基于网络药理学探究参苓白术丸改善肌少症的关键活性成分

Exploring the Key Active Components of Shenling Baizhu Pill to Improve Sarcopenia Based on Network Pharmacology

摘要

本研究旨在探讨参苓白术丸治疗肌少症的关键活性成分。本研究利用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱仪（Ultra-performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）对参苓白术丸提取物中化学组分进行分析；结合网络药理学预测参苓白术丸改善肌少症的有效成分、潜在核心靶点；使用地塞米松诱导的斑马鱼肌少症模型对参苓白术丸进行改善肌少症活性评价。采用逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测相关基因的表达情况。结果显示，参苓白术丸提取物中共检测到87个化合物；网络药理学分析结果显示参苓白术丸中5种潜在活性成分染料木黄酮、山药素III、山药素IV、柚皮素、山柰酚，主要作用于丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1 GeneAKT， AKT1）、白细胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）、F-框蛋白 32（F-Box Protein 32， FBXO32）、肌肉特异性环指蛋白1（Tripartite Motif Containing 63， TRIM63）等靶点。分子对接显示其中柚皮素与FBXO32蛋白具有较高的结合能力，同时分子动力学模拟也进一步发现柚皮素-FBXO32复合物具有较好的稳定性。斑马鱼实验结果显示柚皮素可显著提升肌少症斑马鱼模型的运动能力，改善模型动物肌肉的密度，下调FBXO32、TRIM63的mRNA表达。综上，本研究首次发现参苓白术丸中柚皮素可能是其改善肌少症的关键药效成分，为揭示参苓白术丸的改善肌少症活性成分和作用机制提供了理论依据。

Abstract

This study aims to explore the key active components of Shenling Baizhu Pill (SLBZP) in treating sarcopenia. The study utilizes Ultra-performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) to analyze the chemical components in the extract of SLBZP; combines network pharmacology to predict the effective components and potential core targets of SLBZP to improve sarcopenia; and employs a dexamethasone-induced zebrafish sarcopenia model to evaluate the sarcopenia-improving activity of SLBZP. Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction (RT-PCR) is used to detect the expression of related genes. The results show that 87 compounds were detected in the extract of SLBZP; network pharmacology analysis reveals that five potential active components in SLBZP, including genistein, diosgenin III, diosgenin IV, naringenin, and kaempferol, primarily act on targets such as AKT serine/threonine kinase 1 (AKT, AKT1), interleukin-6 (IL-6), F-Box Protein 32 (FBXO32), and Tripartite Motif Containing 63 (TRIM63). Molecular docking indicates that naringenin has a high binding affinity with FBXO32 protein, and molecular dynamics simulations further reveal that the naringenin-FBXO32 complex exhibits good stability. Animal experiments on zebrafish demonstrate that naringenin significantly enhances the locomotor ability of the sarcopenia zebrafish model, improves muscle density in the model animals, and downregulates the mRNA expression of FBXO32 and TRIM63. In summary, this study is the first discovery to identify naringenin in Shenling Baizhu Pill as a potential key pharmacodynamic component for improving sarcopenia, providing a theoretical basis for revealing the improve sarcopenia active components and mechanisms of action of SLBZP.

Graphical abstract

关键词

参苓白术丸 / 肌少症 / 分子动力学 / 分子对接 / 柚皮素

Key words

Shenling Baizhu Pill / sarcopenia / molecular dynamics / molecular docking / naringenin

0 引言

肌少症（Sarcopenia）是一种与年龄增长密切相关的骨骼肌退行性疾病，同时也受环境因素（如营养状况^［1-2］、运动习惯^［3］、慢性炎症^［4］等）的综合影响^［5-6］。该疾病以进行性肌肉质量减少、肌力下降及功能衰退为主要特征，不仅显著降低患者的生活质量，还会增加跌倒、骨折及代谢紊乱等风险，严重威胁中老年人群的健康^［7］。由于缺乏针对性的临床药物，营养补充与运动训练成为主要干预策略，然而这些措施不仅疗效有限，还面临着个体响应差异巨大的挑战。

在中医理论中，肌少症属于“痿证”“虚劳”等范畴，其病机主要与脾、肾、肝三脏功能失调相关，久病体弱、气血瘀滞、痰湿内阻等因素亦可加重病情。传统中药因其多靶点、整体调节的特点，在肌少症防治研究中展现出独特潜力，如复方八子补肾方、补肾还精方或补阳、补阴等单味药都对肌少症的发生发展具有一定的干预作用^［8］。但是由于中药固有的多成分-多靶点的复杂特性，以上中药复方的关键药效成分的研究尚严重不足。从中药天然成分中筛选发现具有改善肌少症的主要活性成分，不仅能为解释中药治疗肌少症的科学内涵提供科学依据，还能为开发低毒副作用的天然药物奠定基础，具有重要的科学价值与应用前景。

参苓白术丸源自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、麸炒白术、茯苓等10味中药组成，该方主要功能在于益气健脾、渗湿止泻，传统用于脾胃虚弱、食少便溏、肢倦乏力等症。刘超等研究发现参苓白术丸对肌少症具有一定的改善作用^［9］。已有研究表明参苓白术丸可改善老年肌少症患者的肌肉质量和握力（如联合运动或营养干预），但是参苓白术丸改善肌少症的主要活性成分仍不明确^［10］。

网络药理学是一种整合系统生物学、多向药理学和计算科学的新兴研究方法，通过构建“药物-成分-靶点-疾病”多层次相互作用网络，揭示药物（特别是中药复方）多成分、多靶点、多通路的协同作用机制^［11］。网络药理学核心是从整体层面解析药物对疾病相关分子网络的调控作用，突破传统单一靶点研究的局限，特别适用于中药复杂体系的现代化研究。网络药理学进一步结合数据库挖掘、分子对接和生物网络分析等技术，可高效预测活性成分、关键靶点及作用通路，并为后续实验验证提供理论指导，是中医药作用机制研究和创新药物开发的重要工具^［12］。斑马鱼作为一种新模式生物，因其体积小、繁殖快、操作简便且与人类具有高度同源性，特别是消耗的样品量少、实验周期短，因此在中药活性评价中得到广泛应用^［13］。

因此，本研究使用UPLC-Q/TOF-MS鉴定参苓白术丸的化学成分，利用网络药理学方法结合地塞米松诱导斑马鱼肌少症模型对参苓白术丸的有效活性成分进行探索，以期为肌少症的防治提供新的活性物质。

1 实验材料

1.1　动物

野生AB系斑马鱼由山东第一医科大学斑马鱼研究中心提供。成年斑马鱼在28 ℃的斑马鱼养殖系统（上海海圣生物实验设备有限公司）中饲养。在14 h光照/10 h黑暗循环下，每天喂养两次丰年虫。在前一天晚上，将成年雄性和雌性斑马鱼以2∶2的比例放入交配缸中。第二天早上斑马鱼在光线的刺激下自然交配和产卵。在产卵后1 h内收集胚胎并用养鱼水洗涤。将干净的胚胎转移到系统养鱼水（5 \mathrm{m}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-\mathrm{1}} NaCl、0.17 \mathrm{m}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-\mathrm{1}} KCl、0.33 \mathrm{m}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-\mathrm{1}} CaCl₂、0.33 \mathrm{m}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot {\mathrm{L}}^{-\mathrm{1}} MgSO₄）中，并置于28.5 ℃的光培养箱中进行后续实验。

1.2　材料与试剂

参苓白术丸（山东孔圣堂，批号：24092010）；地塞米松（Dexamethasone， Dex，质量分数≥98%，上海奥默）；柚皮素（质量分数≥98%，上海源叶）；二甲基亚砜（上海麦克林）；甲醇（色谱纯，国药集团）；质谱级乙腈、甲醇、甲酸（Fishier，美国）；纯净水（广州屈臣氏）；SPARKeasy 组织/细胞RNA快速提取试剂盒、2×SYBR Green qPCR Mix （With ROX）（思科捷）。

1.3　仪器与设备

高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC H-Class Plus，Waters）；质谱仪（SYNAPT XS Q-TOF，Waters）；色谱柱（CAPCELL PAK ADME-HR （S-3）2.1X100，F93323，Shiseido）；摄像机（索尼）；高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；UNIFI V1.8（Waters，美国）；微量分光光度计（UNano-1000）； T30D型三槽超级梯度PCR仪（LongGene）；Bio-Rad荧光定量PCR仪（CFX 96Touch）；CTFD-10P冷冻干燥机（青岛永和创信）；样品冷冻研磨仪（山东百欧医疗科技有限公司）。

1.4　样品制备

取参苓白术丸适量，研细，取约20 g，精密称定，精密加入体积分数为50%的甲醇适量，超声处理50 min，放冷，摇匀，抽滤，加入体积分数为50%的甲醇200 mL再次超声，合并滤液，减压浓缩，冻干备用。

2 实验方法

2.1　参苓白术丸的TOF质谱分析

2.1.1　色谱条件

流动相为A：体积分数为0.05%的甲酸水；B：体积分数为0.05% 的甲酸甲醇-乙腈（1∶1）；色谱柱为CAPCELL PAK ADME-HR （S-3） 2.1X100；梯度洗脱条件为（0~1.5 min， 5%B→20%B；1.5~12 min， 20%B→90%B；12~13 min， 90%B→100%B；13~13.1 min，100%B→5%B；13.1~16 min，5%B），流速\mathrm{0.3}\mathrm{m}\mathrm{L}\cdot \mathrm{m}\mathrm{i}{\mathrm{n}}^{-\mathrm{1}}，柱温35 ℃，进样量2 µL。

2.1.2　质谱条件

采用电喷雾离子（Electrospray Ionization， ESI）源正负离子分别扫描，离子化电压为-\mathrm{4}\mathrm{500}\mathrm{V}（负离子）、5 500 V（正离子），离子源温度为450 ℃，喷雾气（Gas 1）379 kPa，辅助加热气（Gas 2）379 kPa，气帘气（CUR）207 kPa，去簇电压（Declustering Potential，DP）60 V。一级质谱（TOF MS）扫描范围为m/z 80~1 500，子离子扫描范围为m/z 50~1 250，二级碰撞能量（Collision Energy，CE）为40 eV，碰撞能量滚动区间（Collision Energy Ramp，CEs）15 eV。

2.2　参苓白术丸及其活性成分对斑马鱼肌少症模型的改善作用

2.2.1　参苓白术丸及其活性成分对斑马鱼运动能力的影响

参考文献方法^［14］，取发育至3 dpf的斑马鱼，置六孔板中，每孔15条。斑马鱼先用Dex 20 μg/mL 处理48 h诱导形成肌少症模型，将1.3项下参苓白术丸冻干粉用养鱼水稀释至相应剂量（50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL），将斑马鱼置于相应剂量参苓白术丸提取液中处理24 h， 使用高清相机采集斑马鱼的运动行为，每条鱼10 min。拍摄完毕后，将视频导入电脑，利用图像处理软件Matlab分析所有视频，记录斑马鱼运动轨迹，逐帧计算斑马鱼运动距离，利用运动距离评价药物改善肌少症的活性，单体处理方式同上。

2.2.2　参苓白术丸及其活性成分对斑马鱼肌少症相关mRNA水平的影响

RT-PCR检测P16、P21、FBXO32和TRIM63这些与肌少症相关的基因表达，引物见表1。每组平行实验三次。

2.2.3　肌肉组织苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin，H&E）观察参苓白术丸给药后对斑马鱼肌少症的影响

为进行组织病理学评估，每组随机取5条斑马鱼，经质量体积分数4%多聚甲醛固定、石蜡包埋及切片后，进行H&E染色，光学显微镜下观察并采集图像以供分析。

2.3　网络药理学与分子对接

2.3.1　参苓白术丸活性成分筛选及相关靶点预测

以UPLC-Q/TOF-MS分析得到的参苓白术丸有效化合物，利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库转化为Canonical SMILES数据，借助Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库预测成分靶点。

2.3.2　肌少症相关靶点收集

通过GeneCards （http：//www.genecards.org/）、TTD （http：// bidd.nus.edu.sg/group/ data bases.htm）数据库，根据关键词“Sarcopenia”收集肌少症相关靶点（基因）。将成分靶点与疾病靶点取交集，得到参苓白术丸改善肌少症的潜在作用靶点。

2.3.3　参苓白术丸活性成分-潜在靶点-疾病靶点网络构建

利用Cytoscape 3.9.0软件，构建潜在改善肌少症成分与其改善肌少症靶点的网络关系拓扑图（Compounds-Targets Network， C-T网络）。

2.3.4　蛋白互作网络（PPI）构建

将参苓白术丸潜在改善肌少症成分的改善肌少症靶点上传至STRING 11.5数据库（https：//string-db.org）构建交集靶点PPI网络，生物种类设定为人类，将最小相互作用阈值设为0.9。利用Cytoscape 3.9.1软件中的CentiScape 2.2插件进行聚类和拓扑分析，获得参苓白术丸治疗肌少症的核心靶点。

2.3.5　GO和KEGG富集分析

将参苓白术丸改善肌少症的关键靶点输入至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG通路富集分析，获取GO功能和KEGG通路信息表，筛选P<0.05的条目和信号通路。利用微生信网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析。

2.3.6　分子对接

分子对接用于评估参苓白术丸关键成分与靶点的结合能力。成分和靶点的三维结构分别从PubChem与PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库获得，通过CB-Dock2在线工具（http：//cadd.labshare.cn/cb-dock2/）按照^［15］方法，进行分子对接。

2.3.7　分子动力学模拟

本研究采用薛定谔分子动力模拟软件Maestro进行分子动力模拟，使用“Protein Preparation Workflow”（蛋白质准备向导）进行分子结构预处理，选择Preprocess设置，勾选Fill in missing loops （using Prime）对分子进行缺失结构修复。随后进行模拟系统建立，在Maestro中使用System Builder工具将分子系统放置于溶剂箱中，选择溶剂为TIP3P，模拟力场选择OPLS4，再转入Ions界面进行Add Salt加盐和Recalcute离子平衡。待模拟系统建立完成后，使用Molecular Dynamics模块设置模拟参数，模拟总时间为100 ns，温度300 K，气压101.325 kPa，Ensemble class为NPT进行分子动力模拟。

2.4　统计学处理

数据表示为平均值±均值标准误差（Standard Error of Mean， SEM），使用单因素方差分析进行分析，所有分析均使用GraphPad Prism 9.5（Graphpad Software Inc， La Jolla， CA， USA）数据统计处理。P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

3 结果与分析

3.1　参苓白术丸的UPLC-Q/TOF-MS分析结果

本研究使用UPLC-Q/TOF-MS对参苓白术丸提取物进行组成成分采集，正、负离子模式下参苓白术丸提取物的离子流（图1）所示。通过分析保留时间、二级碎片、加合方式结合UNIFI天然产物数据库和相关文献进行对比获得成分鉴定结果，鉴定出的化合物种类包括31种酚类、22种糖苷类、13种萜类、5种生物碱类、3种氨基酸类、2种糖类、11种其他类共87种化学成分（见附表1）。

3.2　参苓白术丸对斑马鱼肌少症模型的改善作用

3.2.1　参苓白术丸改善肌少症斑马鱼的运动能力

Dex可以通过抑制蛋白质合成、加速分解及诱导胰岛素抵抗等机制导致骨骼肌萎缩，降低斑马鱼运动能力，缩短总运动距离。如图2（a）、2（b）所示，Dex造模后，模型组的移动距离相较对照组有明显下降（P<0.001）；与模型组比较，经参苓白术丸提取物给药治疗后，斑马鱼运动能力得到一定程度的改善，且呈现剂量依赖性，高剂量组（200 μg/mL）治疗后的斑马鱼的移动距离有明显恢复（P<0.01）。

3.2.2　参苓白术丸改善肌少症相关mRNA水平的表达

肌少症是与年龄增长密切相关的老年综合征，而地塞米松作为一种糖皮质激素类药物长期大量使用可能加快衰老进程，为了验证地塞米松诱导斑马鱼肌少症模型是否与衰老相关，本研究检测了与肌少症相关的mRNA TRIM63、FBXO32，以及衰老相关P16、P21等相关基因的表达情况。根据斑马鱼行为学结果选择与模型组具有显著差异的200 μg/mL 参苓白术丸进行PCR检测，结果如图3所示，与对照组相比，模型组斑马鱼中P16、P21、TRIM63、FBXO32的转录水平显著上调，经参苓白术丸提取物给药后斑马鱼组织中P16、P21、TRIM63、FBXO32的转录水平均有不同程度下调。

3.2.3　肌肉组织H＆E染色

H＆E染色结果显示，正常对照组斑马鱼肌肉组织形态正常，肌细胞细而长，呈纤维状，排列紧密，横纹明暗相间排列。模型对照组肌肉组织结构松散，排列不整齐。参苓白术丸给药治疗组斑马鱼肌肉组织病变程度较模型对照组有所改善，排列较模型对照组有规律，说明参苓白术丸具有改善肌少症功效（图4）。

3.3　利用网络药理学预测参苓白术丸潜在的活性成分及作用靶点

3.3.1　参苓白术丸潜在活性成分-肌少症靶点的PPI网络

基于液质联用技术得到87种化学成分，在TCMSP数据库中，预测对应靶点并规范靶点名称，合并后删除重复值共得到参苓白术丸潜在靶点800个；通过数据库收集到肌少症相关靶点401个；将以上药物靶点与肌少症疾病相关靶点取交集得到改善肌少症靶点43个（图5（a））。

为了进一步筛选参苓白术丸关键改善肌少症成分，将87种活性成分与其所对应的43个改善肌少症靶点构建成分-靶点-疾病网络（图5（b））。通过互作网络分析，选定网络中参苓白术丸介数值排名前五的成分作为潜在的改善肌少症成分，结果显示，参苓白术丸潜在的改善肌少症的成分是染料木黄酮（Genistein）、山药素III（Batatasin III）、山药素 IV（Batatasin IV）、柚皮素（Naringenin）、山柰酚（Kaempferol）。

为获取参苓白术丸改善肌少症关键靶点，将参苓白术丸治疗肌少症的潜在靶点导入STRING 11.5数据库进一步筛选，所得靶点进一步导入Cytoscape 3.9.1软件运用CentiScape 2.2插件进行聚类分析并构建蛋白互作（Protein-protein interaction， PPI）网络图（图5（c））。PPI图中靶点度值越大，颜色越深，表明靶点与网络中其他靶点连接越紧密。选定网络中参苓白术丸度值排名前十的成分作为关键改善肌少症靶点，结果显示，参苓白术丸的关键改善肌少症靶点为AKT1、ALB、TNF、IL-6、FBXO32、MTOR、IL-1B、TRIM63、IGF1R、ESR2。

3.3.2　GO功能和KEGG通路富集分析

将43个交集靶点导入DAVID 数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）数据库，研究对象选择“智人”，GO富集分析得到198条生物功能条目（Biological Process， BP）主要包括炎症反应、RNA聚合酶II对转录的正调控、凋亡过程的调控、基因表达调控等；28条细胞组成条目（Cellular Component， CC），主要涉及细胞质、胞液、细胞核及胞外区等；67条分子功能条目（Molecular Function， MF），主要富集在转录顺式调控区结合、蛋白激酶活性、序列特异性DNA结合及相同蛋白结合等，根据富集程度选择排名前15条进行可视化（图6）；KEGG富集分析得到87条通路，根据富集程度选择前20条进行可视化（图7），主要包括HIF-1信号通路、鞘脂信号通路、FoxO信号通路及Apelin信号通路等。

3.4　参苓白术散活性成分与关键靶点的分子对接结果

药物分子和靶点相互作用的结合能数值越低，配体与受体蛋白的结合越牢固。结果表明，参苓白术丸的5种主要成分与关键靶点结合能均低于-\mathrm{5} kJ·mol⁻¹（表2），表明这些化合物和受体均有一定的结合活性，其中柚皮素与FBXO32结合最稳定（图8）。

3.5　参苓白术散活性成分与关键靶点的分子动力学模拟结果

基于分子对接结果，选取结合能最低的柚皮素-FBXO32复合物为研究对象，进行分子动力学模拟。均方根偏差（RMSD）用于评价蛋白配体复合物体系的稳定性，RMSD结果显示，柚皮素-FBXO32复合物体系在10 ns后达到平衡，在4 Å上下波动（图9（a））；根均方波动（RMSF）能够体现每个氨基酸残基在模拟过程中的稳定性，RMSF结果显示，RMSF值普遍低于4 Å，提示体系的局部结构较为稳定（图9（b））。

3.6　柚皮素对斑马鱼肌少症模型的改善作用

3.6.1　柚皮素改善肌少症斑马鱼的运动能力

根据网络药理学筛选结果，柚皮素（Naringenin， Nar）为参苓白术丸改善肌少症的关键活性成分，采用Dex诱导的斑马鱼肌少症模型对Nar进行体内验证。从运动行为水平上对Nar改善肌少症的药效进行评价，结果显示（图10），与对照组相比模型组斑马鱼运动距离显著降低，经Nar给药后可以延长斑马鱼运动距离，说明Nar对Dex引起的肌肉萎缩具有一定的缓解作用，高剂量给药后斑马鱼运动距离与模型组相比具有显著差异（P<0.001）。

3.6.2　柚皮素改善肌少症相关mRNA水平的表达

为了进一步探讨Nar体内改善肌少症的作用靶点，根据行为学结果选择10 μg/mL Nar进行下一步实验，根据网络药理学的预测结果同时结合相关文献资料，通过RT-PCR检测了与Nar分子对接结合良好的2个斑马鱼组织中肌少症相关基因TRIM63、FBXO32的表达。结果表明，与对照组相比，Dex造模后斑马鱼TRIM63、FBXO32表达水平显著上调；与模型组相比，经Nar给药治疗后斑马鱼组织中TRIM63、FBXO32 mRNA表达显著下调（图11）。

4 结果与分析

肌少症是一种随着年龄增长出现的骨骼肌流失、力量减弱或身体机能衰退的老年性疾病。Chiu等^［16］的研究显示，肌少症发生率为12.16%~54.17%，患病概率同年龄增长呈正相关^［17］。随着肌少症患病率的增加，家庭、医疗、社会负担不断加重，研究其发病及防治方法已然成为公共卫生领域的重要议题^［18］。中药复方以其整体调节、多靶点干预的特点在肌少症治疗中具有重要地位，肌少症的病位主要在肌肉，发病机制主要以脾肾两虚为主^［19］，基于中医“脾主肌肉”理论，治疗方法应以补益脾胃为主^［20］。

参苓白术丸是一种经典的中成药，源自宋代名方，其核心功效是健脾益气、和胃渗湿，目前林洁等^［21］研究发现参苓白术复方对脾胃两虚型重症肌无力患者有一定的治疗作用，在临床上也被联合营养支持和运动干预用于老年肌少症患者的治疗，具有一定的安全性和有效性^［22］。曾婧媛等^［23］利用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术结合理论化学研究了参苓白术颗粒的化学成分及其防伪质量标记物。周晓芸等^［24］发现参苓白术散可通过调控PINK1/Parkin通路改善慢阻肺伴合并的骨骼肌功能。周谊等^［25］采用UPLC-MS/MS法测定了参苓白术颗粒中桔梗皂苷D、竹节参皂苷Ⅳa 等12种的主要成分，但并未对药效成分进行深入探讨。

相对于小鼠模型，斑马鱼模型在多样本快速筛选中具有显著优势^［26］。斑马鱼作为一种新型模式脊椎生物，因其生长周期短、可有效提高实验效率等特点而得到广泛应用^［27］。斑马鱼躯干主要由骨骼肌组成，其在分子与组织学特征上和人类肌肉具有极高的相似度^［28］。本研究通过Dex诱导肌少症斑马鱼模型验证了参苓白术丸对肌少症的作用，结果表明经参苓白术丸提取物给药后可以显著改善斑马鱼的肌肉结构以及运动功能，并调控肌少症相关基因P16、P21、TRIM63、FBXO32 mRNA的表达，进一步验证了参苓白术丸对肌少症的改善作用。

网络药理学是基于现有的中药成分数据库进行网络信息分析，因此中药成分的数据来源至关重要^［29］。作者通过检索现有的成分数据库，发现参苓白术丸的成分信息不够全面。因此本研究采用UPLC Q/TOF-MS鉴定结果进行研究。UPLC Q/TOF-MS因其特异性强、速度快、选择性强而被广泛用于药物的多组分分析。以UPLC-Q/TOF-MS鉴定出的87种化学成分结果为研究对象，结合网络药理学和分子对接技术，从多成分、多靶点整体分析探索其改善肌少症作用的物质基础。

通过构建“活性成分-靶点-疾病”网络分析，我们快速预测发现了参苓白术丸潜在核心成分为染料木黄酮（Genistein）、山药素III（Batatasin III）、山药素 IV（Batatasin IV）、柚皮素（Naringenin）、山柰酚（Kaempferol）。文献研究结果显示Genistein^［30］可以通过errα介导的线粒体生物合成和吞噬减轻大鼠骨髓间充质干细胞的衰老，对阿尔茨海默症和其他与年龄相关疾病具有有益作用^［31］；Batatasin IV^［32］是治疗糖尿病肾病细胞衰老的潜在化合物；Kaempferol^［33］因其独特的化学结构具有抗氧化、抗炎特性，在衰老相关疾病中展示出良好的治疗潜力；Batatasin III^［34］通过抑制STING/NF-κB信号通路，展示出一定的抗炎功效。Naringenin已被证实对炎症^［35］、神经疾病^［36］、Dex诱导的骨质疏松^［37］具有保护作用，并且可以防止mdx小鼠的肌肉萎缩^［38］。本研究进一步发现Naringenin能够显著改善斑马鱼肌少症模型的病理损伤及运动能力。

通过网络药理学的PPI分析结果，发现AKT1、ALB、TNF、IL-6、FBXO32、MTOR、IL-1B、TRIM63、IGF1R、ESR2等为参苓白术丸改善肌少症的潜在作用靶点。FBXO32又可被称为MAFbx，是F-box 蛋白家族的成员，其表达对横纹肌具有选择性^［39］，这种蛋白质在肌肉萎缩期间高度表达是治疗肌肉萎缩的潜在药物靶点，在Dex诱导的肌肉萎缩模型中表达升高^［40］；TRIM63属于RING指蛋白家族，TRIM63的主要功能涉及肌肉的生理和病理过程，特别是在肌肉萎缩和纤维化中起关键作用^［41］。采用RT-PCR技术进一步探究了Nar对以上2种基因的影响，我们进一步发现Nar能够逆转肌少症斑马鱼模型中FBXO32、TRIM63 mRNA的表达情况。

综上所述，本研究使用Dex诱导的斑马鱼肌少症模型验证了参苓白术丸对肌少症的治疗作用，结合UPLC-Q/TOF-MS、网络药理学和分子对接技术，探究了参苓白术丸的改善肌少症的药效物质基础，筛选出了可能的活性成分，并通过斑马鱼肌少症模型对筛选出的关键药效物质Nar进行验证，体内实验在一定程度上证实了网络药理学预测的可靠性，为进一步系统地开展参苓白术丸发挥改善肌少症的药效物质研究提供一定的理论依据，为肌少症防治提供新的活性物质选择。

参考文献

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基金资助

国家中医药管理局科技司-山东省卫生健康委员会共建中医药科技项目(GZY-KJS-SD-2023-088)

山东省自然科学基金(ZR2025MS1268)

山东第一医科大学学术提升计划(2019LJ003)