基于高分辨质谱代谢组学及网络药理学的蝉蜕质量评价

Quality Evaluation of Cicadae Periostracum Based on High-resolution Mass Spectrometry Metabolomics and Network Pharmacology

摘要

蝉蜕为蝉科昆虫黑蚱（Cryptotympana pustulata Fabricius）若虫羽化时脱落的皮壳，药用历史已逾千年。目前，《中国药典》仅以外观性状评价其品质，缺乏与药效关联的规范、科学质控指标。本研究采集8个主产地的蝉蜕样本，经性状与显微鉴定后，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-flight Tandem Mass Spectrometry，UPLC-QTQF-MS/MS）代谢组学结合网络药理学方法开展质量评价。结果显示，共鉴定出 52个N-乙酰多巴胺类化合物（含单聚体至五聚体）、29个直链二肽及6个氨基酸；河南开封、四川广安、河北保定的N-乙酰多巴胺类成分含量较高，山西长治、四川广安的特征肽类及氨基酸含量优势显著；网络药理学分析表明，蝉蜕中N-乙酰多巴胺类和二肽类成分作用于原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Sarcoma Proto-oncogene Tyrosine-Protein Kinase，SRC）、磷脂酰肌醇3激酶催化亚基α（Phosphatidylinositol-3-Kinase Catalytic Subunit Alpha，PIK3CA）等10个核心靶点，可能通过调控神经活性配体-受体相互作用等通路发挥药理作用，且这两类成分与药理作用关联性较强。综合来看，河南开封、四川广安、河北保定和山西长治四个地区的蝉蜕质量较优，与传统记载“大者入药”一致。本研究建立了高分辨质谱代谢组学与网络药理学相结合的蝉蜕质量评价策略，为其品质评价提供了新的科学依据。

Abstract

Cicadae Periostracum, the exuviae shed by nymphs of Cryptotympana pustulata Fabricius during eclosion, has been used in traditional medicine for over a thousand years. Currently, its quality is evaluated primarily based on morphological characteristics, lacking standardized and scientifically robust quality control indicators linked to efficacy. In this study, authentic Cicadae Periostracum samples from eight major producing areas were collected and identified by morphological and microscopic examination. Ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS/MS) was employed for metabolomic profiling, and quality assessment was performed by integrating metabolomics with network pharmacology. A total of 52 N-acetyldopamine compounds (from monomers to pentamers), 29 linear dipeptides, and 6 amino acids were identified. Samples from Kaifeng (Henan), Guang'an (Sichuan), and Baoding (Hebei) exhibited relatively higher contents of N-acetyldopamine compounds, while samples from Changzhi (Shanxi) and Guang'an (Sichuan) showed significantly higher levels of characteristic peptides and amino acids. Further network pharmacology analysis revealed that N-acetyldopamine and dipeptide components act on ten core targets, including Sarcoma Proto-oncogene Tyrosine-Protein Kinase (SRC) and Phosphatidylinositol-3-Kinase Catalytic Subunit Alpha (PIK3CA), potentially exerting pharmacological effects through pathways such as neuroactive ligand-receptor interactions. Moreover, these components demonstrated stronger correlations with pharmacological activities. In conclusion, the quality of Cicadae Periostracum from the four regions—Kaifeng (Henan), Guang'an (Sichuan), Baoding (Hebei), and Changzhi (Shanxi)—appears superior, consistent with the traditional notion that "larger specimens are preferable for medicinal use." This study establishes an integrated strategy combining high-resolution mass spectrometry metabolomics and network pharmacology for quality evaluation of Cicadae Periostracum, providing new scientific evidence for its quality assessment.

Graphical abstract

关键词

蝉蜕 / N-乙酰多巴胺类 / 二肽 / 结构鉴定 / 质量波动

Key words

cicadae periostracum / N-acetyldopamine analogs / dipeptide / structure identification / quality fluctuation

蝉蜕，又称蝉衣、蝉壳、蝉甲等，为昆虫纲（Insecta）半翅目（Homoptera）蝉科（Cicadidae）蚱蝉属（Fabricius）黑蚱（Cryptotympana pustulata Fabricius）的若虫羽化时脱落的皮壳，被《中国药典》收录为法定药材^［1］。其主要产地包括山东、河南、河北、湖北、四川及山西等地^［2］。

蝉蜕性寒、味甘，归肺、肝经。蝉蜕中含有甲壳质、蛋白质、氨基酸、乙酰多巴胺以及多种微量元素^［3-5］。其中，乙酰多巴胺类成分具有显著的抗炎、抗氧化及抗肿瘤等活性，被认为是蝉蜕的主要药效物质^［6］。现代药理研究表明，蝉蜕具有抗惊厥、镇静、止痛、解热、镇咳、祛痰、平喘、解痉、抗感染、抗肿瘤、抗凝及抗过敏等多种作用^［7-8］。其药用历史已逾千年，疗效确切。然而由于蝉蛋白质本身营养价值高，民间食用盛行，导致药用蝉蜕资源紧缺；加之本身质地薄脆，在水洗及去泥沙处理中极易破损，进一步推高其市场价格，近年来每千克批发价格已达到1 000~2 000元。目前市场上流通的蝉蜕基原品种约十余种，但仅有黑蚱被《中国药典》（2025版）列为正品。由于正品与伪品在药理活性及临床疗效上存在显著差异，当前研究多集于真伪鉴别。例如，梅仿等通过系统表征乙酰多巴胺类成分，结合超高液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）技术建立了蝉蜕的指纹图谱^［9］；曹馨慈等利用UPLC-QTQF-MS/MS（Quadrupole Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry，四极杆飞行时间串联质谱）技术对不同基原蝉蜕的乙酰多巴胺多聚体进行比较，共鉴定出34个该类成分^［10］；张欢欢等则基于细胞色素c氧化酶亚基I（Cytochrome c Oxidase subunit I，COI）条形码技术开展了蝉蜕及其混淆品的DNA分子鉴定^［11］；童培珍等采用UPLC-MS联用技术，以特征肽段（m/z=493.77）为检测离子，实现了蝉蜕的真伪鉴别^［12］。尽管上述方法可以有效地区分真伪，但仍难以评价蝉蜕的内在品质优劣。

对于蝉蜕的质量评价，《雷公炮制药性解》记载“以形大者入药为良”，《本草从新》也有记载“大者入药”。《中国药典》2025版（一部）中，蝉蜕的质量标准仅有外观性状鉴别，缺乏与药效相关联的成分质控指标，因此亟须建立一套基于整体成分的全面质量评价方法，以保障蝉蜕药材的整体质量。高分辨质谱代谢组学能够全局、高效、精准解析中药复杂化学成分^［13-15］，获取全面化学指纹；网络药理学能够从系统生物学角度阐释多成分、多靶点、多通路的整合调控机制^［16］。二者联用可精准筛选与疗效相关的质量标志物，阐明质量标志物与药效的内在关联^［17-20］，为中药质量评价提供更科学、更全面、更符合中医药整体观的研究策略。本研究从八个不同主产地采集市售蝉蜕样品，经性状与显微鉴定确认为正品黑蚱，进一步采用UPLC-QTQF-MS/MS技术进行定性分析。通过自建数据库、解析对照品质谱裂解行为、分析色谱保留特性，总结特征离子与中性丢失规律，系统鉴定其化学成分的结构，并利用超高效液相色谱对乙酰多巴胺、氨基酸及肽类进行相对含量比较。同时结合网络药理学，将蝉蜕中的活性成分与机体疾病靶点进行精准映射。而这种成分与靶点的对应关系，直接决定了蝉蜕药效的强弱。

本研究旨在建立一种基于高分辨质谱代谢组学和网络药理学分析相结合的质量评价策略，为蝉蜕的品质评价和临床合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1　主要仪器与材料

Neofuge 13R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）、Sartorius BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、ExionLC^TM AD（AB SCIEX公司），5600QTOFTM 质谱仪（AB SCIEX公司），KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），色谱柱Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 µm），微孔滤膜（津腾尼龙66，0.22 µm）、SCIEX OS数据处理软件。

质谱级甲醇、甲酸和乙腈（Fisher公司）、娃哈哈纯净水。其他试剂为分析纯。

市售八批蝉蜕药材样品，来自不同产地、不同饮片厂、不同批次，每批次不少于30 g。全部样品经山西药科职业学院张玮玮副教授根据《中国药典》（2025版）、《中国药用动物志》鉴定为蝉科昆虫黑蚱（Cryptotympana pustulata Fabricius）的若虫羽化时脱落的皮壳，具体信息见表1。

1.2　实验方法

1.2.1　样品制备

将蝉蜕研磨成细粉，取350 mg样品并加入2 mL的80%甲醇（体积分数），超声提取1.5 h，4 ℃下13 000 g/min高速离心10 min取上清，用0.22 µm的微孔滤膜（尼龙）过滤后进行质谱仪器分析。每批药材平行制备两份样品。

1.2.2　色谱条件

色谱柱Waters Acquity UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm），柱温40 ℃，流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（体积分数以下同），梯度洗脱程序为：0 min~4 min，5%~20%B；4 min~10 min，20%B；10 min~11 min，20%~25%B；11 min~13 min，25%B；13 min~13.5 min，25%~30%B；13.5 min~15 min，30%B；15 min~18 min，30%~55%B，18 min~23 min，55%~95%B；23 min~25 min，95%~5%B；25 min~27 min，5%B。流速0.4 mL/min，进样量2 µL。

1.2.3　质谱条件

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），正离子模式（Electrospray Ionization Positive Mode，ESI+），喷雾电压（Ion Spray Voltage，IS）为+5 500 V；离子源温度（Temperature，TEMP）为500 ℃；气帘气（Curtain Gas，CUR）为35 psi；雾化气（Gas 1，GS1）和辅助气（Gas 2，GS2）均为55 psi；去簇能量（Declustering Potential，DP）60 V；碰撞能量（Collision Energy，CE）30 V。

1.3　数据处理

采用SCIEX OS 2.0.1软件采集并处理质谱数据。基于高分辨质谱提供的精确分子量与二级碎片信息，并结合PubChem、HMDB等数据库及相关文献的质谱数据对化合物进行指认。使用XCMS R代码包对8批蝉蜕样本数据进行峰提取，基于峰面积进行半定量分析。使用微生信-在线生物信息学分析、可视化云平台进行每类化合物聚类热图的绘制。

2 结果与分析

2.1　性状鉴别

8批蝉蜕的性状和2025版《中国药典》一部中蝉蜕的性状描述相同。本品略呈椭圆形而弯曲，长约3.5 cm，宽约2 cm。表面黄棕色，半透明，有光泽。头部有丝状触角一对，绝大多数已经断落，复眼突出。额部先端突出，口吻发达，上唇宽短，下唇伸长呈管状。胸部背面呈十字形裂开，裂口向内卷曲。脊背两旁具小翅两对，腹面有足三对，被黄棕色细毛。腹部钝圆，共9节。体轻，中空，易碎。气微，味淡。其中山西长治的蝉蜕表面为黄棕色，半透明，体型为最大。胸部背面呈十字形裂开，裂口向内卷曲尤为明显。按照体型大小，其次为河南开封和河北保定的蝉蜕样本，其表面为淡黄棕色，半透明有光泽，体型较大，胸部背面十字形裂口较大。而四川广安的蝉蜕表面为浅棕色，半透明有光泽，体型比山西长治、河南开封、河北保定稍小。安徽亳州、山东平邑、山东临沂、山东阳谷的蝉蜕表面颜色为浅褐色，半透明有光泽，体型比其他产地的略小。

2.2　显微鉴别

参照《中国药典》（2025版）第四部通则2001显微鉴别法项下的粉末制片方法，将8批蝉蜕样品粉碎过四号筛，取少许粉末于干净的载玻片上，加水合氯醛1~2滴，置于酒精灯上微微加热透化，重复2~3次，冷却，滴加稀甘油1~2滴，盖上盖玻片，显微镜下观察蝉蜕显微特征。

如图1所示，蝉蜕粉末浅褐色，刚毛黄棕色、黄色或红棕色，多已断裂，分为三型：Ⅰ型黄棕色或红棕色，长15~20 µm；Ⅱ型黄色细长，长达83 µm，前段近三分之二胞腔不明显；Ⅲ型黄色或黄棕色，长达90 µm，胞腔明显。体壁碎片黄色，密布乳头状突起，有的可见刚毛基痕；有的体壁碎片仅见刚毛基痕但是无乳头状突起。复眼碎片淡黄色，断面层状，平滑。8个产地的蝉蜕在显微性状上无明显区别，以下为山西长治地区蝉蜕的显微性状（比例尺为1∶40）。

2.3　蝉蜕代谢物鉴定

2.3.1　N-乙酰多巴胺类化合物的鉴定

通过参考文献中N-乙酰多巴胺类化合物在正离子模式下的裂解规律，本研究在当前UPLC - Q TOF条件下，共检测到52个N-乙酰多巴胺，其中有6个单聚体，22个二聚体，18个三聚体，4个四聚体和2个五聚体，见表2和表3。

2.3.1.1　乙酰多巴胺单聚体解析

乙酰多巴胺单聚体的裂解主要是在酰胺键发生存在两条核心裂解途径：一是酰胺键断裂丢失COCH₂（42 Da）；二是丢失NH₂COCH₃（59 Da）并进一步连续失去H₂O、CO等小分子，形成特征性的次级碎片。以化合物1（C₁₀H₁₃NO₃）为例，正离子模式下母离子峰为m/z 196.096 6。酰胺键断裂产生COCH₂（42 Da）的中性丢失，得到m/z 154.085 9 ［M+H-COCH₂］⁺；或母离子丢失NH₂COCH₃（59 Da）产生m/z 137.060 4 ［M+H-NH₂COCH₃］⁺， 接着再脱H₂O产生m/z 119.049 9 ［M+H-NH₂COCH₃-H₂O］⁺，再失去CO（28 Da）得到m/z 91.056 6 ［M+H-NH₂COCH₃-H₂O-CO］⁺的碎片离子。

2.3.1.2　乙酰多巴胺二聚体的解析

乙酰多巴胺二聚体有两条特征裂解途径：一是母离子丢失NH₂COCH₃（59 Da），然后酰胺键断裂进一步丢失COCH₂（42 Da）；二是母离子二氧环桥断裂丢失一个乙酰多巴胺单聚体C₁₀H₁₁NO₃（193 Da），进而得到m/z 192、193、194这几个特征碎片中的一个或几个，这些离子的酰胺键断裂可进一步丢失COCH₂（42 Da）。以化合物7（C₂₀H₂₂N₂O₆）为例，正离子模式下母离子峰为m/z 387.155 3，母离子丢失NH₂COCH₃（59 Da）得到m/z 328.116 4 ［M+H-NH₂COCH₃］⁺的碎片离子，酰胺键断裂继续失去COCH₂（42 Da）得到m/z 286.106 2 ［M+H-NH₂COCH₃-COCH₂］⁺的碎片离子；或母离子二氧环桥断裂得到诊断离子m/z 194.079 5、m/z 192.064 4，再分别丢失COCH₂（42 Da）得到m/z 152.069 2、m/z 150.054 4的碎片离子。

2.3.1.3　乙酰多巴胺三聚体的解析

乙酰多巴胺三聚体的裂解始于母离子外侧二氧环桥断裂，首先丢失一个乙酰多巴胺单聚体C₁₀H₁₁NO₃（193 Da），进一步断裂一个二氧环桥键，再丢失一个乙酰多巴胺单聚体C₁₀H₁₁NO₃（193 Da），得到m/z 192，193，194这几个特征碎片中的一个或几个，这些离子酰胺键断裂，可进一步丢失COCH₂（42 Da）。以化合物34（C₃₀H₃₁N₃O₉）为例，正离子模式下母离子峰为m/z 578.212 7，外侧第一个二氧环桥断裂丢失一个乙酰多巴胺单聚体得到m/z 387.153 2、m/z 385.038 8，第二个二氧环桥断裂丢失一个乙酰多巴胺单聚体得到m/z 194.080 7、m/z 192.065 5的碎片离子，该离子m/z 192.065 5酰胺键断裂丢失COCH₂（42 Da）得到m/z 150.055 4的碎片离子。

2.3.1.4　乙酰多巴胺四聚体及五聚体的裂解规律

乙酰多巴胺四聚体或五聚体的裂解是由于母离子外侧二氧环桥逐步断裂，每次断裂均会丢失一个乙酰多巴胺单聚体C₁₀H₁₁NO₃（193 Da），得到m/z 192，193，194这几个特征碎片中的一个或几个，这些离子酰胺键断裂，可进一步丢失COCH₂（42 Da）。因此，乙酰多巴胺三聚体、四聚体及五聚体的裂解规律是一致的。以乙酰多巴胺四聚体化合物48（C₄₀H₄₀N₄O₁₂）为例，正离子模式下母离子峰为m/z 769.271 2，母离子外侧第一个二氧环桥断裂丢失一个乙酰多巴胺单聚体，得到m/z 578.209 0的碎片离子，第二个二氧环桥断裂再丢失一个乙酰多巴胺单聚体，得到 m/z 385.137 8的碎片离子，第三个二氧环桥断裂继续丢失一个乙酰多巴胺单聚体得到m/z 192.065 1的碎片离子。

2.3.2　直链二肽及氨基酸的鉴定

在碰撞诱导解离（Collision Induced Dissociation，CID）模式下，直链二肽的碎裂主要以肽键的断裂为主导，产生b系列和y系列离子，中性丢失为氨基酸残基。此外，常见的小分子中性丢失，如一氧化碳（CO）、水（H₂O）和氨（NH₃），也广泛出现在碎片离子中。

如酪氨酰-脯氨酸（Tyrosyl-Proline，Tyr-Pro）的准分子离子峰为m/z 279.135 9 ［M+H］⁺，主要有三种裂解方式：第一种裂解方式为母离子失去NH₃后产生碎片离子m/z 262.108 7 ［M+H-NH3］⁺；第二种裂解方式为母离子在肽键处断裂失去酪氨酸（Tyr）产生m/z 116.071 6 ［M+H-Tyr］⁺的碎片离子，接着失去CO、H₂O后产生m/z 70.068 4 ［M+H-Tyr-CO-H₂O］⁺的碎片离子；第三种裂解方式为母离子在肽键处断裂失去脯氨酸（Pro）残基及CO后，产生碎片离子m/z 136.075 3 ［M+H-Pro-CO］⁺。

谷氨酰-缬氨酸（Glutamyl-Valine，Glu-Val）的准分子离子峰为m/z 247.128 7 ［M+H］+，第一种裂解方式是母离子失去NH₃、CO、H₂O，分别产生m/z 230.104 1［M+H-NH₃］⁺、184.095 3［M+H-NH₃-CO-H₂O］⁺、156.102 0［M+H-NH₃-CO-H₂O-CO］⁺的碎片离子；第二种裂解方式为母离子在肽键处断裂失去谷氨酸残基后形成m/z 118.087 3 ［M+H-Glu］⁺，接着失去CO、H₂O后产生m/z 72.084 5 ［M+H-Glu-CO-H₂O］⁺的碎片离子；第三种裂解方式为母离子在肽键处断裂失去缬氨酸残基接着失去CO和H₂O后产生m/z 84.046 9 ［M+H-Val-CO-H₂O］⁺的碎片离子。

Val-Pro的准分子离子峰为m/z 215.138 7 ［M+H］⁺，母离子在肽键处断裂失去一分子缬氨酸（Val）残基后产生m/z 116.071 1 ［M+H-Val］⁺的碎片离子，接着失去CO、H₂O后产生m/z 70.069 7 ［M+H-Val-CO-H₂O］⁺的碎片离子；或者母离子失去脯氨酸残基继续失去CO后产生m/z 72.083 9 ［M+H-Pro-CO］⁺的碎片离子。

基于上述直链二肽裂解规律和鉴定方法，在八批蝉蜕中共鉴定到29个二肽。此外，在蝉蜕中还鉴定到6个氨基酸类成分，包括5-氧代-脯氨酸（5-O-Pro）、4-氧代-脯氨酸（4-O-Pro）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）。

2.4　不同批次蝉蜕代谢物含量比较

采用代谢组学分析方法对8批蝉蜕进行比较（图2（a）），结果可见，8批蝉蜕化学组成明显不同。河南开封、四川广安和河北保定的蝉蜕样本位于散点图的右半部分，与其他样本存在差异。此外，山西长治蝉蜕样本与其他样本也存在一定差异。

进一步采用热图对N-乙酰多巴胺类成分和氨基酸肽类分别进行比较。由图2（b）可见，本研究所鉴定的52个N-乙酰多巴胺类成分在8批蝉蜕中的含量分布规律总体一致，即在河南开封、四川广安和河北保定这3个样本中含量较高，而在其他产区中相对含量较低。不同产区8批蝉蜕中6个氨基酸和29个二肽类相对含量呈现不同的特征。如图2（c）所示，不同产区蝉蜕中二肽含量存在显著差异，波动较大。四川广安的蝉蜕样本中部分二肽相对含量显著高于其他样本，这些二肽主要是亮氨酸和异亮氨酸构成的二肽，如Leu-Pro、Ile-Pro、Val-Pro、Leu-Ala、Ile-Ala、Leu-Ile、Leu-Leu、Val-Leu、Val-Val、Ala-Leu、Ile-Leu、Ile-Ile、Leu-Val和Val-Ile等。此外，山西长治蝉蜕中部分二肽和氨基酸的相对含量显著高于其他批次，如Ser-Tyr、Phe-Ser、Ile-Gly、Val-Tyr、Tyr-Pro、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）。安徽亳州蝉蜕中5-氧代-L-脯氨酸和4-氧代-L-脯氨酸的含量显著高于其他批次；含有谷氨酸的二肽（包括Glu-Phe、Glu-Ile、Glu-Leu和Glu-Val）在河北保定产蝉蜕中的相对含量高于其他批次。而山东阳谷、山东临沂、山东平邑和河南开封蝉蜕样本中二肽和氨基酸相对含量低于其他样本。

2.5　蝉蜕网络药理学分析

2.5.1　蝉蜕代谢化合物关键靶点的筛选

基于上述高分辨质谱鉴定结果，蝉蜕代谢物主要包括N-乙酰多巴胺类成分和小分子肽类成分。鉴于本研究鉴定的N-乙酰多巴胺类成分存在多种异构体，而质谱无法精准确定异构体，选择其中16种成分进行网络药理学分析。此外，本研究鉴定的29种肽类成分及6种氨基酸成分均有明确的结构，因此全部纳入网络药理学分析。运用Pubchem数据库和Swiss Target Prediction数据库分别获取上述活性成分对应作用靶点238和336个，二者去重合并后得到靶点集501个。

已有研究表明蝉蜕对癫痫和帕金森病模型具有明确的药理作用^［21-28］，结合蝉蜕的临床功效和临床应用^［4］，选择癫痫和帕金森病两种疾病进行网络药理学分析。采用GeneCards数据库分别获得癫痫9 779个靶点与帕金森病 11 596个靶点。分别与蝉蜕代谢物靶点集取交集，获得共有靶点356和394个，即为蝉蜕治疗癫痫和帕金森病的潜在作用靶点（图3）。

2.5.2　PPI网络分析

将356个与癫痫相关的关键交集靶点基因和394个与帕金森病相关的关键交集靶点基因分别导入STRING平台，借助STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，置信度：high confidence（0.900），并把这个网络中的各个节点信息导入Cytoscape 3.10.3软件，利用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析见图4（a）、图4（c）后，通过CytoHubba插件的Degree算法筛选出前10个核心靶点见图4（b）、图4（d）。两种疾病所筛选出Degree前十的关键靶点相同，分别是SRC、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、STAT3、PIK3CB、HDAC1、PIK3CD、GRB2、ESR1。

2.5.3　关键靶点的GO功能及KEGG通路富集分析

对获得的相关基因靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。GO富集分析涉及生物学的3个方面：生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。GO分析涉及基因数量最多的前10条通路如图5（a）、图5（c）所示。KEGG信号通路分析以基因数目降序排列，其中排名前20的信号通路见图5（b）、图5（d），圆圈越大，通路包含的靶点数目越多。

在蝉蜕成分针对癫痫作用靶点的GO分析中，生物过程中主要富集于神经调节与血管功能相关条目，如响应异生物质刺激、调节MAPK级联、血液循环等，提示其可能通过G蛋白偶联受体信号通路影响癫痫病理过程。细胞组分显著富集于突触膜、突触前后膜等神经元连接结构，以及膜筏和囊泡腔等区域，表明其可能参与突触传递和神经递质释放。分子功能主要涉及组蛋白激酶活性、神经递质受体活性和谷氨酸受体活性等，与神经元兴奋性和突触可塑性调控密切相关。

在蝉蜕成分针对帕金森作用靶点的GO分析中，生物过程中基因富集于MAPK级联的正向调控、对肽激素的反应及G蛋白偶联受体信号通路，涉及神经调节与应激反应。细胞组分中，基因高度集中在突触膜、突触后膜及囊泡腔等神经元关键功能结构，表明其对突触传递的潜在影响。分子功能上，最显著的富集是组蛋白激酶活性（如H₃激酶），提示蝉蜕可能通过表观遗传调控机制影响帕金森病相关基因的表达。

如图6所示，两种疾病关键靶点的KEGG通路较为相似。前20通路中共同的通路有18个，包括神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、神经活性配体信号通路（Neuroactive ligand signaling）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、钙离子信号通路（Calcium signaling pathway）等。二者与蝉蜕代谢化合物靶点的交集靶点显著富集于多个核心信号通路。其中最突出的包括神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路和MAPK信号通路。这些通路共同调控神经元兴奋性、突触传递和细胞存活。在癫痫KEGG通路中，“PI3K-Akt信号通路”的富集提示了蝉蜕代谢化合物可能通过调节细胞生长和凋亡来影响癫痫病理。在帕金森病KEGG通路中，同样是“Neuroactive ligand-receptor interaction”通路最为显著，提示蝉蜕活性成分可能通过调节神经递质系统影响帕金森病相关的神经元活动。此外，“Calcium signaling pathway”和 “MAPK signaling pathway”的富集，表明其在调节细胞内钙稳态和丝裂原活化蛋白激酶级联反应中的潜在作用，这两者在多巴胺能神经元的存活、凋亡及炎症反应中至关重要。

2.5.4　关键靶点与蝉蜕成分的关联性

根据筛选出的Degree值Top10的关键靶点，统计关键靶点与蝉蜕中化合物的对应情况。由表2及“关键靶点-关键成分网络图”（图7）可见，绿色菱形代表N-乙酰多巴胺类成分，红色三角形代表小分子肽类成分，蓝色圆形代表关键靶点，有8个关键靶点与7个N-乙酰多巴胺类成分相关，6个关键靶点与10个小分子肽类成分相关。这表明蝉蜕在治疗癫痫和帕金森病过程中N-乙酰多巴胺类成分和肽类成分都发挥着重要的作用，但N-乙酰多巴胺类成分可能与蝉蜕药理作用的关联性更强。

表2　基于UPLC - QTQF-MS/MS的8个产地蝉蜕已鉴定化合物指认表

Table 2　Table of identified compound assignment in Cicadae Periostracum from 8 producing areas based on UPLC-QTQF-MS/MS

续表2　基于UPLC - QTQF-MS/MS的8个产地蝉蜕已鉴定化合物指认表

Continued Table 2　Table of identified compound assignment in Cicadae Periostracum from 8 producing areas based on UPLC-QTQF-MS/MS

续表2　基于UPLC - QTQF-MS/MS的8个产地蝉蜕已鉴定化合物指认表

Continued Table 2　Table of identified compound assignment in Cicadae Periostracum from 8 producing areas based on UPLC-QTQF-MS/MS

3 讨论

蝉蜕是中医临床常用动物类药材^［29］，其质量波动关乎临床疗效。本研究收集了不同产区8批蝉蜕药材，基于高分辨质谱结构鉴定和网络药理学分析对其进行质量评价。基于高分辨质谱裂解规律分析，本研究鉴定N-乙酰多巴胺类成分52个，提示该类成分是蝉蜕的主要化学成分，与已有文献报道一致^［30］。此外，本研究还鉴定直链二肽类成分29个。在蝉蜕化学成分结构鉴定基础上，进一步采用代谢组学分析了不同蝉蜕的化学差异，结果显示不同产区蝉蜕N-乙酰多巴胺类成分和直链二肽类均存在显著差异。

本研究进一步基于网络药理学方法，系统探讨了蝉蜕代谢物干预癫痫与帕金森病的潜在作用机制。结果表明，蝉蜕中N-乙酰多巴胺类及小分子肽类成分可能通过作用于SRC、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、STAT3、PIK3CB、HDAC1、PIK3CD、GRB2、ESR1等核心靶点，调节神经信号传导、突触功能、细胞凋亡及表观遗传等多个生物学过程，从而在癫痫与帕金森病的病理进程中发挥治疗作用。PPI网络分析识别出SRC、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、STAT3、PIK3CB、HDAC1、PIK3CD、GRB2、ESR1两种疾病10个共有核心靶点。这些蛋白在细胞信号转导、炎症反应、存活与凋亡调控中均发挥关键作用。例如，SRC和MAPK1广泛参与MAPK与PI3K-Akt等重要信号通路，调节神经元兴奋性与可塑性；而HSP90AA1和HDAC1则分别参与蛋白质折叠调控和组蛋白去乙酰化修饰，可能与神经退行性疾病中异常蛋白聚集及基因表达失调密切相关。

GO功能富集分析进一步揭示了蝉蜕成分在生物学过程中的作用特点。在癫痫模型中，蝉蜕成分可能通过调节MAPK级联、G蛋白偶联受体信号通路及神经递质受体活性等，影响神经元兴奋性与突触传递；而对于帕金森病，除上述通路外，还显著富集于组蛋白激酶活性相关功能，提示其可能通过表观遗传机制调节疾病相关基因表达。这些结果共同表明，蝉蜕不仅作用于神经递质系统，还可能参与基因表达层面的调控，体现出其多维度干预的特点。KEGG通路分析结果显示，蝉蜕成分显著富集于神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和钙信号通路等关键通路。这些通路在维持神经元稳态、调节细胞存活与凋亡、控制炎症反应等方面发挥核心作用。特别值得注意的是，PI3K-Akt和MAPK通路在癫痫和帕金森病中均被富集，提示蝉蜕可能通过促进神经元存活、抑制异常凋亡过程，在两种疾病中发挥类似的保护机制。此外，钙信号通路的富集也提示蝉蜕可能参与调控细胞内钙稳态，进而影响神经递质释放和神经元兴奋性，这为理解其抗癫痫和神经保护作用提供了新视角。

根据关键靶点在蝉蜕代谢化合物中的数量，结果表明蝉蜕中N-乙酰多巴胺类成分和肽类成分都发挥着重要的作用，关键靶点所关联的N-乙酰多巴胺类成分的数量相较于小分子肽类成分更多，这表明N-乙酰多巴胺类成分可能与蝉蜕药理作用的关联性更强。结合8批蝉蜕中N-乙酰多巴胺类和二肽类成分相对含量比较，我们发现不同产区的蝉蜕成分含量不同，可能导致蝉蜕品质的差异。如河南开封、四川广安和河北保定三个地区的N-乙酰多巴胺类成分相对含量显著高于其他样本；来源于四川广安和山西长治蝉蜕中的二肽相对含量显著高于其他批次，而网络药理学提示山西长治地区的蝉蜕中含量较高的二肽类成分与关键靶点的关联性更高。因此，综合来看，河南开封、四川广安、河北保定和山西长治四个地区的蝉蜕品质可能更好，而这些蝉蜕体型较大，与传统记载的“大者入药”一致。综上，本研究以蝉蜕为例，提出了一种基于高分辨质谱代谢组学和网络药理学分析结合的质量评价策略，为中药质量评价尤其是动物类药材提供了借鉴和参考。然而，蝉蜕具有多种功效，现代研究也表明其具有多种药理作用，属于典型的多效中药，不同的功效、药理作用可能对应不同的化学成分，即其质量评价指标也不同。因此，在今后的研究中，我们还要结合蝉蜕在呼吸系统等其他方面的药理作用进行质量评价。

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基金资助

国家青年岐黄学者项目(2022-256)

山西省中医药管理局课题(zyytd2024020)

山西药科职业学院院级课题(课题编号2025120)