整合机器学习与分子对接解析附子治疗心力衰竭的分子网络

Integrating Machine Learning and Molecular Docking to Decipher the Molecular Network of Fuzi in Treating Heart Failure

摘要

附子被誉为“回阳救逆第一要药”，在心力衰竭的临床治疗中疗效确切，然而其分子调控网络及具体机制尚未得到系统而深入的阐明。本研究整合基因表达（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库筛选与心力衰竭相关的差异表达基因，并利用公共数据库挖掘附子活性成分及其作用靶点；进一步运用机器学习算法与分子对接技术遴选核心基因，追踪其下游信号蛋白，系统解析附子活性成分与靶蛋白的结合特性。结果显示，附子抗心力衰竭的潜在作用靶点共鉴定出23个。基于机器学习筛选出C-C趋化因子受体1（C-C Motif Chemokine Receptor 1，CCR1）、环氧化物水解酶2（Epoxide Hydrolase 2，EPHX2）、膜金属内肽酶（Membrane Metalloendopeptidase，MME）、胞外-5-核苷酸酶（'5'-Nucleotidase Ecto，NT5E）、磷酸二酯酶5A（Phosphodiesterase 5A，PDE5A）、磷脂酶A2 IIA组（Phospholipase A2 Group IIA，PLA2G2A）等6个关键特征基因。分子对接分析证实，附子中苯甲酰乌头原碱、飞燕草素3，5-双葡萄糖苷、惰碱和伊夫双苷等4种活性成分与EPHX2、MME及PDE5A等3个核心基因具有强结合特异性。进一步在阿霉素（Doxorubicin，DOX）诱导心力衰竭小鼠模型中，发现附子能够通过抑制EPHX2、MME及PDE5A表达，改善DOX引起的心肌萎缩并逆转心肌损伤。蛋白互作数据库预测显示PDE5A与Rho相关BTB结构域蛋白1（RHOBTB1 Rho related BTB domain containing 1，RHOBTB1）相互作用，其结合能为-66.1 kJ/mol，提示RHOBTB1可能为PDE5A的下游结合蛋白。综上所述，附子可能通过调控PDE5A/RHOBTB1信号轴发挥抗心力衰竭作用，为深入解析其分子机制提供了新的视角与理论依据。

Abstract

Fuzi is known as the first key medicine to restore depleted Yang and rescue the patient from danger in Traditional Chinese Medicine (TCM) theory and its clinical efficacy in treating heart failure has been definitely demonstrated. However, its molecular regulatory network and specific mechanisms have not yet been systematically and thoroughly elucidated. This study integrated the Gene Expression Omnibus (GEO) database to screen differentially expressed genes related to heart failure and combined public databases to identify active components of Fuzi and their target genes. Furthermore, machine learning algorithms and molecular docking technology were applied to select core genes and trace their downstream signaling proteins, systematically analyzing the binding characteristics between active components of Fuzi and target proteins. The results revealed 23 potential targets involved in the anti-heart failure effects of Fuzi. Six key feature genes—C-C Motif Chemokine Receptor 1 (CCR1), Epoxide Hydrolase 2 (EPHX2), Membrane Metalloendopeptidase (MME), '5'-Nucleotidase Ecto (NT5E), Phosphodiesterase 5A (PDE5A), and Phospholipase A2 Group IIA (PLA2G2A)—were screened using machine learning algorithms. Molecular docking confirmed strong binding specificity between four active components of Fuzi—delphinidin 3,5-diglucoside, bebzoylaconine, ignavine, and evobioside—with three core proteins: EPHX2, MME, and PDE5A. Furthermore, in a doxorubicin (DOX)-induced heart failure model, we discovered that Fuzi rescued DOX-induced myocardial atrophy and reversed cardiac injury by suppressing the expression of EPHX2, MME, and PDE5A. Protein-protein interaction database prediction indicated a direct interaction between PDE5A and RHOBTB1 Rho related BTB domain containing 1 (RHOBTB1) with a binding energy of -66.1 kJ/mol,, suggesting RHOBTB1 as a downstream binding protein of PDE5A. In summary, Fuzi may exert its anti-heart failure effects by regulating the PDE5A/RHOBTB1 signaling axis, providing new insights and a theoretical basis for further elucidating its molecular mechanisms.

Graphical abstract

关键词

附子 / 心力衰竭 / 磷酸二酯酶5A

Key words

Fuzi / heart failure / Phosphodiesterase 5A

0 引言

心力衰竭（简称心衰）是由于心脏的收缩舒张功能受损，心脏不能正常射血，导致心脏血液循环障碍，是各种心脏疾病的终末阶段，高发病率和高死亡率是其鲜明特征。目前全球有6 430万人患有心力衰竭，作为心力衰竭病例的高发国家，我国过往十年间患病率增幅高达近50%^［1］。现有一线药物血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、β受体阻滞剂、强心剂和利尿剂等，虽能有效缓解症状，但由于心衰病理特征复杂，不足以显著延长心力衰竭患者的生存期且改善预后^［2］。尽管在心力衰竭的调控中已鉴定出许多信号通路，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS）、钠/钙交换器和钙超载^［3］，但目前仍缺乏治疗心力衰竭的新型有效药物及干预靶点。

传统中医根据心衰的临床表现，将其归属于中医学“心悸”“喘证”“水肿”“痰饮”“心痹”等范畴。目前认为，该病病位在心，病变累及肺、脾、肝、肾，心气（阳）虚为本，血瘀、水停为标，实属本虚标实之证^［4］。可见，临证遣方用药，治宜益气温阳、活血利水为法，辨证施治，标本兼治。附子是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaclii Debx.的子根，味辛、甘，性大热，有毒，归心、肾、脾经。附子被记载于最早的中药学著作《神农本草经》中，具有回阳救逆、散寒止痛、温肾回阳等功效，被称为“回阳救逆第一要药”^［5］，临床上用于治疗急/慢性心力衰竭、心肌纤维化、心肌肥厚及心肌梗死等疾病，是目前临床急救用药时使用频率第二的强效中药^［6］。目前附子治疗心力衰竭的机制主要集中于细胞形态和功能，细胞膜稳定性，细胞内离子稳态，离子转运相关ATP酶和离子通道、线粒体结构和功能改变及能量代谢^［7-8］。研究亦表明，附子通过激活线粒体中的沉默信息调节因子2相关酶类3（sirtuin-3，Sirt3）酶活性，显著降低亲环素D（Cyclophilin D，Cyp-D）的乙酰化程度，抑制mPTP通道开放，改善线粒体能量代谢，从而保护心肌组织^［9］。然而，附子对心脏保护作用的具体机制尚未完全阐明。

随着基因芯片技术逐步走向临床，基于机器学习算法精准锁定“特征基因”已成为疾病诊断与机制解析的关键环节。机器学习算法能够使计算机自主从数据中学习潜在规律与模式，进而完成特定预测或分类任务。该类方法擅长捕捉变量间复杂的非线性关系，并识别传统分析方法易于忽略的弱相关特征，从而显著提升特征选择的准确性^［10-11］。为了提高靶基因识别的准确性和置信度，本研究联合采用三种机器学习方法——最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO）^［12］、支持向量机-递归特征消除（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination，SVM-RFE）^［13］以及随机森林算法（Random Forest，RF）^［14］，共同构建特征筛选模型。通过集成不同算法的优势，旨在弥补单一方法的局限性，增强结果的可解释性与稳健性。

基于此，本研究首先结合网络药理学与基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）分析，初步识别附子在治疗心力衰竭过程中的潜在作用靶点。进一步采用多种机器学习算法对初步靶点进行精细化筛选，并通过生物信息学分析、分子对接技术与动物实验验证，系统探索附子抗心力衰竭的关键活性成分、核心靶点及相关信号通路。在此基础上，解析关键成分与核心靶点之间的相互作用模式，从而揭示附子治疗心力衰竭的潜在作用机制，以期为中医药治疗心力衰竭提供新的理论依据与研究思路。

1 材料与方法

1.1　数据库及分析软件

BATMAN-TCM （http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）、Swiss Target Prediction （http：//swisstargetprediction.ch）、GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）、R 4.5.0、GEOquery 2.76.0、dplyr 1.1.4、limma 3.64.1、ggbiplot 0.6.2、ggplot 23.5.2、pheatmap1.0.12、xgboost 1.7.11.1、VIM 6.2.2、rpart.plot 3.1.3、Metrics 0.1.4、rattle 5.5.1、visNetwork 2.1.2、ggpol 0.0.7、sparkline 2.0、DALEX 2.5.2、gbm 2.2.2、Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery数据库（DAVID，http：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）、Cytoscape 3.10.0、AutoDockTools-1.5.7、PyMOL、OpenBabel 3.1.1、微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）

1.2　药物成分及靶点获取

在BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）的Example2模块中，以“Fuzi”为关键词进行检索，设定Score cutoff≥0.86且P≤0.05作为筛选条件，提取活性成分信息；进一步从PubChem数据库中获取活性成分的“Canonical SMILES”，并输入到SwissTargetPrediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch），系统获取并注释各成分的潜在作用靶点。

1.3　疾病数据下载及整理

在GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中，以心力衰竭“heart failure”为关键词，并限定物种为“Homo sapiens”，检索并下载表达芯片数据集（GSE57338、GSE120895）及其对应的平台注释文件GPL11532和GPL21290。将GSE57338作为训练数据集，GSE120895作为验证数据集来源。训练数据集包括313例心肌组织样本，其中136例为非心力衰竭对照样本（Control），177例为心力衰竭（Heart Failure，HF，扩张型心肌病82例和缺血性心脏病95例）患者。

1.4　筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）

采用R语言中的Limma包与sva包对训练集GSE57338进行数据处理。使用“normalizeBetweenArrays”函数对数据进行校正与分析，并在此基础上消除批次效应。随后，通过箱线图对标准化后的数据分布进行可视化。为准确筛选与心力衰竭相关的DEGs，设定筛选阈值为|log₂FC| > 0.585且P < 0.05，利用pheatmap和ggplot2包分别绘制热图与火山图，以直观展示差异基因表达模式。同时通过主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）评估样本聚类情况，确保数据质量可靠，为后续分析提供稳健基础。

1.5　药物-疾病交集基因进行GO和KEGG富集分析

将附子活性成分的潜在靶基因与心衰相关DEGs进行韦恩图分析，获取共有调控靶基因。随后，将交集基因导入DAVID数据库（http：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物种为“Homo sapiens”，进行基因本体（Gene Ontology， GO）生物功能分析，包含生物过程（Biological Process， BP），细胞组成（Cellular Component， CC），分子功能（Molecular Function， MF），并进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析。进一步借助微生信平台对错误发现率（False Discovery Rate，FDR）<1的GO条目及相关信号通路结果进行可视化。

1.6　机器学习筛选特征基因

为了系统地识别附子抗心力衰竭的生物标志物，构建了一个集成多种机器学习算法的综合预测框架。针对药物-疾病交集基因，通过最小绝对收缩和选择算子（Lasso）回归、SVM-RFE和RF 3种机器学习算法，筛选特征基因，并取交集为最终核心基因。Lasso回归借助glmnet包（α=1，type.measure=“deviance”，10折交叉验证（Cross Validation，CV））在惩罚系数\lambda最小处自动收缩冗余变量，输出高判别力的候选基因^［12］；SVM-RFE（e1071+caret，10折CV）递归剔除低贡献特征，可在小样本高维场景下获得稀疏而稳定的基因子集^［13］；随机森林则通过randomForest包构建1 500棵决策树，以变量重要性排序结合网格交叉验证，稳健捕捉非线性信号^［14］。进一步在验证数据集（GSE120895）中进行表达量验证，P<0.05表示差异显著。

1.7　药物-成分-靶点-通路（C-T-P）网络的构建与分析

为系统揭示药物活性成分、作用靶点及相关通路之间的复杂调控关系，构建两类核心网络：化合物-靶点（C-T）网络与靶点-通路（T-P）网络。进一步利用Cytoscape 3.10.0软件中的Merge功能对上述网络进行整合，构建化合物-靶点-通路（C-T-P）多层次调控网络图。

1.8　分子对接

从UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）中筛选并确定人类（Homo sapiens）对应的Entry，获取靶点信息。随后，基于RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org）下载相应靶点的PDB格式三维结构文件。利用AutoDock对靶点结构与相应活性成分进行分子对接分析，最终通过PyMOL软件对对接结果进行可视化。

1.9　核心基因下游蛋白的筛选

根据GeneMANIA数据库（http：//genemania.org/）和DisNor数据库（https：//disnor.uniroma2.it/）来寻找下游信号的核心蛋白质基因。进一步通过分子对接确证其结合程度。

1.10　动物实验验证

1.10.1　附子水提液的制备

称取黑顺片（购自晋中市中医院，经鉴定为毛茛科植物乌头的子根的加工品）20 g，分别加10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次1 h，过滤合并药液，水浴浓缩至1 g/mL生药量的煎煮液即为附子水煎液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.10.2　动物分组、造模及给药

雄性C57BL/6小鼠（5~6周龄，18~20 g）购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（京）2019-0008。动物饲养于山西中医药大学无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级动物实验室。所有动物实验均获得山西中医药大学动物护理和使用委员会批准。

将小鼠随机分为3组，每组6只，分别为对照组（Control，生理盐水，i.g.）、模型组（阿霉素， Doxorubicin， DOX，20 mg/kg，i.p.）、模型+附子组（DOX+Fuzi，1.5 mg/kg，i.g. 相当于临床剂量9 g）。参照课题组前期研究，小鼠单次腹腔注射阿霉素（DOX，20 mg/kg）诱导心力衰竭。在DOX注射前后分别对小鼠连续7天灌胃给药。实验结束后，解剖各组小鼠的心脏组织并称重，计算心脏重量与体重比值（HW/BW）。其中一部分冻存于-80 ℃，用于心脏组织RNA提取；另一部分用4%（w/V）多聚甲醛固定，用于后续石蜡切片。

1.10.3　苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色

心脏组织用4%（w/V）多聚甲醛固定，修剪、脱水、包埋和切片，HE染色分析组织病理学。

1.10.4　实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）

从心脏组织中提取mRNA，并测定RNA浓度，以RNA为模板，使用逆转录试剂盒进行cDNA合成。利用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站设计关键基因引物并合成。使用SYBR Premix Taq II试剂盒配制反应体系进行扩增。获取样品Tm值和Ct值，采用2^-△△Ct计算基因相对表达水平。

1.11　统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据以\overline{x}\pm s表示，采用单因素方差分析处理数据，P<0.05有统计学意义。

2 实验结果

2.1　附子成分与靶点获取

基于BATMAN-TCM数据库筛选，共获得47个结构明确的附子活性成分。随后结合SwissTargetPrediction数据库对这些成分进行靶点预测，经过数据整合并删除冗余条目后，共鉴定出923个附子的潜在药物靶点。

2.2　心力衰竭DEGs的筛选

为了尽量减少批次效应，对基因表达矩阵进行了归一化。从GEO数据库获取训练数据集GSE57338（136例非心力衰竭和177例心力衰竭样本），PCA结果显示，样本点聚集良好、重叠较少，表明所选样本具有良好的代表性（图1（a））。差异表达分析共识别出286个心力衰竭组织与健康组织之间的差异表达基因，其中152个为上调基因，134个为下调基因（图1（b）—图1（c））。火山图（图1（b））直观展示了差异基因的整体分布情况：红色代表上调基因，蓝色代表下调基因，灰色表示未达到显著差异的基因。进一步通过聚类热图（图1（c））展示了这些差异基因的表达模式，图中红色区域表示基因表达上调，蓝色区域表示表达下调，反映了不同样本中基因表达的异质性。

2.3　附子治疗心力衰竭靶点的获取

为获取附子治疗心力衰竭的潜在靶点，将附子预测靶点与DEGs取交集，Venny图分析共鉴定出23个关键靶点（图2（a））。进一步通过直方图、火山图与热图分析其表达模式，确定其中12个为上调基因，11个为下调基因（图1（b），图2（b）—图2（c））。

2.4　附子治疗心力衰竭功能与通路的富集分析

通过DAVID数据库对23个附子治疗心力衰竭的潜在靶点进行功能注释分析。GO功能富集结果表明（图3（a）），附子治疗心力衰竭主要参与蛋白质水解（Proteolysis）、血管生成（Angiogenesis）、免疫应答（Immune Response）、参与炎症反应的白三烯生成（Leukotriene Production Involved in Inflammatory Response）、蛋白质代谢过程中的蛋白质水解（Proteolysis Involved in Protein Catabolic Process）、核膜（Nuclear Membrane）、细胞膜（Plasma Membrane）、细胞外泌体（Extracellular Exosome）、细胞外基质（Extracellular Space）、相同蛋白质结合（Identical Protein Binding）等生物功能。KEGG富集分析显示（图3（b）），附子治疗心力衰竭主要参与肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system）、凋亡（Apoptosis）、脂肪细胞因子信号通路（Adipocytokine Signaling Pathway）、FcεRI信号通路（Fc Epsilon RI Signaling Pathway）、花生四烯酸代谢（Arachidonic Acid Metabolism）、烟酸和烟酰胺代谢（Nicotinate and Nicotinamide Metabolism）等通路。

2.5　特征基因筛选

采用三种机器学习方法筛选心力衰竭相关特征基因，结果显示：Lasso回归在交叉验证误差最小时得到10个特征基因（图4（a）—图4（b）），SVM-RFE得到22个（图4（c）—图4（d））， 随机森林得到23个（图4（e））。进一步取三者交集，共获得9个核心靶点（图4（f）），分别为：C-C趋化因子2（C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2）、C-C趋化因子受体1（C-C Motif Chemokine Receptor 1，CCR1）、环氧化物水解酶2（Epoxide Hydrolase 2，EPHX2）、钾钙激活通道N亚家族成员3（Potassium Calcium-Activated Channel Subfamily N Member 3，KCNN3）、膜金属内肽酶（Membrane Metalloendopeptidase，MME）、胞外-5-核苷酸酶（'5'-Nucleotidase Ecto，NT5E）、磷酸二酯酶5A（Phosphodiesterase 5A，PDE5A）、磷脂酶A2 IIA组（Phospholipase A2 Group IIA，PLA2G2A）、类视黄醇X受体（Retinoid X Receptor Gamma，RXRG）。

2.6　验证特征基因表达

为进一步验证核心特征基因在心力衰竭与健康组织中的表达差异，从GEO数据库中获取验证数据集GSE120895（8例非心力衰竭和47例心力衰竭样本）进行分析。结果显示，与对照组相比，心力衰竭组中CCR1、EPHX2、MME、NT5E、PDE5A和PLA2G2A的表达水平均显著上调，表明这些基因在两组间具有显著差异（图5，P < 0.05）。值得注意的是，其中CCR1与PLA2G2A在训练集与验证集间的表达趋势存在不一致，提示其表达模式可能受到数据集异质性因素的影响，值得在后续研究中进一步探讨。

2.7　药物-成分-靶点-通路网络图

为系统揭示药物活性成分、作用靶点及相关通路之间的复杂调控关系，整合前述分析所得的47个活性成分、23个潜在靶点（其中6个核心特征基因）及9条关键信号通路，利用Cytoscape软件构建了药物-成分-靶点-通路（C-T-P）整合网络图（图6）。

2.8　核心基因和活性成分的分子对接分析

为了验证6个特征基因（CCR1、EPHX2、MME、NT5E、PDE5A和PLA2G2A）与其所对应的成分之间的潜在结合相互作用，我们进行分子对接，结果见表1，其中4个成分与3个靶蛋白（EPHX2、MME和PDE5A）之间具有很强的结合亲和力（结合能<-33.5 kJ/mol）。结合构象的可视化结果（图7）显示飞燕草素3，5-双葡萄糖苷（Delphinidin 3，5-Diglucoside）与EPHX2（PDB ID： 8QVF）的结合能为-33.9 kJ/mol，其主要与EPHX2的TYR-343和GLN-384残基形成氢键；苯甲酰乌头原碱（Benzoylaconine）与MME（PDB ID： 2YB9）的结合能为-33.5 kJ/mol，其主要与MME的THR-99、ARG-102、ARG-390和THR-404残基形成氢键；惰碱（Ignavine）与PDE5A（PDB ID： 2XSS）的结合能为-33.9 kJ/mol，其主要与PDE5A的ARG-400、GLN-413和LYS-416残基形成氢键；伊夫双苷（Evobioside）与PDE5A（PDB ID： 2XSS）的结合能为-34.7 kJ/mol，其主要与PDE5A的LYS-416和GLN-469残基形成氢键。

2.9　下游蛋白的筛选

为了筛选核心基因（EPHX2、MME和PDE5A）对应的下游信号蛋白，分别通过GeneMANIA（图8（a））和DisNor（图8（b））数据库预测其相互作用蛋白及分子网络。进一步通过取两者交集且预测PDE5A的蛋白相互作用，得到一个下游信号蛋白为RHOBTB1（图8（c）—图8（d））。蛋白对接模拟预测PDE5A的氨基酸残基，包括GLU-482、GLU523、PRO-731、ARG-735、THR-742、ARG-765、GLN-817与RHOBTB1中的SER-589、ASP-201、VAL-72、ASP-71、ARG-68、GLU-64、ARG-9强烈结合，其结合能为-66.1 kJ/mol（图8（e））。基于以上信息，推测RHOBTB1为PDE5A的下游结合蛋白，且PDE5A-RHOBTB1可能是附子治疗心力衰竭的信号轴。

2.10　动物实验验证

为了探讨附子对心力衰竭的治疗作用，采用单次腹腔注射DOX（20 mg/kg）建立心力衰竭模型。心脏形态学观察显示，与对照组相比，模型组小鼠心脏明显缩小，而附子干预明显增加心脏重量与体重的比值（HW/BW）（图9（a）—图9（b），P<0.05）。HE染色结果表明，对照组小鼠心肌组织排列整齐、结构均匀，细胞间隙正常；而模型组小鼠心腔边界扩大，心肌间隙显著增宽。附子治疗后，上述病理变化得到明显改善（图9（a））。此外，与对照组相比，模型组心力衰竭标志物Nppa基因水平升高约2倍，而附子处理可显著降低其表达（图9（c），P<0.01）。这提示附子能够改善DOX诱导的心肌萎缩，逆转心肌损伤。

为了进一步探究附子对心力衰竭小鼠特征基因表达的影响，采用qPCR检测了相关基因的表达水平。结果表明，与对照组相比，模型组中CCR1、EPHX2、MME、PDE5A和PLA2G2A的基因水平均显著升高，经附子干预后，以上基因的表达均被显著抑制（图10，P<0.05）。结合分子对接进一步说明附子通过抑制Ephx2、Mme、Pde5a表达治疗心力衰竭。

表1　成分-靶点作用的分子对接验证

Table 1　Molecular docking verification of component-target interactions

3 分析与讨论

心力衰竭是一类具有高发病率与高死亡率特征的重大全球性健康问题^［1］，其发生发展涉及多种复杂机制和病理过程，目前缺乏安全有效的药物来充分预防或治疗心力衰竭。大量临床证据表明，中药附子及活性成分能显著提高心输出量、心脏指数及左室射血分数，并降低B型利钠肽前体（Pro-BNP）水平，从而改善心功能并提升患者临床预后^［15］，但其背后的分子调控图谱与作用机制仍缺乏系统解析，亟待深入阐明。

本研究基于GEO数据库系统筛选了附子治疗心力衰竭的潜在分子靶标，共鉴定出12个为上调基因和11个为下调基因（图1和2）。KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要参与肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin System）、凋亡（Apoptosis）、脂肪细胞因子信号通路（Adipocytokine Signaling Pathway）、FcεRI信号通路（Fc Epsilon RI Signaling Pathway）、花生四烯酸代谢（Arachidonic Acid Metabolism）、烟酸和烟酰胺代谢（Nicotinate and Nicotinamide Metabolism）等通路。此外，通过机器学习算法筛选出9个特征基因，其中6个核心基因（CCR1、EPHX2、MME、NT5E、PDE5A和PLA2G2A）在验证数据集中得到确认（图4—图5）。

值得注意的是，在训练数据集中观察到CCR1和PLA2G2A为下调基因，在验证数据集中却呈现高表达。研究表明，CCR1的表达下调反映了心力衰竭发生和发展过程中的关键病理变化^［16］；而PLA2G2A在扩张型心肌病中也表现为低表达^［17］。然而，研究亦表明，在肌钙蛋白I特异性T细胞移植诱导的小鼠心力衰竭模型中，CCR1表达升高并伴随炎症与纤维化^［18］；PLA2G2A则通过诱导神经炎症，促进心力衰竭大鼠的心脏交感神经过度神经支配、肾交感神经活性增强、心肌重塑和收缩功能障碍^［19］。本研究基于DOX诱导心力衰竭模型进一步厘清这一争议：与对照组相比，模型组中CCR1和PLA2G2A的表达均显著上调，而附子干预可有效抑制两者的表达（图10），这一结果进一步支持了CCR1与PLA2G2A在心力衰竭发生过程中呈现高表达的观点。分子对接进一步揭示4个附子活性成分（飞燕草素3，5-双葡萄糖苷、苯甲酰乌头原碱、惰碱和伊夫双苷）与3个核心基因（EPHX2、MME和PDE5A）之间通过特定氨基酸介导的强结合亲和力（图7）。此外，在DOX诱导心力衰竭小鼠模型中，附子能够通过抑制EPHX2、MME及PDE5A表达，改善DOX引起的心肌萎缩并逆转心肌损伤（图9—图10）。以上结果表明EPHX2、MME和PDE5A可能是附子在发挥心力衰竭治疗作用中的关键分子靶点。

鉴定的核心基因在附子治疗心力衰竭中表现出多方面的作用：细胞色素P450将花生四烯酸代谢为环氧二十碳三烯酸（EETs），具有多种生物学效应，包括血管舒张、促血管生成、抗炎、细胞保护及镇痛作用^［20］。心脏缺血后，EETs诱导的冠状动脉扩张可增加心肌的氧和营养供应，同时EETs信号通路可保护心肌细胞免受缺血后线粒体损伤^［21］。可溶性EPHX2通过将EETs水解为活性较低的二羟基二十碳三烯酸而削弱其益处。研究表明，EPHX2的药理学抑制可增强内源性EETs的作用，并改善缺血后心脏功能^［22］。MME是一种跨膜糖蛋白，其胞外C端结构域含有高度保守的锌结合基序^［23］。MME在心脏组织中表达，在主动脉瓣狭窄和心力衰竭患者中随酶活性升高而上调，通过代谢利钠肽参与心脏结构与功能的调控^［24］。磷酸二酯酶5A（PDE5A）是首个被发现的cGMP选择性磷酸二酯酶，其活性受cGMP激活，同时抑制cGMP的合成。cGMP及其靶激酶PKG均已知可调控心肌细胞的收缩功能和应激反应^［25-26］。激活cGMP-PKG信号通路可产生心肌保护效应，改善心肌细胞存活与线粒体功能，并维持钙稳态，已被用于心力衰竭的治疗^［27］。研究表明，PDE5A抑制剂在血管紧张素Ⅱ诱导的心力衰竭模型中逆转左室功能障碍、炎症免疫反应及心肌重构^［28］。以上基因的协同作用揭示了代谢失调与心力衰竭的复杂网络，为后续机制研究和靶向干预提供了理论依据和关键靶点。

Rho相关BTB结构域蛋白1（RHOBTB1）是一种非典型Rho GTP酶，其作为底物衔接蛋白，将磷酸二酯酶5（PDE5）递送至Cullin-3 E3泛素连接酶复合体进行泛素化^［29］，从而抑制PDE5活性，增强了一氧化氮（NO）诱导的环磷酸鸟苷（cGMP）反应，从而预防高血压、血管平滑肌功能障碍和动脉僵硬等心血管疾病的发生^［30］。本研究利用多个蛋白相互作用数据库预测出其核心基因PDE5A与RHOBTB1相互作用，其结合能为-66.1 kJ/mol（图8），因此推测RHOBTB1为PDE5A的下游结合蛋白，且PDE5A/RHOBTB1轴可能是附子抗心力衰竭的潜在信号通路。

4 结论

本研究初步阐释了附子抗心力衰竭的分子调控网络，但仍存在一定局限性：尽管通过机器学习、分子对接及动物实验，初步阐明附子能够通过抑制EPHX2、MME及PDE5A表达发挥抗心力衰竭作用，并将PDE5A/ RHOBTB1轴识别为潜在的关键信号通路，但其具体的生物学功能、上下游调控关系及在附子治疗中的作用，仍有待后续研究阐明。为此，我们后续研究中将通过Co-IP和GST-pull down等实验验证PDE5A与RHOBTB1的相互作用，并基于体内外功能实验系统揭示该轴在附子干预心力衰竭中的分子机制。

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基金资助

国家自然科学基金(82505236)

山西省基础研究计划青年项目(202403021212245)

山西省中医药管理局科研课题(2024ZYY2B059)

山西省高等学校科技创新项目(2024L266)

中药生命组学与创新药物研发研究室(zyyyjs2024019)

山西中医药大学博士科研启动基金(2024BK01)

山西中医药大学优秀博士毕业生来晋工作奖励经费科研启动基金(2024BKS04)

山西中医药大学科技创新能力培育计划基础与临床合作研究专项(2024PY-JL-20-02)

山西中医药大学科技创新能力培育计划国家自然科学基金培育专项(2024PY-NS-025)

山西中医药大学研究生科研实践创新项目(X2025KY020)