基于网络药理学探索银丹解毒颗粒治疗甲型流感的机制

Exploring the Mechanism of Yindan Jiedu Granules in Treating Influenza A Based on Network Pharmacology

摘要

流行性感冒在中医理论体系中归属于“时行感冒”及“疫病”范畴，银丹解毒颗粒为具有明确疗效的中药治疫复方，本研究旨在综合利用网络药理学和分子对接技术，预测其治疗甲型流感的潜在作用靶点及信号通路，并结合体内药效学实验研究其机制。首先，借助中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology， TCMSP） 和Swiss Target Prediction数据库筛选银丹解毒颗粒的活性成分，获得99种活性化合物及612个药物作用靶点。同时，从GeneCards和在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库获取2 366个甲型流感相关靶点，取交集得218个银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在靶点。利用Cytoscape软件分析得到香叶木素、黄芩素、去甲汉黄芩素、金合欢素等为银丹解毒颗粒的关键活性成分。通过基因/蛋白质相互作用检索工具数据库（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，STRING）平台构建蛋白质-蛋白质相互作用 （Protein-Protein Interaction， PPI） 网络，确定信号转导与转录激活因子3 （Signal Transducer and Activator of Transcription 3， STAT3）、白细胞介素- 6 （Interleukin-6， IL-6）、肿瘤坏死因子 （Tumor Necrosis Factor， TNF） 等为关键靶点蛋白。分子对接结果显示关键活性成分与关键靶点蛋白之间亲和力较强。基因本体（Gene Ontology， GO）功能和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析显示银丹解毒颗粒可能通过调控磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B （Phosphatidylinositol 3-Kinase-Protein Kinase， PI3K-Akt）、TNF和核因子κB （Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells， NF-κB） 等信号通路介导细胞凋亡与炎症反应。采用甲型H1N1流感病毒FM1株致小鼠病毒性肺炎模型和PR8株致死模型开展体内实验。在病毒性肺炎模型中，银丹解毒颗粒高、中剂量均明显降低病毒性肺炎小鼠肺指数及病毒载量（P<0.05），各剂量银丹解毒颗粒均明显抑制肿瘤坏死因子-α （Tumor Necrosis Factor-Alpha， TNF-α）、干扰素-γ （Interferon-Gamma， IFN-γ）、IL-6的释放（P<0.01），银丹解毒颗粒高、中剂量均明显改善肺组织病理损伤（P<0.01或P<0.05）。在致死模型中，银丹解毒颗粒各剂量均显著降低死亡率（死亡保护率达22.22%~55.56%）并延长生存时间（生命延长率达27.92%~51.95%）。结果表明，银丹解毒颗粒可能通过关键活性成分协同作用于IL-6、TNF、STAT3等关键蛋白靶点，抑制病毒复制、减轻炎症反应及改善肺组织损伤，从而发挥治疗甲型流感的作用，改善H1N1流感病毒感染结局。

Abstract

Influenza belongs to the categories of "seasonal epidemic cold" and "epidemic disease" in traditional Chinese medicine theory. Yindan Jiedu Granules (YDJD) is a proven effective traditional Chinese medicine compound for treating pestilence. This study aimed to comprehensively utilize network pharmacology and molecular docking techniques to predict its potential targets and signaling pathways in treating influenza A, and to investigate its mechanisms through in vivo pharmacodynamic experiments. First, the active components of YDJD and its targets were screened using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) database and the Swiss Target Prediction database respectively, identifying 99 active compounds and 612 drug targets. Simultaneously, 2 366 influenza A-related targets were obtained from the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) databases, and an intersection analysis yielded 218 potential targets for YDJD in treating influenza A. Using Cytoscape software, diosmetin, baicalein, norwogonin and acacetin were identified as key active components of YDJD. A protein-protein interaction (PPI) network was constructed via the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) platform, identifying Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3), Interleukin-6 (IL-6) and Tumor Necrosis Factor (TNF) as key target proteins. Molecular docking results showed strong binding affinity between the key active components and the key target proteins. Gene Ontology (GO) functional enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses indicated that YDJD may regulate signaling pathways such as Phosphatidylinositol 3-Kinase-Protein Kinase (PI3K-Akt), TNF and Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells (NF-κB) to mediate apoptosis and inflammatory responses. In vivo experiments were conducted using an H1N1 FM1 strain-induced viral pneumonia model and a PR8 strain-induced lethal model in mice. In the viral pneumonia model, both high and medium doses of YDJD significantly reduced the lung index and viral load in mice (P<0.05). All doses of YDJD significantly inhibited the release of Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α), Interferon-Gamma (IFN-γ) and IL-6 (P<0.01). High and medium doses of YDJD notably improved lung tissue pathological damage (P<0.01 or P<0.05). In the lethal model, all doses of YDJD significantly reduced mortality (with survival protection rates ranging from 22.22% to 55.56%) and extended survival time (with life extension rates ranging from 27.92% to 51.95%). The results suggested that YDJD may exert therapeutic effects against influenza A by synergistically acting on key protein targets such as IL-6, TNF and STAT3 through its key active components, thereby inhibiting viral replication, alleviating inflammatory responses, improving lung tissue damage and ultimately ameliorating the outcomes of H1N1 influenza virus infection.

Graphical abstract

关键词

医疗机构制剂 / H1N1 / 靶点预测 / 分子对接 / 炎症反应

Key words

hospital preparations / H1N1 / target prediction / molecular docking / inflammatory response

0 引言

流行性感冒（流感）是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，依据病毒核心蛋白的差异，可分为甲、乙、丙、丁四种类型，其中甲型和乙型流感病毒每年可引起季节性流行，而甲型流感病毒更因抗原易变，具有引发全球大流行的潜力，对公共卫生安全构成持续威胁^［1］。尽管流感大多呈自限性，但婴幼儿、孕产妇、老年人及慢性病患者等特殊群体感染后，重症与死亡风险显著增加。目前，我国上市的抗流感病毒药物主要包括神经氨酸酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和血凝素抑制剂三大类^［2］。然而，由于流感病毒的高变异性，单一使用抗病毒西药治疗易产生耐药性，且常伴随不同程度的副作用^［3-4］。在此背景下，中医药凭借其多靶点、整体调节的独特优势，通过抑制病毒复制、调节机体免疫炎症反应、改善临床症状等多途径协同作用，有效降低并发症发生率、缩短病程，并减轻西药不良反应，在流感防治体系中占据重要地位^［5-7］。

中药治疗流感的机制呈现多成分、多靶点协同作用特征。中药单体如黄芩苷可通过半胱天冬酶-3/消皮素E（Cysteine-dependent Aspartate-specific protease-3/Gasdermin E，Caspase‑3/GSDME）信号通路抑制甲型H1N1流感病毒（influenza A virus subtype H1N1，H1N1）诱导的肺泡上皮细胞焦亡^［8］；连翘苷可抑制H1N1病毒复制，降低炎症因子TNF-α（Tumor Necrosis Factor-Alpha）、IL-6（Interleukin-6）水平，调节CD4阳性/CD8阳性T淋巴细胞（CD4-positive /CD8-positive T lymphocytes，CD4⁺/CD8⁺ T）平衡^［9］；木犀草素通过抑制糖原合成酶激酶 3β（Glycogen Synthase Kinase 3 beta，GSK3β）活性激活核因子E2相关因子2/血红素氧合酶1（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2/Heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）通路，进而抑制流感病毒引发的炎症反应^［10］。复方制剂如柴芩石膏汤通过抑制白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）和TNF-α释放缓解炎症，改善流感患者咽喉疼痛、肌肉酸痛等症状^［11］；连花清瘟胶囊/颗粒与奥司他韦联用可提升患者免疫功能、降低炎症因子水平，缩短退热及治疗周期^［12-13］。这些研究表明，中药可通过靶向病毒复制关键环节、调控炎症信号通路、平衡机体免疫功能等多途径发挥抗流感作用。然而，不同中药制剂的具体作用靶点与调控网络存在差异，因此有必要针对特定制剂开展深入的机制研究。

银丹解毒颗粒为首都医科大学附属北京地坛医院的医疗机构制剂，获北京市药品监督管理局批准用于新型冠状病毒感染（Coronavirus Disease 2019， COVID-19）的治疗（京药制备字Z20200012000）。临床研究显示，银丹解毒颗粒安全性良好，可显著缩短发热时间与肺部炎症吸收周期，加速轻、中型或CD4⁺ T细胞计数较低的COVID-19患者的康复进程^［14-15］。机制研究提示，银丹解毒颗粒可能通过其含有的黄芩苷、绿原酸、槲皮素等活性成分，一方面阻断病毒入侵与复制关键环节，缩短核酸转阴时间；另一方面靶向NF-κB信号通路，抑制NF-κB p65核转位及IκBα磷酸化，减少IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子释放，减轻肺部炎症渗出与肺水肿，同时调节 CD4⁺T 细胞计数及 CD4⁺/CD8⁺T 细胞平衡，改善免疫紊乱，从而发挥抗病毒、抗炎、免疫调节的综合效应^［16］。

随着呼吸道传染病疾病谱的演变及临床需求的日益多样化，拓展银丹解毒颗粒的临床应用范围具有重要现实意义。流感在中医理论中归属于“时行感冒”及“疫病”范畴，其“疫毒犯肺”的核心病机与银丹解毒颗粒的主治病证高度相似。前期研究证实，银丹解毒颗粒在流感动物模型中能有效降低肺损伤、提高生存率，并因此获批新增“流行性感冒”治疗适应证（京药制备字Z20200012006）。尽管银丹解毒颗粒治疗流感的药效已得到初步验证，但其抗流感的具体分子靶点、关键活性成分及其调控的信号网络尚未被系统阐明，这不仅限制了对银丹解毒颗粒“异病同治”现代科学内涵的深入理解，也影响了其临床优势的充分发挥与进一步开发。且当前关于中药复方抗流感机制的研究多聚焦于单个通路或少数指标，缺乏从“药物成分-作用靶点-通路网络”进行整体系统性解析的研究，而这正是网络药理学等技术在中医药现代研究中的优势所在^［17］。因此，本研究旨在综合利用网络药理学和分子对接技术，预测银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在作用靶点及信号通路，并基于甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型开展药效学实验，进一步验证其治疗作用并阐释相关作用机制。

1 材料与方法

1.1　网络药理学

1.1.1　银丹解毒颗粒活性成分及作用靶点筛选

采用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索银丹解毒颗粒中主要中药材金银花、黄芩、升麻、麻黄、葶苈子、桑白皮、玄参、牡丹皮、白术的化学成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability， OB≥30%）和类药性（Drug-likeness， DL≥0.18）为筛选条件，构建有效成分数据库并获取相关靶标蛋白。通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）将蛋白质靶点转换为基因符号。同时，利用Swiss Target Prediction （https：//www.SwissTargetPrediction.ch）平台，设置Probability> 0，对所得化学成分进行靶点筛选。

1.1.2　甲型流感相关靶点筛选

使用在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM）（http：//www.omim.org/）和GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/），以“Influenza A”为关键词进行检索，获得甲型流感相关的靶蛋白。对上述2个数据库中检索到的靶蛋白进行筛选、汇总、去重后，得到甲型流感相关靶蛋白。

1.1.3　蛋白相互作用网络的构建与分析

利用微生信在线作图网站（https：//www.bioinformatics.com.cn）对上述银丹解毒颗粒活性成分的作用靶点与甲型流感相关疾病靶点取交集，并生成韦恩图，得到银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在靶点。利用基因/蛋白质相互作用检索工具数据库（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，STRING，https：//string-db.org/）对银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在靶点进行分析，物种限定为“homo sapiens”，设置蛋白相互作用阈值为0.7，建立潜在靶点的蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络。将PPI网络数据文件导入Cytoscape 3.10.0软件中计算节点度值，根据度值大小筛选PPI网络中的关键靶点并进行可视化，构建“中药-有效成分-靶点”网络。

1.1.4　靶点基因富集与通路富集分析

将银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在作用靶点导入DAVID （Database for Annotation， Visualization， and Integrated Discovery）数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），设置“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”“Gene list”“Homo sapiens”筛选条件，分别进行基因本体（Gene Ontology， GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）信号通路富集分析，得到的结果以P<0.05为指标进行筛选，并进行可视化处理，分析银丹解毒颗粒治疗甲型流感的作用机制。

1.2　分子对接研究

从Protein Data Bank 数据库（https：//www.rcsb.org/）获取关键靶点蛋白的晶体结构，采用系统化的分子对接策略进行结构优化。利用Sybyl-X 2.0软件中的Sulflex-Dock-Define SFXC File模块对蛋白结构进行预处理，首先去除结晶水分子等无关配体，然后添加极性氢原子并赋予Gasteiger-Marsili电荷分布，最后采用Tripos力场进行1 000次迭代的能量最小化优化，使蛋白结构达到稳定构象。采用 Surflex-Docking模块进行分子对接，计算配体分子与蛋白之间的相互作用。将优化后的小分子逐一与蛋白活性口袋进行分子对接，采用经验打分函数评价每个配体分子与靶标蛋白的结合力，Total score得分值越高，说明蛋白与小分子之间的结合越牢固。

1.3　银丹解毒颗粒治疗甲型流感的实验验证

1.3.1　实验材料

银丹解毒颗粒（京药制备字Z20200012005，生产批号：Y2401001）。磷酸奥司他韦胶囊（国药准字HJ20140344，达菲，Roche Pharma （Schweiz） AG，生产批号：M1154），连花清瘟颗粒（国药准字Z20100040，北京以岭药业有限公司，生产批号：2409010）。病毒株来自美国菌毒株保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），甲型流感病毒H1N1型FM1株（编号为VR-1754）、PR8株（编号为VR-1469），于-\mathrm{80} ℃低温冰箱保存。

无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级ICR小鼠，体重13 g~15 g，雌雄各半，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2024-0001。本研究动物实验方案已获中国中医科学院动物实验与实验动物管理委员会批准（2024D047）。

异氟烷（上海玉研科学仪器有限公司，20230301），Trizol Reagent （Ambion by Life Technologies，368910），氯仿（国药集团化学试剂有限公司，20230403），异丙醇（上海麦克林生化科技有限公司，C12928231），无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂，20240701），甲型流感病毒核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司，P20240701），质量分数4%组织细胞固定液（北京拜尔迪生物技术有限公司，20240701）。TNF-α、IFN-γ、IL-6的酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA）试剂盒（瑞博奥生物科技股份有限公司，批号分别为092324430、032924421、110424413）。

A2型生物安全柜（美国Thermo公司，Thermo MSC1.8），电子分析天平（美国Ohaus公司，AR1140 MAX110g），电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，BSA323S-CW MAX3200g），IVC小鼠饲养笼（苏州冯氏股份有限公司，ZJ-4），组织匀浆仪（美国M.P.Biomedicals公司，FastPre-24TM 5G），Real-Time 聚合酶链式反应仪（Polymerase Chain Reaction，PCR。Applied biosystems，QuantStudio 5），八连排管迷你离心机（Kylin-Bell Lab，LX-300），迷你涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器公司，OL-901），低温高速离心机（德国Eppendorf公司，Eppendorf-5810R）。

1.3.2　给药剂量

奥司他韦临床用量为0.002 5 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}，小鼠等效剂量为0.027 5 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}；连花清瘟颗粒临床用量为0.03 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}，小鼠等效剂量为3.30 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}；银丹解毒颗粒以生药量计临床用量为2.21 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}，高、中、低剂量分别相当于人临床用量的2倍、等倍及1/2倍，即小鼠剂量分别为48.70 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}、24.35 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}和12.18 \mathrm{g}\cdot \mathrm{k}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}；正常对照组和模型对照组在同等条件下给予蒸馏水。

1.3.3　建立甲型H1N1流感病毒FM1株感染小鼠致病毒性肺炎模型及分组

80只ICR小鼠，雌雄各半，随机选取10只小鼠滴鼻生理盐水，作为正常对照，其余70只小鼠在异氟烷轻度麻醉下滴鼻接种35 μL甲型 H1N1 流感病毒（FM1株，15 LD₅₀）。取流感病毒感染后苏醒迅速、没有病毒液喷出的小鼠60只，作为小鼠病毒性肺炎模型，随机分为模型对照组，奥司他韦对照组，连花清瘟对照组，银丹解毒颗粒高、中、低剂量组，每组10只。感染1 h后，各组按照0.2 mL/10 g体重灌胃给药，每日1次，连续4 d。第5天称体重后解剖小鼠。

1.3.4　计算病毒性肺炎小鼠的肺指数

摘取小鼠全肺称重，计算肺指数及抑制率。

\mathrm{肺指}\mathrm{数}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{肺湿}\mathrm{重}(\mathrm{g})}{\mathrm{体重}(\mathrm{g})}\times \mathrm{100}，

\mathrm{肺指}\mathrm{数抑}\mathrm{制率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组肺}\mathrm{指数}-\mathrm{实验}\mathrm{组肺}\mathrm{指数}}{\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组肺}\mathrm{指数}-\mathrm{正常}\mathrm{对照}\mathrm{组肺}\mathrm{指数}}\times \mathrm{100}\mathrm{。}

1.3.5　检测病毒性肺炎小鼠肺组织中的病毒载量

取小鼠右肺叶的1/2，采用Trizol法提取肺组织中的RNA，焦碳酸二乙酯处理水（Diethyl Pyrocarbonate-treated Water，DEPC-H₂O）作为阴性对照，阳性对照品10倍梯度稀释进行检测。取18 µL IFVA核酸荧光PCR检测混合液，l µL内部对照品，l µL 逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）酶，振荡混匀数秒，3 000 r/min离心数秒。取上述混合液20 µL置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H₂O、阳性对照品各5 µL分别加入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。循环参数设置为45 ℃×10 min、95 ℃×15 min；再按95 ℃×15 s→60 ℃×60 s，循环40次；单点荧光检测在60 ℃，反应体系为25 µL。荧光通道检测用FAM和VIC通道。按照不同浓度阳性对照品的Ct值绘制标准曲线，并按照样品的Ct值计算样品病毒核酸浓度。

1.3.6　检测病毒性肺炎小鼠肺组织中的炎性因子水平

取小鼠右肺叶的1/2，称取重量，加入适量的生理盐水制成质量分数10%的组织匀浆液，使用组织匀浆仪研磨后静置30 min，使用低温高速离心机于4 ℃，3 000 r/min离心10 min。吸取上清液之后分装，保存于-80 ℃冰箱贮存备用。避免反复冻融。参照TNF-α、IFN-γ、IL-6的ELISA试剂盒说明书对样本进行检测。

1.3.7　观察病毒性肺炎小鼠肺组织病理变化

将小鼠左肺固定于质量分数4%多聚甲醛固定液中，48 h后取出流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，中性树胶封片，显微镜下观察。小鼠肺组织病理改变的分级评分标准如下：

0分（正常）：肺组织结构清晰，肺泡间隔无增厚，间质无明显炎症细胞浸润、水肿及瘀血；细支气管结构完整，管腔及周围未见异常。

1分（轻度）：肺间质出现局灶性炎性渗出，可见少量炎症细胞浸润及轻微水肿；细支气管周围出现轻度淋巴细胞聚集。

2分（中度）：肺间质出现多灶性或区域性炎性渗出，炎症细胞浸润明显，伴间质血管轻度扩张、瘀血及水肿；细支气管周围可见片状炎性细胞浸润与增生。

3分（重度）：肺间质出现广泛、弥漫性炎性渗出，以大量淋巴细胞浸润为主，可伴有组织细胞；间质血管显著充血、水肿，部分可见血管周炎症；细支气管及其周围可见大面积、密集的炎症细胞浸润，结构可伴有破坏。

1.3.8　建立甲型H1N1流感病毒PR8株感染小鼠致死亡模型及分组观察计算

150只ICR小鼠，雌雄各半，随机选取20只小鼠滴鼻生理盐水，作为正常对照，其余130只小鼠在异氟烷轻度麻醉下滴鼻接种35 μL甲型 H1N1 流感病毒（PR8株，2 LD_50）。取流感病毒感染后苏醒迅速、没有病毒液喷出的小鼠120只，作为小鼠致死亡模型，随机分为模型对照组，奥司他韦对照组，连花清瘟对照组，银丹解毒颗粒高、中、低剂量组，每组20只。感染1 h后，各组按照0.2 mL/10 g体重灌胃给药，每日1次，连续5 d。感染后每天记录小鼠死亡情况，连续观察14 d。计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数、生命延长率。

\mathrm{死亡}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{死亡}\mathrm{数}}{\mathrm{动物}\mathrm{总数}}\times \mathrm{100}，

\mathrm{死亡}\mathrm{保护}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}-\mathrm{实验}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}}{\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}}\times \mathrm{100}，

\mathrm{平均}\mathrm{存活}\mathrm{天数}=\frac{\sum \mathrm{每只}\mathrm{小鼠}\mathrm{的生}\mathrm{存天}\mathrm{数}}{\mathrm{小鼠}\mathrm{数量}}，

\mathrm{生命}\mathrm{延长}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{实验}\mathrm{组存}\mathrm{活天}\mathrm{数}-\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组存}\mathrm{活天}\mathrm{数}}{\mathrm{模型}\mathrm{对照}\mathrm{组存}\mathrm{活天}\mathrm{数}}\times \mathrm{100}。

1.4　统计方法

试验数据以均值±标准差表示，采用SPSS 20.0 进行统计，肺指数、肺指数抑制率、病毒载量、炎性因子水平、平均存活天数、生命延长率采用t检验进行统计分析；肺部病变情况采用秩和检验进行统计分析；死亡数、死亡率、死亡保护率采用卡方检验进行统计分析。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1　银丹解毒颗粒的活性成分和作用靶点

在TCMSP数据库中检索银丹解毒颗粒主要组成药味活性成分，其中白术（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）7个，黄芩（Scutellariae Radix）36个，金银花（Lonicerae Japonicae Flos）23个，麻黄（Ephedrae Herba）23个，牡丹皮（Moutan Cortex）11个，桑白皮（Mori Cortex）31个，升麻（Cimicifugae Rhizoma）17个，葶苈子（Descurainiae Semen / Lepidii Semen）12个，玄参（Scrophulariae Radix）9个，经筛选去除重复值，共获得99种活性成分（图1），对应612个药物作用靶点。

2.2　甲型流感相关靶点

本研究结合GeneCards和OMIM数据库，以“Influenza A”为关键词进行检索，筛选甲型流感相关靶点。对从GeneCards数据库中检索出的疾病靶点以“Relevance score>10”进行筛选，获得1 936个靶点，在OMIM数据库中获得469个靶点，将两组数据合并去重后，最终得到2 366个甲型流感相关靶点。

2.3　银丹解毒颗粒的“药物-活性成分-疾病靶点”网络

将银丹解毒颗粒的活性成分对应的612个药物作用靶点和甲型流感的2 366个疾病靶点导入微生信在线作图网站，得到218个交集靶点，即为银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在作用靶点（图2）。将银丹解毒颗粒的218个潜在作用靶点及其对应的活性成分导入Cytoscape 3.10.0 软件，构建“药物-活性成分-疾病靶点”网络（图3），该网络由318个节点（1个药物、99个活性成分、218个潜在作用靶点）和2 141条边构成，节点间的连线表示银丹解毒颗粒、活性成分、靶点基因之间的作用关系，展现了银丹解毒颗粒多成分、多靶点的特征。综合度值（Degree）结果预测香叶木素（Diosmetin）、黄芩素（Baicalein）、去甲汉黄芩素（Norwogonin）、金合欢素（Acacetin）、黄芩黄酮II（Skullcapflavone II）、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮（5，7，4'-Trihydroxy-8-methoxyflavone）、5，2'-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮（5，2'-Dihydroxy-6，7，8-trimethoxyflavone）、芫花素（Genkwanin）、柳穿鱼素（Pectolinarigenin）、溪黄草素（Rivularin）这10个成分为银丹解毒颗粒治疗甲型流感的关键活性物质。

2.4　蛋白相互作用网络的构建与分析

将银丹解毒颗粒治疗甲型流感的218个潜在作用靶点导入STRING数据库进行蛋白相互作用网络构建和筛选，建立潜在靶点的PPI网络。将PPI网络数据文件导入Cytoscape 3.10.0中进行可视化分析，PPI网络图中包含218个节点和1 223条边（图4）。采用软件自带的Analyze Network功能进行分析，按照Degree值大小排序获取排名前10位的关键靶点蛋白，分别为信号转导和转录激活因子3 （Signal Transducer and Activator of Transcription 3， STAT3）、表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor， EGFR）、热休克蛋白90 α家族A 类成员1 （Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class A Member 1， HSP90AA1）、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 （AKT Serine/Threonine Kinase 1， AKT1）、SRC原癌基因/非受体型酪氨酸激酶（SRC Proto-Oncogene， Non-Receptor Tyrosine Kinase， SRC）、白细胞介素6（Interleukin 6， IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor， TNF）、热休克蛋白90 α家族B类成员1 （Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class B Member 1， HSP90AB1）、B细胞淋巴瘤 2 （B-cell Lymphoma 2， BCL2）、丝裂原活化蛋白激酶 3 （Mitogen-Activated Protein Kinase 3， MAPK3）。

2.5　GO富集和KEGG通路富集

将银丹解毒颗粒治疗甲型流感的218个潜在作用靶点导入DAVID数据库由DAVID数据库进行GO富集和KEGG通路富集分析。GO富集分析共得到888条GO信息（P < 0.05），包括610个生物过程、94个细胞成分和184个分子功能。如图5所示，GO富集分析结果表明银丹解毒颗粒主要作用于胞质溶胶、细胞质、细胞膜、细胞核、细胞外区域、黏着斑、细胞外外泌体等细胞成分，影响三磷酸腺苷结合、蛋白质的聚化、蛋白激酶活性等分子功能，参与蛋白质磷酸化、凋亡过程的负调控、炎症反应等生物过程。

KEGG通路富集分析共富集到162条通路（P < 0.05）。如图6所示，银丹解毒颗粒治疗甲型流感主要涉及PI3K-Akt 信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等。应用Cytoscape 3.10.0构建银丹解毒颗粒治疗甲型流感的信号通路网络如图7所示，该图构建了中药复方银丹解毒颗粒治疗甲型流感的“复方-成分-靶点-通路-疾病”层级关联网络，银丹解毒颗粒的99个活性成分关联到218个甲型流感潜在作用靶点，同时，这些靶点进一步富集到20条甲型流感相关人类信号通路，最终共同指向甲型流感节点。各节点间的连线直观反映了复方、成分、靶点、通路及疾病间的相互作用关系。该网络清晰呈现银丹解毒颗粒通过多成分协同作用于多靶点，并调控多条疾病相关信号通路的整体干预模式，为揭示银丹解毒颗粒治疗甲型流感的多途径、多环节作用特点提供了可视化依据。

2.6　分子对接

从Protein Data Bank 数据库获取银丹解毒颗粒治疗甲型流感的10个关键靶点蛋白AKT1（PDB ID：3OCB）、EGFR（PDB ID：4ID7）、HSP90AA1（PDB ID：3QDD）、SRC（PDB ID：3D7T）、TNF （PDB ID：2AZ5）、IL-6 （PDB ID：1ALU）、BCL2 （PDB ID：4AQ3）、STAT3（PDB ID：6NJS）、MAPK3（PDB ID：2ZOQ）、HSP90AB1（PDB ID：6N8Y）的晶体结构。对银丹解毒颗粒治疗甲型流感的10个关键活性成分和10个关键靶点蛋白进行分子对接。结果显示，这10个活性成分与其中9个靶标蛋白（HSP90AB1除外）对接分数较高，结合能力较强，结果如表1所示。9个靶标蛋白与对接分数最高的化合物的对接可视化结果如图8所示，IL-6与Rivularin共形成3个氢键（对应GLN A：175、ARG A：179、ARG A：30位），同时在GLN A：175位形成碳氢键，在LEU A：33、ARG A：30位存在疏水相互作用。TNF与Diosmetin形成1个氢键（对应TYR A：151位），同时在SER B：60 位形成碳氢键，在TYR A：59 位存在π-π堆积相互作用。AKT1与Rivularin共形成2个氢键（均对应THR A：211位），同时在THR A：291、SER A：205、THR A：211位形成碳氢键，在VAL A：270、LEU A：210 位存在疏水相互作用，在GLN A：79 位存在酰胺-π堆积作用，在TRP A：80 位同时存在π-π堆积作用与π-孤对电子作用。BCL2与Rivularin共形成2个氢键（对应 ARG A：66、ALA A：59位），同时在GLY A：104、PHE A：63、ARG A：66形成碳氢键，在VAL A：107、ALA A：59位存在疏水相互作用，在PHE A：63位存在π-π堆积相互作用，在TYR A：67存在π-孤对电子作用。EGFR与Skullcapflavone II共形成4个氢键（含3个常规氢键，均对应ALA A：208 位，1个Pi-Donor氢键，对应THR A：205位），同时在LEU A：132、LEU A：207位形成碳氢键，在LYS A：158、ILE A：190、ALA A：156、VAL A：140、LEU A：259、ALA A：208、LEU A：132位存在疏水相互作用。HSP90AA1与Diosmetin共形成3个氢键（对应 LEU A：48、SER A：52、ASP A：93位），同时在LEU A：48位形成碳氢键，在LEU A：107、MET A：98、VAL A：186位存在疏水相互作用，在TYR A：139、PHE A：138位存在π-π堆积相互作用。MAPK3与Diosmetin共形成4个氢键（对应LYS A：131、ASP A：128、ASN A：171、CYS A：183位），同时在LEU A：173、VAL A：56、ALA A：69、CYS A：183位存在疏水相互作用。SRC与Rivularin共形成4个氢键（含MET A：269位2个，GLU A：267、SER A：273位各1个），同时在ALA A：220、VAL A：209、LEU A：321、ILE A：201位存在疏水相互作用。STAT3与Pectolinarigenin共形成5个氢键（含SER A：613位2个，SER A：611、ARG A：609、GLU A：612 位各1个），同时在ILE A：634、ARG A：595位形成碳氢键。

表1　银丹解毒颗粒治疗甲型流感的关键活性成分与关键靶点的分子对接结果

Table 1　Molecular docking results of key active ingredients and key targets of Yindan Jiedu granules for treating influenza A

续表1　银丹解毒颗粒治疗甲型流感的关键活性成分与关键靶点的分子对接结果

Continued Table 1　Molecular docking results of key active ingredients and key targets of Yindan Jiedu granules for treating influenza A

续表1　银丹解毒颗粒治疗甲型流感的关键活性成分与关键靶点的分子对接结果

Continued Table 1　Molecular docking results of key active ingredients and key targets of Yindan Jiedu granules for treating influenza A

2.7　银丹解毒颗粒对病毒性肺炎的影响

如图9所示，采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染小鼠致病毒性肺炎后，与正常对照组比较，模型对照组小鼠的肺指数、病毒载量、炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的含量均明显升高（P<0.01）。与模型对照组比较，银丹解毒颗粒高、中剂量组均能明显降低小鼠肺指数和病毒载量（P<0.05），肺指数抑制率分别为37.62%和44.88%。YDJD高、中、低剂量组亦能明显降低TNF-α、IFN-γ和IL-6的含量（P<0.01）。

2.8　银丹解毒颗粒对小鼠肺组织病理改变的影响

如图10所示，正常对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡未见变形或破裂，细支气管上皮细胞排列整齐，间质未见炎性细胞浸润，组织结构正常。然而，采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染小鼠致病毒性肺炎后，模型对照组小鼠可见大量肺泡充血、水肿和坏死，肺泡腔内有大量的浆液性渗出，混有少量红细胞、白细胞和脱落的肺泡上皮细胞，部分肺泡壁有透明膜形成，呈嗜酸性均质状，肺泡间隔轻度或中度增厚，肺泡腔和肺间质可见大量炎症细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，也有少量浆细胞，病变周围的肺泡壁断裂、融合呈代偿性气肿，细支气管壁轻度至重度充血、水肿，有中性粒细胞浸润，黏膜上皮细胞变性、坏死，管腔内可见崩解脱落的上皮细胞碎片及大量中性粒细胞。与模型对照组比较，奥司他韦组小鼠肺间质可见轻至中度炎症细胞浸润，程度较模型对照组显著减轻；连花清瘟组小鼠肺细支气管损伤程度显著改善。银丹解毒颗粒的高剂量组小鼠肺间质炎症细胞浸润程度较模型对照组显著减轻；中剂量组小鼠细支气管上皮细胞可见轻微至轻度变性坏死，间质呈轻度至中度炎症细胞浸润，损伤程度均较模型对照组明显减轻；低剂量组小鼠肺组织病理损伤较模型组略有减轻。

如表2所示，与正常对照组比较，模型对照组的肺组织和细支气管病变明显，肺泡炎性病变程度（P<0.01）、肺泡间隔增厚程度（P<0.01）、肺间质炎症细胞浸润程度（P<0.01）、肺支气管损伤程度（P<0.01）均有显著性增加。与模型对照组比较，YDJD的中剂量组能明显改善肺泡炎性病变程度（P<0.01）、肺间质炎症细胞浸润程度（P<0.01）和肺支气管损伤程度（P<0.05）；高剂量组能明显改善肺间质炎症细胞浸润程度（P<0.05）。

2.9　银丹解毒颗粒对甲型H1N1流感病毒PR8株致小鼠死亡的保护作用

如表3所示，采用甲型H1N1流感病毒PR8株感染小鼠后，14 d小鼠死亡率为90.00%；与模型对照组比较，银丹解毒颗粒高（P<0.01）、中（P<0.01）、低（P<0.05）剂量组均可以明显降低小鼠死亡率，死亡保护率分别为55.56%、44.44%和22.22%；银丹解毒颗粒高（P<0.01）、中（P<0.01）、低（P<0.05）剂量组均可以明显延长小鼠平均存活天数，生命延长率分别为51.95%、50.00%和27.92%。

3 讨论

甲型流感病毒传染性强，传播速度快，流行范围广，在全球范围内引起巨大恐慌，并造成严重的经济损失。临床常用磷酸奥司他韦、玛巴洛沙韦等西药来治疗流感，但病毒变异株的出现也使得其应用受到限制。中药复方可以通过多靶点、多通路的特点来减少流感病毒复制或通过免疫调控等来发挥药物对人体的保护作用，其安全性高，不良反应少，已被广泛应用于抗病毒的治疗。

银丹解毒颗粒由金银花、黄芩、升麻、麻黄、石膏、葶苈子、桑白皮、地黄、玄参、牡丹皮、白术组成，基于麻杏石甘汤、清瘟败毒饮等经典名方加减化裁而来，共奏宣肺透邪、解毒凉血之功，兼有健脾燥湿，顾护正气之效。麻杏石甘汤为防治流感的经典中药方剂，研究表明，麻杏石甘汤通过调控JAK/STAT信号通路抑制流感病毒引发的炎性损伤^［18-19］，显著降低肺组织中促炎因子CCL5、CXCL10及炎症小体NLRP3的表达，同时上调抗病毒蛋白IFITM3的表达，从而有效减轻肺部炎症并促进组织修复，其疗效优于奥司他韦^［20-21］。此外，麻杏石甘汤还可通过调节肠道微生物组及其代谢产物，经肺-肠轴发挥免疫调节作用^{［20，22］}，并抑制肺组织糖酵解过程，平衡M1/M2巨噬细胞极化（抑制M1促炎型、促进M2抗炎型活化），减轻肺组织炎症损伤^［23］。清瘟败毒饮作为温病经典方剂，能改善流感病毒感染大鼠肺组织病理状态，其机制可能与清瘟败毒饮调节Th1/Th2平衡，从而缓解肺部炎症反应有关^［24］。进一步研究发现，Th1/Th2漂移导致的细胞因子失衡可能是病毒性肺炎卫气营血转变的微观病机演变，而清瘟败毒饮可通过干预Th1/Th2漂移，阻断病毒性肺炎从“气分证”向“营分证”的病情进展，体现其“截断病势”的中医治疫特色^［25］。

银丹解毒颗粒处方中的金银花作为防治流感的核心中药，其抗病毒作用体现中药多成分-多靶点-多通路的整合调控特点，研究表明，金银花可能是通过其活性成分调控IL-17、MAPK、松弛素等信号通路，干预细胞代谢的多个过程，抑制促炎因子表达，从而发挥抗甲型H1N1流感病毒的作用^［26］。相关研究筛选并鉴定出金银花中六种关键生物活性化合物，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、獐牙菜苷和马钱子苷酸具有抗流感病毒活性，能抑制神经氨酸酶，且含量与金银花抗流感病毒活性相关^［27］。黄芩及其活性成分在抗流感病毒治疗中展现出多途径协同作用，研究发现，黄芩中的黄酮类化合物（如黄芩苷、黄芩素）可通过抑制病毒侵入宿主细胞、阻断病毒复制并调节免疫应答发挥直接抗病毒作用^［28-29］。其中，黄芩苷能通过caspase-3/GSDME通路抑制甲型H1N1病毒诱导的肺泡上皮细胞焦亡，减轻肺组织损伤^［8］；而黄芩素则通过调控PI3K/AKT信号通路及凋亡相关蛋白，抑制病毒引起的细胞凋亡^［30］。此外，黄芩中多种成分（如刺槐素、汉黄芩素、千层纸素A等）对流感病毒蛋白具有强结合力，提示其多成分协同干预病毒生命周期的作用特点^［30］。

银丹解毒颗粒作为具有明确疗效的中药治疫复方^［14-16］，虽已被北京市药品监督管理局批准用于治疗流感，但其抗流感机制尚不明确，限制了其在临床的应用。为拓展银丹解毒颗粒的临床应用价值，一方面，本研究结合网络药理学方法对其进行了初步作用机制探讨。获得银丹解毒颗粒的有效成分99个，药物作用靶点612个，甲型流感相关疾病靶点2 366个，筛选出银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在作用靶点218个。通过PPI和Cytoscape 3.10.0可视化分析得到银丹解毒颗粒治疗甲型流感的10个核心靶点，如STAT3、EGFR、HSP90AA1、AKT1、SRC、IL6、TNF、HSP90AB1、BCL2、MAPK3等。并进行GO和KEGG富集分析，发现银丹解毒颗粒治疗甲型流感的潜在靶点与PI3K-Akt、TNF、NF-κB等多条信号通路相关。分子对接结果显示，香叶木素、黄芩素、去甲汉黄芩素、金合欢素等活性成分与10个核心靶点结合能力较强。研究表明香叶木素对 H1N1 流感病毒介导的急性肺损伤和炎症具有保护作用，其机制与激活 PPAR-γ，进而抑制 NF-κB 和 P38 MAPK信号通路的激活有关，减少肺匀浆中IL-6、MCP-1、RANTES和TNF-α等促炎介质的释放，抑制体内炎症反应，减轻肺损伤^［31］。黄芩素对流感病毒（如H1N1、H3N2、H5N1）具有显著抑制作用，可通过抑制神经氨酸酶活性、阻断病毒RNA聚合酶功能，直接干扰病毒吸附、复制及释放过程；同时，其能调节宿主免疫，通过激活 IFN 信号、抑制 TLR3/NF-κB 和 p38 MAPK 炎症通路，减少IL-6、IL-8等促炎因子释放，并抑制肺泡上皮细胞焦亡和自噬，减轻肺损伤。动物实验表明，黄芩素可降低流感感染小鼠的肺指数、延长存活时间，与利巴韦林或奥司他韦联用能增强疗效。其口服后代谢为葡糖醛酸结合物，临床 I 期试验显示安全性良好，作为天然黄酮类化合物，在流感防治中具有潜在应用价值^［32］。去甲汉黄芩素通过抗补体、抗病毒和抗炎活性，参与缓解A型流感病毒诱导的急性肺损伤^［33］。金合欢素可通过多靶点、多通路发挥抗甲型流感作用，抑制 NF-κB通路以调控炎症因子释放，还能与黄芩其他成分协同调控AKT1/PI3K等通路，增强宿主抗病毒免疫^［34］。

另一方面，本研究结合药物-成分-疾病靶点预测结果，构建甲型流感病毒H1N1型FM1株感染小鼠致病毒性肺炎模型和H1N1型PR8株感染小鼠致死模型，进一步研究银丹解毒颗粒治疗流感的有效性，并初步验证其作用机制。结果表明银丹解毒颗粒可以明显降低肺指数，减少肺组织病毒载量和抑制TNF-α、IFN-γ、IL-6炎症因子释放，改善肺组织和细支气管的病理损伤，对小鼠死亡具有明显的保护作用。这与银丹解毒颗粒的处方来源于经典名方麻杏石甘汤、清瘟败毒饮的加减化裁相呼应，提示其可能通过多成分、多靶点协同发挥治疗流感的作用。与目前临床常用的抗流感西药相比，银丹解毒颗粒展现出了一定的优势。奥司他韦作为神经氨酸酶抑制剂，虽能有效抑制病毒复制，但耐药性问题不可忽视。本研究中，银丹解毒颗粒在降低肺指数、减少病毒载量和抑制炎症方面与奥司他韦相当，而在改善小鼠肺泡炎性病变程度和肺支气管损伤方面优于奥司他韦，且其作用机制可能涉及多靶点调节，不易产生耐药问题。连花清瘟颗粒为治疗流感的常用中成药，银丹解毒颗粒与之相比，在改善肺组织病理改变和降低死亡率方面表现出了相似或更优的效果，进一步凸显了银丹解毒颗粒在治疗流感方面的潜力。

4 结论

本研究应用网络药理学与分子对接技术发现，银丹解毒颗粒可能通过香叶木素、黄芩素、去甲汉黄芩素、金合欢素等关键活性成分发挥抗甲型流感病毒作用，这些成分可能通过作用于IL-6、TNF和STAT3等关键靶点参与其治疗过程。同时联合体内实验发现银丹解毒颗粒通过抑制病毒复制（降低肺指数和病毒载量）、调节炎症反应（下调TNF-α、IFN-γ和 IL-6）以及减轻肺组织的病理损伤，显著改善了感染 H1N1 流感病毒小鼠的存活情况。然而，本研究也存在一定的局限性。银丹解毒颗粒治疗流感的具体作用机制尚未完全明确，虽然推测其可能通过多靶点发挥作用，但具体的信号通路和分子机制还需深入探究。在后续研究中，可开展临床研究，观察银丹解毒颗粒在人体中的疗效和安全性；同时利用现代分子生物学技术，深入挖掘其作用靶点和信号通路，为其临床应用提供更坚实的科学依据。

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基金资助

国家重点研发计划(2023YFC2308200)