够明显增加p-JNK1/2/t-JNK1/2、p-p38/p38以及p-ERK1/2/t-ERK1/2的比值（注：p为磷酸化形式，t为总蛋白），说明Ang II增加了JNK1/2、p38和ERK1/2的磷酸化；而GXN注射液能够明显抑制这些蛋白的磷酸化水平。这些结果均表明，GXN注射液可以通过MAPK信号通路，抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

3 分析与讨论

心肌肥厚是心脏持续暴露于压力超负荷或容量超负荷等引起的心脏组织结构异常病变，心肌发生肥大性重塑，若不及时干预，则心脏会发生进行性心功能障碍，最终导致心力衰竭甚至死亡。病理性心肌肥厚发病机制复杂，目前临床上缺乏有效防治药物。中药因其具有多成分、多途径、多靶点等特点，在防治心肌肥厚中有独特的优势。GXN注射液在临床上常用于治疗冠心病、稳定型或劳累性心绞痛。近年来的研究发现，GXN可降低血浆中BNP的含量，改善心功能^［9］。提示其可能在防治心肌肥厚中发挥重要作用。

本研究基于网络药理学方法，通过挖掘药物的活性成分以及抗心肌肥厚的关键靶点，构建了GXN注射液抗心肌肥厚“药物-成分-靶点-疾病”网络，为阐明中药药效物质基础和作用机制提供指导。并进一步结合分子对接和体外实验进行验证，全方位、多层次阐明了GXN注射液抗心肌肥厚的作用及其机制。结果显示，GXN注射液共筛选出68个活性成分和382个作用靶点，其中度值排名前三的活性成分为新隐丹参酮II、丹参酚醌和脱氧隐丹参酮，均来自于丹参。其中新隐丹参酮II是与丹参酮结构相似的二萜类化合物，由Lee等首先分离出来^［10］。目前关于其活性的研究较少，Wu等证实了新隐丹参酮在脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中的抗炎作用^［11］，而Hao等通过分子对接技术证实了新隐丹参酮II的降血糖活性^［12］。目前，尚未有研究报道新隐丹参酮II在心血管疾病中的作用。本研究为后续探索新隐丹参酮在心血管疾病中的作用提供了理论依据。此外，通过PPI核心靶点互作网络分析发现，SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3等是作用于上述活性成分的关键靶点。其中，SRC蛋白是非受体酪氨酸激酶，可被多条信号转导途径所激活^［13］，而激活后的SRC激酶又通过磷酸化相应靶蛋白的酪氨酸残基使之激活，从而活化下游相应的信号通路，包括MAPK、STAT、PI3K/AKT和EGFR等^［14］。Src激酶可参与AngII等各种原因导致的心脏肥大的信号传导事件^［15］，心脏条件性Src敲除可减弱AngII激活的小鼠心脏纤维化和肥大^［16］。综上所述，GXN注射液中的多种有效成分可通过多种靶点改善心肌肥厚。

为了阐明GXN注射液是如何通过这些靶点发挥抗心肌肥厚作用，本研究对核心靶点进行了KEGG通路分析。结果显示，GXN注射液改善心肌肥厚主要涉及MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路、钙信号通路等。MAPK是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的一员，在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程中起着重要的作用^［17］。在心脏组织中，MAPK信号通路是非常重要的细胞内信号传导途径，对心肌肥大的发生与发展发挥着重要作用^［18］。在肥大的心脏组织和心肌细胞中，MAPK信号通路被激活^［19］。抑制MAPK信号通路可减轻压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚和PE诱导的心肌细胞肥大^［20］。在介导心肌肥大的各种信号通路中，JAK-STAT信号通路在响应压力超负荷以及各种细胞因子等刺激中发挥着重要作用^［21］。STAT可通过其转录作用参与心肌肥大，小鼠心肌组织STAT的过表达可引起心肌肥厚。相反，抑制STAT可抑制胶原合成，改善心肌肥大。STAT是心肌肥大的潜在治疗靶点^［22］。钙信号通路是GXN注射液改善心肌肥厚的又一关键通路，作为细胞内最重要的第二信使，Ca²⁺在心肌细胞的多种功能中均发挥重要作用。在正常生理状态下，Ca²⁺可通过参与心脏兴奋-收缩耦合过程调控心肌细胞收缩。而在病理状态下，钙信号通路的异常可促进心肌肥厚的发生。在心肌肥厚的状态下，心肌细胞内Ca²⁺浓度升高，心肌细胞发生钙超载，同时心肌细胞中钙调控相关基因的表达水平和活性异常，则进一步加重心肌肥厚反应。

为了验证GXN注射液改善心肌肥厚的作用机制，本研究在体外利用Ang II构建心肌细胞肥大模型，表现为心肌细胞面积和心肌细胞肥大相关分子标志物的表达明显上升。而GXN注射液处理后，心肌细胞面积减小，心肌细胞肥大相关分子标志物的表达显著下降，说明GXN可抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。WB实验对KEGG通路分析的结果进行了验证，研究发现，GXN注射液可通过MAPK信号通路抑制心肌肥厚。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接以及体外实验验证等方法，探索了GXN注射液改善心肌肥厚的作用及其机制，证明GXN注射液抗心肌肥厚具有多成分、多靶点和多途径的特点，并在体外构建心肌肥厚模型中证实GXN注射液可通过MAPK信号通路改善心肌肥厚，为GXN注射液的深入开发提供了依据。

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基金资助

国家自然科学基金(82170523)

山西省基础研究计划青年基金(202103021223239)