毛建草速溶红茶制备及生物功能分析

Preparation and Biological Function Analysis of Instant Black Tea of Dracocephalum rupestre Hance

摘要

为实现地方茶种的有效利用，本文通过单因素及正交方法优化了毛建草速溶红茶超声提取工艺，并比较了不同干燥条件对速溶红茶的影响；在感官评估毛建草速溶红茶，分析毛建草红茶及毛建草速溶红茶组分的基础上，分别从清除DPPH∙，抑制α-葡萄糖苷酶，抑制脂肪酶降解月桂酸4-硝基苯酯活性的角度，比较了两者在抗氧化性、降糖、降脂方面的活性。结果显示，在本实验条件下，超声浸提优化条件为：温度70 ℃，料液比为1∶40，时间40 min，干燥方式为冷冻干燥；毛建草速溶红茶较毛建草红茶总多糖含量明显增加，达到40.32%±0.35%；毛建草速溶红茶与毛建草红茶都具有抗氧化性、降糖、降脂活性，在相同条件下，毛建草速溶红茶在抗氧化性（IC₅₀=0.129 mg/mL）与降糖方面（IC₅₀=0.035 mg/mL），优于毛建草红茶。

Abstract

In order to realize the effective utilization of local tea species, the ultrasonic extraction technology of Dracocephalum rupestre Hance instant black tea was optimized by single factor and orthogonal design, and different drying conditions were compared. Based on the analysis of the components of Dracocephalum rupestre Hance black tea and Dracocephalum rupestre Hance instant black tea, their antioxidant, glucose-lowering and lipid-lowering activities were compared by scavenging free radical DPPH∙, inhibiting alpha-glucosidase and lipase degrading 4-nitrophenyl laurate activities, respectively. The results showed that the optimal extraction temperature, extraction time and ratio of material to water were 70 ℃, 40 min and 1∶40. Freeze-drying was the best drying method in the experiments. The content of polysaccharide was significantly higher, up to 40.32%±0.35%, in instant black tea than that in black tea. They both had antioxidant, glucose-lowering and lipid-lowering activities, and instant black tea is superior to black tea in terms of antioxidant activity(IC₅₀=0.129 mg/mL) and glucose lowering (IC₅₀=0.035 mg/mL) at the experimental concentration.

Graphical abstract

关键词

毛建草 / 速溶茶 / 降糖 / 抗氧化 / 降脂

Key words

Dracocephalum rupestre Hance / instant tea / glucose-lowering / anti-oxidation / lipid-lowering

0 引言

毛建草（Dracocephalum rupestre Hance）^［1-2］是唇形科、荆芥族、青兰属一种多年生草本植物，山西西北部多有分布。因其全草含香，发酵晾晒后，冲泡充溢茶香，且有消食解腻功效，当地多作茶饮。《高原中草药治疗手册》记载^［3-4］，毛建草具有清热消炎、凉血止血作用，而且也对外感风热、头痛寒热、黄疸型肝炎、吐血、衄血、痢疾等有一定的疗效。《内蒙古中草药》也有类似记载。近年来，随着对传统中草药的开发，其研究成果也逐渐丰富。Ren等自2005年起陆续报道其组分具有保护心肌细胞、抗肿瘤等作用^［5-7］，Zhu等在2018年报道其提取物具有抗氧化及保护肝脏的潜在效力^［8］，Ban等发现其和Berberidis radix的提取物对沙门氏菌引起的腹泻有治疗潜力，对肠黏膜损伤有显著的修复作用^［9］。Kashchenko等^［10］也报道青兰属植物有消炎、抗菌、抗氧化等功效。近年来山西省委、省政府对药茶产业发展的高度重视，落实打造第七大茶系的决策部署，当地大力支持毛建草特色种植。虽然当前一些茶企业，开发了包括绿茶、红茶、茉莉香型等多种毛建草茶品种，但总体应对2025年药茶产量达到500万吨的规模，产品结构还比较单薄，因而开发毛建草茶饮品种是当务之急。

随着人们对天然来源的健康饮品的需求日益增加，功能性饮品逐渐获得人们青睐^［11］。除了具有营养潜力外，功能性饮料还被用作健康促进剂。而且，功能性饮料也有用作特殊饮品，以增强运动耐力、管理与健康相关的问题，如心脏保护、抗癌、促进消化系统健康、增强免疫防御、抗炎等^［12］。而这些功效则与其所含的天然物质有密切关系^［13-14］。速溶茶的出现，既满足了大多数人对饮茶的需求，也满足了大多数人追求便携、快捷、方便的要求^［15-16］，近年来消费量迅速增加^［17-18］，现今，我国已成为速溶茶第一大生产国。毛建草作为中国西部的一种重要药茶，开发其速溶茶作为终端或中间产品对丰富毛建草药茶品类、开发毛建草功能饮料等都有很大的作用。

毛建草茶功效与其有效成分密切相关，如多酚、黄酮都具有抗氧化、抗菌消炎、保护心血管的功能^［4，6］，咖啡碱可以提神醒脑、促进代谢，多糖具有调节免疫、降血糖、抗肿瘤等作用，氨基酸则可增强免疫力。在茶的滋味方面，多酚是涩味、回甘的来源，黄酮使茶醇厚柔和，咖啡碱则是苦味来源，也增加茶的刺激感。多糖给予茶汤甜味、增加醇厚感和润滑度，氨基酸带来鲜爽、甘醇。速溶茶的生产过程主要包括提取、过滤、真空浓缩和干燥^［19-20］，其中提取^［21-22］与干燥^［23-24］工艺对其活性物质、功能和滋味影响较为显著。而优化速溶茶提取工艺一直以来为研究者们所关注。当前提取工艺主要采用正交试验^［25-26］和响应面法^［27-28］进行优化。正交法试验通过合理的正交设计安排试验，比之响应面法，能用较少的试验次数考察多个因素以及各因素不同水平对试验指标的影响，高效筛选出对结果有显著影响的因素，而且以直观的表格形式呈现各因素水平组合下的指标情况，更易于理解和对比。

因而，本实验以毛建草红茶为主要原料，采用超声浸提方法，通过设计正交试验分析超声浸提温度、浸提时间、料液比等不同条件对毛建草红茶浸出效果的影响，以及通过对相应条件下获取的影响速溶茶茶品的有效成分（如茶多酚、氨基酸、多糖、黄酮、咖啡碱等）的含量来确定浸提工艺参数，并以感官评价来确定干燥方式，从而在此基础上对毛建草速溶茶进行组分分析、生物功能检测，旨在探究由毛建草红茶提取速溶茶的加工工艺和开发其生物活性潜力。

1 实验部分

1.1　材料和仪器

可可碱、芸香叶苷、L-谷氨酸购于北京索莱宝科技有限公司；酒石酸钾钠、苯酚、茚三酮、碱式乙酸铅等为北京化学试剂有限公司产品；月硅酸4-硝基苯酯、1，1-二苯基-2-苦肼基、3，5-二硝基水杨酸、α-淀粉酶购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；毛建草及毛建草红茶为宁武县马伦茶叶公司产品。

KQ-400KDE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣），FD-1C-50+真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器），UV-2450紫外分光光度计（日本岛津）、DNM-9606酶标分析仪（北京普朗新）为实验中主要仪器。

1.2　实验方法

1.2.1　毛建草速溶茶的制备

1.2.1.1　制备流程

制备流程为：原料粉碎 → 超声浸提 → 离心分离→ 浓缩 → 灭菌 →干燥。

选用优质的毛建草红茶（或毛建草）作为原料，粉碎，过60目筛备用。精确称取20 g，加入1 L蒸馏水，设置温度为60 ℃，超声浸提30 min，离心倾出上清液，旋蒸浓缩上清液，温度控制在70 ℃~80 ℃。浓缩液灭菌，冷冻过夜，第二日在冻干装置中冻干，比较二者产率及感官特性。

1.2.1.2　单因素试验设计

根据实验操作要素选取超声浸提时间、温度和料液比为试验因素，以浸提产品主要成分得率为评价要素。

1.2.1.3　正交试验设计

基于单因素试验结果，以多糖为评价指标，在提取时间、提取温度及茶水比中选取最佳水平确定正交试验L9（34）的水平，各因素水平设计如表1所示。

1.2.2　毛建草速溶茶各组分含量检测

1.2.2.1　多糖的检测

参考文献［29-30］采用苯酚-硫酸检测方法，略有改动。分别在比色管中加入1.0 mL对应浓度的葡萄糖标准溶液或样品溶液，再加蒸馏水1.0 mL和质量分数6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入5.0 mL浓硫酸，立即盖紧试管盖，涡旋混合均匀。混匀后静置半个小时，使颜色完全展现。在波长488 nm下，测定吸光度A，记录数据。标准曲线线性回归方程为y=-0.107 9+1.549 5x，R²=0.997 6。

1.2.2.2　多酚含量测定

量取没食子酸标准工作液或样品、蒸馏水各1.0 mL，加入福林酚溶液5.0 mL，摇匀，在反应3 min~8 min内，加入4.0 mL碳酸钠溶液，振匀后，在暗处、室温的条件下放置2 h，用紫外-可见分光光度计在波长765 nm处测定吸光度，标准曲线线性回归方程为：y=8.288 5x+0.009 4，相关系数R²=0.999 2。

1.2.2.3　总黄酮含量测定

分别精密吸取0.10 g/L的芸香叶苷（芦丁）标准液 0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL注入25.0 mL的比色管中，各加入8.0 mL的AlCl₃（质量分数为1.5%）和4.0 mL醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH=5.5），再加体积分数50%的乙醇溶液定容，静置30 min。在波长415 nm下测定吸光度，标准线性方程为y=-0.003 04+0.916 76x，R²=0.999 8。样品按标准溶液的制备方法制备待测液，代入标准曲线中计算总黄酮的含量。

1.2.2.4　茶汤中咖啡碱含量的测定方法

将待测的毛建草红茶提取液10.0 mL，加入 0.01 mol/L盐酸4.0 mL和碱式乙酸铅溶液1.0 mL，注入100 mL的容量瓶中加蒸馏水定容，静置等待澄清后过滤，再量取25.0 mL上述滤液，倒入50 mL的容量瓶中，再加入1.0 mL 4.5 mol 硫酸溶液，加蒸馏水至刻度，静置等待澄清后过滤。用10 mm比色杯，波长274 nm下，测吸光度A，代入标准曲线y=-0.106 9+61.812 0x，R²=0.991 82，计算。

1.2.2.5　茶汤中游离氨基酸总量的测定方法

取不同浓度谷氨酸标准液或样品液各1.0 mL注入25 mL比色管中，随后各加入0.5 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.0）和0.5 mL的水合茚三酮溶液（质量浓度为2%），在沸水浴中加热一刻钟，冷却后定容，在波长570 nm下，测定吸光度A。标准曲线方程为y=-0.079 8+2.112 1x，R²=0.980 71。

1.2.3　毛建草速溶茶功能检测

1.2.3.1　抗氧化性

取不同浓度样品溶液1.0 mL，分别准确加入5.0 mL 浓度为100 μmol/L的DPPH∙自由基溶液，乙醇定容至10.0 mL，置于暗处反应10 min，在525 nm波长下测其吸光度A。测定相同条件下同浓度样品溶液吸光度A₁和DPPH∙自由基溶液吸光度A₀，根据公式（1）计算其清除率C：

C=\left(\mathrm{1}-\frac{A-A_{\mathrm{1}}}{A_{\mathrm{0}}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（1）

1.2.3.2　降脂活性检测

参考文献［31-32］的方法，略作修改。在不同EP管中分别加入450 μL pNP Laurate 底物工作液、400 μL缓冲液，50 μL不同浓度的样品溶液，37 ℃孵育10 min后，加入150 μL脂肪酶溶液，避光反应2 h，分别置于48孔板中，采用酶标仪在405 nm波长下测定其吸光度A。不加样品溶液的EP管，补充同体积缓冲溶液，测定的吸光度为A₀，仅有脂肪酶及相同浓度下对应的样品溶液的吸光度为A₁。按公式（2）计算样品对脂肪酶活性的抑制率I。

I=\frac{(A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{1}})-A}{(A_{\mathrm{0}}-A{}_{\mathrm{1}}{}^{})}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（2）

1.2.3.3　降糖活性检测

参考文献［33-34］，首先，依次向EP管吸入不同浓度80 μL样品液，80 μL磷酸缓冲溶液，再加入5 U∙mL{}^{-\mathrm{1}}的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混匀，于37 ℃水浴下孵育10 min。然后，加入10 mmol∙L{}^{-\mathrm{1}}的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）40 μL，于37 ℃水浴反应20 min。最后，向上述溶液中加入160 μL，0.2 mol∙L{}^{-\mathrm{1}}的Na₂CO₃终止反应，分别置于48孔板中，采用酶标仪于λ=405 nm处测定其吸光度A。缓冲溶液代替样品溶液测定吸光度为A₀，不加样品、酶的同体积空白对照组的吸光度为A₁，只不加酶的的同体积空白对照组的吸光度为A₂，按公式（3）计算α-葡萄糖苷酶抑制率I。

I=\mathrm{1}-\frac{A-A_{\mathrm{2}}}{A_{\mathrm{0}}-A{}_{\mathrm{1}}{}^{}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（3）

2 结果与讨论

2.1　毛建草及毛建草红茶水溶产品比较

毛建草速溶红茶从毛建草红茶提取而得，其可溶成分，应主要来自毛建草本身。因而，首先比较了来自茶的速溶粉与来自毛建草本身的速溶粉的产率及表观特征（见表2）。通过感官观察，毛建草原料与毛建草红茶原料速溶产品形态、溶解性差别不大，但色泽、汤色、滋味略有差别。与草相比，毛建草红茶产品颜色较深，香味略浓，滋味更厚重些，这与红茶的制作过程中多酚类物质发生氧化，形成茶黄素、茶红素等色素物质有关。相同提取条件下，毛建草红茶产率略高，归其原因可能是经历杀青、揉捻、发酵等步骤，毛建草茶的可溶性成分相对增加，或溶出率更高。

2.2　毛建草速溶红茶制备工艺优化

2.2.1　浸提工艺

2.2.1.1　浸提因素

由速溶茶制备路线分析，水溶成分溶出是其重要环节，应首先考虑其浸提工艺。提取时间、提取温度、料液比对毛建草速溶红茶功能组分得率的影响见图1，随着浸提时间、温度、料液比的增加，茶汤中的大部分有效成分含量呈现先上升后下降的趋势。茶多酚、氨基酸、咖啡碱和多糖的含量都在30 min时达到最高，黄酮的含量则在浸提时间为40 min时达到最高，可能由于黄酮较难溶于水中，需要较长时间才能达到含量峰值。浸提温度为60 ℃时，茶多酚、多糖和黄酮的含量达到最大值，但是由于氨基酸和咖啡碱的溶解度会随着温度的升高而增加，所以氨基酸和咖啡碱的含量随浸提温度升高而增加。料液比1∶40，茶多酚、多糖达到最大，料液比1∶50，黄酮、氨基酸的浸提效果最好。

2.2.1.2　毛建草速溶茶浸提正交试验优化

浸提液中，酚类及氨基酸含量较高，但比较速溶茶粉中组分含量，多糖含量较为突出，而且，浸提液中酚类物质与多糖类物质随浸提条件变化趋势接近，因而设计试验主要以多糖含量为参照指标。根据表1的三因素三水平设计，试验结果如表3所示。根据毛建草浸提液中多糖含量，可推知得率最高的浸提工艺条件为A₂B₃C₁，在提取时间30 min，提取温度70 ℃，提取茶水比1∶40，多糖含量最高。通过极差R比较，可知B>C>A，即上述因素影响顺序为提取提取温度>料液比>提取时间。通过对k值的比较，可知最佳工艺组合为A₃B₃C₁，即提取时间为40 min，浸提温度为70 ℃，浸提茶水比为1∶40。在该超声优化条件下，毛建草速溶红茶粉得率为22.61%。

2.2.2　干燥工艺选择

浸提液经固液分离、浓缩、干燥得到速溶茶产品。图2为不同干燥形式获得的产品。

鼓风干燥的产品（图2（a））质地偏硬，颜色基本为棕黑色，没有香味，溶解较慢。真空干燥产物（图2（b））偏棕黄，没有香味，溶解速度也较慢，自然风干的产物（图2（c））与鼓风干燥的产品硬度、颜色、溶解性接近。而经过冷冻干燥的产品（图2（d））质地酥脆，颜色呈红棕色，溶解较快，有淡香味，为最优产品。真空干燥过程也隔绝了氧，避免速溶茶一些成分的氧化，但可能由于未经冷冻锁水，导致浓缩液中的有效成分结构被破坏，产品香味丢失较大。

2.3　功能成分比较

如表4所示，速溶茶上述几种功能成分中，多糖含量较高，为40.32%±0.35%，总酚含量8.67%±0.13%，总黄酮含量为4.89%±0.25%，氨基酸含量为5.97%±0.64%，咖啡碱含量较少，0.73%±0.12%，与原茶中含量较低相一致。与毛建草红茶成分含量相比，毛建草速溶红茶多糖大量提升，总酚类含量下降。与绿茶相比，毛建草红茶酚类含量明显下降^［36］，速溶红茶，含量又有下降，这使速溶茶粉较之红茶，在滋味上有所改善^［25］。

2.4　生物活性检测

2.4.1　抗氧化活性

如图3所示，毛建草速溶红茶溶液以及毛建草红茶溶液均对DPPH·自由基溶液有清除效果，整体趋势清除率都随着浓度的增加有所增加。拟合各曲线，得到毛建草红茶、毛建草速溶红茶的IC₅₀分别为0.179 mg/mL、0.129 mg/mL，清除效果为毛建草速溶红茶 > 毛建草红茶。

2.4.2　降脂活性

如图4所示，毛建草红茶和毛建草速溶红茶溶液均对脂肪酶分解底物工作液有抑制作用，且抑制效果随着浓度的增加均有增加趋势。拟合IC₅₀分别为0.096 mg/mL、0.167 mg/mL，抑制效果为毛建草红茶>毛建草速溶红茶。

2.4.3　降糖活性比较

如图5所示，毛建草速溶红茶及毛建草红茶溶液均对α-葡萄糖苷酶分解PNPG有抑制作用，抑制效果随浓度的增加而增强。两者对应IC₅₀分别为0.035 mg/mL、0.048 mg/mL，抑制效果为毛建草速溶红茶>毛建草红茶。

多糖、多酚及黄酮类物质在抗氧化、降脂、降糖方面都有较为明显的功效^［37-39］，毛建草速溶红茶在这些方面表现出来的的功能，显然与这些物质的含量相关，其丰富的多糖的贡献^［40-41］，应是不容忽视的。

3 结论

通过对毛建草速溶红茶浸提工艺单因素及正交试验得出最佳超声浸提料液比1∶40，浸提温度为70 ℃，超声浸提40 min，通过产品的质地、色泽、溶解性等感官评估确定干燥方式优选冷冻干燥。在此条件下，该速溶红茶得率为22.61%，总多糖量为40.32%±0.35%，总酚含量为8.67%±0.13%，总黄酮含量为4.89%±0.25%，氨基酸含量为5.97%±0.64%，咖啡碱含量为0.73%±0.12%。该速溶红茶在抗氧化、降糖、降脂方面都有一定的功效，且在抗氧化性与降糖方面优于毛建草红茶，应归于其较高含量的多糖的贡献。

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基金资助

山西省自然科学基金(202303021222230)

忻州市科技局项目(20220211)