具有双重猝灭机制的高灵敏荧光探针对锌离子的检测

A Highly Sensitive Fluorescent Probe Utilizing a Dual Quenching Mechanism for Zn²⁺ Detection

摘要

针对目前广泛采用的二-（2-吡啶基）胺（DPA）作为Zn²⁺识别基团的各类荧光探针背景荧光普遍偏高的问题，我们提出基于荧光素开闭环和猝灭基团双猝灭机制的OFF-ON型Zn²⁺检测策略，从而提高Zn²⁺荧光探针的灵敏度。本文合成一种含有荧光素前体分子、DPA为识别基团、二甲氨基偶氮苯甲酸（DABCYL）为猝灭基团的锌离子荧光探针（FL-ZJ），通过荧光光谱研究了其与锌离子的荧光响应。研究结果表明，FL-ZJ在526 nm处表现出较低的荧光活性，但是当体系中有锌离子存在时，FL-ZJ在526 nm处的荧光强度增强至原来的约17.4倍，相应的体系颜色由无色变为黄色，其他金属离子的加入不影响FL-ZJ的荧光强度，说明FL-ZJ能够高效灵敏的检测Zn²⁺，其对Zn²⁺的检出限仅为14.6 nmol/L。进一步通过Job′s Plot实验及高效液相色谱推测出该探针检测锌离子的机理为：锌离子的配位诱导了荧光素的开环及猝灭基团的分子内消除反应，进而实现了探针对Zn2+的专一性检测。

关键词

背景荧光 / OFF-ON / 锌离子 / 痕量

Key words

background fluorescence / OFF-ON / zinc ion / trace

0 引言

锌离子是人体必需微量元素、多种酶的活性中心和激活因子，参与生命系统中的各种生理和病理过程^［1］。锌离子作为第二信使之一^［2］，广泛参与动植物的细胞信号转导过程^［3-4］，同时在免疫功能、细胞稳态、神经功能以及胰岛素分泌等中也发挥着至关重要的作用^［5-8］。锌离子浓度需要维持在与之相应生理功能相匹配的水平，偏离正常浓度范围可引起多种病理结果。因此合理地摄入锌离子，对维持正常的生理活动，保持人体健康，增强免疫力，促进发育水平都至关重要^［9］。牡蛎、虾等海产品中含有大量的锌蛋白等生物锌，作为第四代补锌剂逐渐成为补锌最安全有效的锌来源^［10-13］，各类补锌制剂也被广泛用于成长期儿童以及女性孕期微量锌元素的补充。因此，快速、可靠且兼具高选择性和灵敏度的分析方法对于海产品和补锌制剂中Zn²⁺的检测及其在食品安全方面的评价以及锌离子在生理、病理过程中的作用研究是至关重要的。

荧光探针由于其高灵敏度和简单操作在众多检测方法中脱颖而出。大多数Zn²⁺荧光探针主要基于含氮氧供体的配体如二-（2-吡啶基）胺［bis （pyridin-2-ylmethyl） amine，DPA］、N，N'-双（2-吡啶基甲基）-1，2-乙二胺（N，N-Bis（2-pyridylmethyl）ethylenendiamine，BPEA）、N，N，N'-三（吡啶-2-甲基）-1，2-二胺（N，N-Tri（2-pyridylmethyl）ethylenendiamine，TPEA）等作为锌离子择性探针的响应基团^［14-16］。这类探针主要基于光诱导电子（Photo Induced Electron Transfer，PET）机制通过Zn²⁺响应前后荧光的OFF-ON的转化实现锌离子的检测。这种方法通常由于PET的荧光猝灭并不十分完全，导致在锌离子检测或成像分析时不可避免地具有较强的背景荧光，从而降低探针的信噪比，其检出限也通常较高。然而，生命系统中的Zn²⁺浓度很低且其浓度具有快速动态变化的特点，因此目前准确的痕量检测锌离子浓度具有很大的挑战性。

本文基于荧光素母体，设计并合成了一种能够在水环境下特异性检测Zn²⁺的低背景荧光探针分子4，5-双-（2，2'联胺双吡啶）基-，7-二氯-3-（4（二甲氨基）苯基）偶氮苯甲酸酯基荧光素（FL-ZJ）。通过荧光素母体开闭环和荧光猝灭基团的双重猝灭设计，降低了DPA作为响应基团的Zn²⁺探针的背景荧光，克服了现有方法信噪比低、灵敏度不足的缺点。该探针成功实现了对饮用水、黄海对虾以及雏菊中锌离子的检测及成像分析，具有较高的灵敏度和专一性。

1 实验部分

1.1　主要仪器与试剂

主要仪器：Bruker Advance-400型核磁仪（美国，布鲁克·道尔顿公司）；U-2910紫外可见分光光度计（日本，HITACHI）；F-4600荧光光度计（日本，HITACHI）；Primaide高效液相色谱仪（日本，HITACHI）。

主要试剂：2，2'-二吡啶甲基胺购自安耐吉公司；2'，7'-二氯荧光素、4-二甲氨基吡啶以及4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸购自阿拉丁试剂公司；多聚甲醛以及N，N-二甲基甲酰胺等常规试剂购自国药集团化学试剂有限公司；分析测试试剂选用分析纯（A.R.），合成及分析实验如未特别注释，均在室温下进行。

1.2　探针合成

探针4'，5'-双（（双（吡啶-2-亚甲基）氨基）甲基）-2'，7'-二氯-3'-羟基荧光素缩4-（（4-二甲氨基）苯基）偶氮）苯甲酸（FL-ZJ）按照如图1所示路线合成：

1.2.1　FL-DPA的合成

FL-DPA参考文献［17］合成。在100 mL圆底烧瓶中加入1.590 0 g （7.99 mmol），2，2'-二吡啶甲基胺，将其溶解于20 mL乙腈中，搅拌下继续加入0.224 0 g （7.47 mmol）多聚甲醛，该混合溶液80 ℃回流反应30 min后，将溶有起始原料2'，7'-二氯荧光素（FL）（1.001 0 g，2.49 mmol）的30 mL乙腈和水的混合溶液（V/V=1∶1）加入反应体系中，继续回流反应24 h，薄层监测反应终点，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去乙腈，将剩余溶液加热至75 ℃，并加入30 mL的75 ℃的乙醇，继续搅拌1.5 h。随后，将溶液置于-20 ℃的冰箱中静置12 h，此时溶液底部将生成粉色沉淀。减压抽滤，冰水洗涤滤饼3次，烘干，得到粉色固体1.500 0 g，产率为38.46%。¹H NMR （400 MHz， Chloroform-d） δ 8.60 （d， J = 4.8 Hz， 4H）， 8.04 （d， J = 7.3 Hz， 1H）， 7.75~7.60 （m， 6H）， 7.36 （d， J = 7.8 Hz， 4H）， 7.24~7.14 （m， 5H）， 6.64 （s， 2H）， 4.20 （s， 4H）， 4.09~3.92 （m， 8H）。¹³C NMR （101 MHz， Chloroform-d） δ 168.98， 157.6， 155.89， 151.60， 148.80， 148.71， 137.22， 135.27， 130.15， 127.70， 127.06， 124.10， 122.52， 117.53， 111.79， 110.01， 83.30， 59.05， 49.15。

1.2.2　 FL-ZJ的合成

在20 mL圆底烧瓶中加入0.190 0 g（0.99 mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、0.024 5 g（0.20 mmol）4-二甲氨基吡啶、0.250 0 g（0.93 mmol）4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸 （DABCYL），将这些反应物用5 mL二氯甲烷（DCM）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）混合液（DCM 3.4 mL，DMF 1.6 mL）溶解，50 ℃反应约12 h，反应完毕后，冷却至室温。再加入0.336 4 g（0.41 mmol）中间体FL-DPA，继续50 ℃反应12 h后，停止反应，冷却至室温。加DCM稀释反应体系，蒸馏水洗涤除去多余1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶，减压蒸除反应溶剂，粗产品经柱色谱（二氯甲烷∶甲醇=15∶1）纯化，得到红色固体0.076 0 g，产率为14.26%。¹H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 8.32 （dd， J = 15.2， 7.4 Hz， 7H）， 8.06 （d， J = 7.5 Hz， 1H）， 7.98 （dd， J = 8.6， 2.3 Hz， 3H）， 7.89 （d， J = 8.8 Hz， 4H）， 7.80 （t， J = 7.5 Hz， 1H）， 7.47 （td， J = 9.1， 7.7， 2.6 Hz， 3H）， 7.31 （d， J = 8.1 Hz， 3H）， 7.08 （d， J = 6.3 Hz， 4H）， 7.01~6.95 （m， 1H）， 6.89 （d， J = 9.0 Hz， 4H）， 4.42~4.28 （m， 2H）， 4.05 （d， J = 1.5 Hz， 2H）， 3.82 （s， 8H）， 3.11 （s， 6H）。 MS （ESI）： m/z calc. for C₆₁H₄₉Cl₂N₉O₆： 1 073.318 3； found：1 074.330 4 ［M+H］⁺。

1.3　探针FL-ZJ设计思路

基于DPA等配体的Zn²⁺荧光探针通常由于荧光猝灭不完全而有较强的背景荧光，难以获得高信噪比的探针分子。本文以，7-二氯荧光素作为荧光团，通过将荧光素的高效荧光猝灭基团DABCYL经酯键引入到探针母体，合成具有猝灭基团自消除-开闭环双重级联控制的OFF-ON型锌离子探针，待测离子与探针配位后诱导分子内消除反应，进一步诱导荧光素开环进而释放出荧光（图2）。由于猝灭基团的引入进一步降低背景荧光，使得该探针的检出限低于绝大多数已报道的Zn²⁺荧光探针。

1.4　光谱性能测定

将探针FL-ZJ溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1.0×10^-2 mol/L的储备液，放置于冰箱中储藏备用。选择性实验中，各种阴、阳离子及氨基酸均用去离子水配制成1.0×10^-2 mol/L的储备液。除非特别说明，对Zn²⁺的检测均在含有10%甲醇的磷酸缓冲液（PB）（V _MeOH∶V _PB = 1∶9，10 mmol/L，pH=8）中进行。用λ _ex = 485 nm的激发光激发，并收集500 nm~630 nm波长的光谱数据。

2 结果与讨论

2.1　探针FL-ZJ对Zn²⁺的荧光滴定

将不同浓度的Zn²⁺加入含0.5 μmol/L探针的缓冲溶液中，室温反应2 h后，在485 nm的激发波长下进行荧光滴定实验，并采集500 nm~630 nm的光谱数据。如图3（a）所示，探针在PB缓冲液中的几乎没有荧光。随着Zn²⁺的逐渐加入，在526 nm处的荧光逐渐增强。当Zn²⁺的浓度增加到2.0 μmol/L时，体系的荧光强度约增强了17.4倍，表现出了较高的灵敏度。这是因为溶液中的锌离子与探针FL-ZJ的DPA识别基团络合，并进一步与3位羧酸酯上的氧配位，进而诱导猝灭剂DABCYL离去，同时荧光素母体开环，荧光恢复。在0 nmol/L~750 nmol/L测试范围内，锌离子浓度与526 nm处的荧光强度表现出较好的线性关系（图3（b）， R ²=0.994 4）。

2.2　探针FL-ZJ对Zn²⁺响应的选择性研究

为了评价探针分子对锌离子识别的专一性，接下来探究了不同离子对FL-ZJ的响应选择性。探针FL-ZJ的浓度均为5.0×10^-7 mol∙L^-1，Zn²⁺浓度为2.0×10^-6 mol∙L^-1，其他阴、阳离子及氨基酸的浓度均为5×10^-6 mol∙L^-1。配制一系列终浓度为5.0×10^-7 mol∙L^-1的探针PB-MeOH溶液（V _MeOH∶V _PB = 1∶9，10 mmol/L，pH=8），分别加入终浓度为2.0×10^-6 mol∙L^-1的Zn²⁺，或浓度均为5×10^-6 mol∙L^-1的其他阴、阳离子及氨基酸，摇匀并在室温下反应2 h后，用λ _ex = 485 nm的激发光激发，并收集在526 nm波长的光谱数据。结果如图4所示，FL-ZJ对Zn²⁺表现出较好的选择性，其他离子几乎对其不会产生干扰。

2.3　探针FL-ZJ对Zn²⁺响应的Job's Plot实验

分别移取探针FL-ZJ母液和Zn²⁺溶液于1 mL 的PB缓冲液中，保持探针FL-ZJ和Zn²⁺的总浓度为5.00 μmol/L，且［FL-ZJ］/［FL-ZJ+Zn²⁺］比在0.0~1.0范围变化，记录体系在526 nm处的荧光强度，结果如图5所示。随着探针FL-ZJ与Zn²⁺比例的逐渐变化，体系在526 nm处的荧光强度也随之发生变化。当探针［FL-ZJ］/［FL-ZJ+Zn²⁺］为0.5，即探针分子与锌离子的比例为1∶1时，荧光强度达到最高值，这意味着Zn²⁺优先与含有DABCYL基团一侧的DPA基团结合并进一步与FL-ZJ中的酯键O配位，伴随着猝灭剂DABCYL离去，进而开启荧光。当探针FL-ZJ与Zn²⁺以1∶1的比例结合时，DABCYL全部离去，使整个体系荧光恢复呈现最大值，则更多的Zn²⁺与探针配位，荧光不再恢复。

2.4　探针FL-ZJ对Zn²⁺的响应机制推测

进一步探索了探针FL-ZJ对Zn²⁺识别的荧光响应机制，分别将反应原料DABCYL、FLDPA、探针FL-ZJ以及探针FL-ZJ与Zn²⁺反应2 h后的反应体系，吸取50 μL进样到高效液相色谱仪中，监测490 nm通道的色谱流出曲线，结果如图6所示。FL-ZJ与锌离子反应后能够监测到体系解离出的猝灭基团DABCYL，结合Job's plot结果，可以推断探针对锌离子的响应经历了锌离子与猝灭基团一侧DPA结合所诱导的分子内消除反应，进而游离出原料DABCYL基团，Zn²⁺与探针形成1∶1的配合物同时伴随着荧光素母体的开环，探针荧光得以开启。

2.5　探针FL-ZJ在锌离子检测中的应用

2.5.1　水样中锌离子的测定

用娃哈哈纯净水溶解Zn²⁺，配制母液为10^-2 mol/L，研究探针FL-ZJ检测Zn²⁺的可行性。在FL-ZJ（5.00 μmol/L）的2 000 μL PBS缓冲液（pH=9.0）体系中，依次加入1.00 μmol/L，1.50 μmol/L，2.00 μmol/L，3.00 μmol/L，4.00 μmol/L Zn²⁺，测定FL-ZJ在526 nm处的荧光强度。测定结果如表1所示。实际水样中Zn²⁺的加标回收率为99.4%~106.5%，表明本文所合成的锌离子荧光探针具有良好的准确度，可以用于环境水样中的Zn²⁺检测。

2.5.2　黄海对虾中锌离子的测定

虾剥壳清洗，搅碎，蒸干，粉碎，称取30 g用纯净水溶解，离心取上清并定容至500 mL容量瓶，吸取20 μL加入探针溶液进行荧光测定，用荧光光度计读数。从表2中可以得出，黄海对虾中锌的含量为（1.87±0.09） mg/100 g，这一结果与张一华对哈氏仿对虾、南美白对虾和日本沼虾中锌离子的测试结果接近^［18］。由此可见，探针FL-ZJ能够用于检测虾中锌的含量具有可行性。

2.5.3　雏菊花瓣中锌离子成像

取三支同株缔结的白色小雏菊，分别浸泡在0 mol/L，5×10^-5 mol/L，1×10^-3 mol/L的Zn²⁺溶液中48 h，瓶底放入少量小米提供养分。将1×10^-4 mol/L探针溶液盛装到30 mL的喷壶中，在每朵花上均匀喷洒2 mL 100 μmol/L的探针，用365 nm的紫外灯进行照射，观察其荧光及明场情况。

随培养液中锌离子浓度的加大，小雏菊的白色花瓣颜色变深（图7（a）），花瓣颜色与培养液浓度正相关。这意味着，在含高浓度Zn²⁺的培养液中的雏菊有更多的锌离子被运输到花瓣中。同时，如图7（b）所示，在365 nm紫外光照射下，浸泡在不同浓度Zn²⁺的培养液中的雏菊花瓣荧光强度随着Zn²⁺含量的增加也相应地增强。这些结果表明，本文开发出的探针FL-ZJ可以在植物样品中实现Zn²⁺含量的原位检测。

2.6　探针FL-ZJ与已报道锌离子探针比较

DPA基团作为锌离子特异性螯合基团，由于其优异的选择性被广泛用于锌离子荧光探针的开发。在表3中，我们将本工作与部分已报道的基于DPA的锌离子探针进行对比发现，由于FL-ZJ探针中不仅存在DPA识别基团，同时还引入了强荧光猝灭基团DABCYL，从而使其在锌离子检测中形成双猝灭机制，所以相较于已报道的工作，FL-ZJ对锌离子表现出更好的特异性和更低的检出限。

3 结论

综上所述，本文合成了一种以荧光素为母体，DPA基团为识别基团，通过荧光素开闭环及猝灭剂DABCYL双重猝灭机制调控的OFF-ON型Zn²⁺荧光探针FL-ZJ。通过锌离子配位所诱导的开环及猝灭剂DABCYL的分子内消除反应，在485 nm激发光的激发下该探针在526 nm处的荧光强度与锌离子浓度表现出强的正相关性，在0.00 μmol/L~2.00 μmol/L的浓度范围内线性相关。基于该探针，本文实现了饮用水及对虾中锌离子含量的定量测定，同时实现了植物花瓣对环境中锌离子的吸收情况的成像和分析。该探针与已报道的基于DPA识别基团的荧光探针相比，在较低的检出限方面表现出一定的优势，可为在生命体系中痕量锌离子的检测和成像提供支持和依据。

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基金资助

山西省基础研究计划资助项目(202303021211017)

山西省科技创新项目(2023L334)

长治学院校本应用教材建设项目(XN0329)