基于miRNA-mRNA表达谱分析增液汤对功能性便秘大鼠结肠组织功能的调节作用

Regulatory effect of Zengye Decoction on colonic tissue function in rats with functional constipation: a study based on microRNA-messenger ribonucleic acid expression profile

摘要

目的 探讨增液汤对功能性便秘大鼠结肠组织微小核糖核酸MicroRNA（miRNA）-信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达的影响。 方法 将18只SPF级SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组均给予复方地芬诺酸混悬液治疗便秘。治疗组造模后给予增液汤治疗7 d，记录大鼠粪便情况和收集大鼠结肠组织。苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠结肠病变，结肠组织进行转录组测序，实时荧光定量逆转录聚合酶链反（real time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）验证测序结果。 结果 与对照组比较，模型组大鼠首粒黑便排出时长明显延长（F=341.909，P<0.001），粪便颗粒数明显减少（F=116.800、86.502，P<0.001），粪便含水量明显降低（F=234.897、388.500，P<0.001）；小肠推进率明显降低（F=5 249.009，P<0.001）；大鼠结肠组织病变明显。与模型组比较，治疗组大鼠首粒黑便排出时长明显缩短（F=341.909，P<0.001），14 d粪便颗粒数明显增加（F=116.800、86.502，P<0.01），粪便含水量明显增加（F=234.897、388.500，P<0.001）；小肠推进率明显上升（F=5 249.009，P<0.001），结肠组织未见明显病变。增液汤导致结肠miRNA-mRNA网络表达谱的改变。转录组测序共筛选出541个差异表达的mRNA（241个下调和300个上调），17个差异表达的miRNA（12个下调和5个上调）（P<0.05）。基因本体（gene ontology，GO）功能分析发现差异表达的mRNA-miRNA主要富集在细胞内。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集通路分析发现差异表达的mRNA主要富集于cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路。 结论 增液汤治疗减少了大鼠排便时间，增加了大鼠排便颗粒数，增加了大鼠粪便含水量，增加了大鼠肠道蠕动，改变了大鼠结肠miRNA-mRNA表达谱，改善大鼠便秘症状。

Abstract

Objective To investigate the effect of Zengye Decoction on the expression of microRNA（miRNA）-messenger ribonucleic acid（mRNA） in colon tissue of rats with functional constipation. Methods A total of 18 specific pathogen-free Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，model group，and treatment group. The rats in the model group and the treatment group were given compound diphenoxylate suspension for constipation treatment，and those in the treatment group were treated with Zengye Decoction for 7 days after modeling. The condition of feces was recorded，and colon tissue samples were collected. HE staining was used to observe the colonic lesions of rats，transcriptome sequencing was performed for colonic tissue，and RT-qPCR was used to verify the results of sequencing. Results Compared with the control group，the model group had a significantly longer time for first black stool excretion（F=341.909，P<0.001） and significant reductions in the number of fecal particles（F=116.800，86.502，P<0.001），fecal water content（F=234.897，388.500，P<0.001），and small intestine propulsion rate（F=5249.009，P<0.001），with marked pathological changes of colon tissue. Compared with the model group，the treatment group had a significant reduction in the time for first black stool excretion（F=341.909，P<0.001） and significant increases in the number of fecal particles on day 14（F=116.800，86.502，P<0.01），fecal water content（F=234.897，388.500，P<0.001），and small intestine propulsion rate（F=5249.009，P<0.001），with no marked pathological changes of colon tissue. Zengye Decoction induced the change in the miRNA-mRNA network expression profile in colon tissue. Transcriptome sequencing identified 541 differentially expressed mRNAs（241 downregulated mRNAs and 300 upregulated mRNAs） and 17 differentially expressed miRNAs（12 downregulated miRNAs and 5 upregulated miRNAs）（P<0.05）. The GO functional analysis showed that the differentially expressed mRNAs-miRNAs were mainly enriched in cells，and the KEGG pathway enrichment analysis showed that the differentially expressed mRNAs were mainly enriched in the cGMP-PKG signaling pathway and the cAMP signaling pathway. Conclusion Zengyou Decoction can reduce the defecation time of rats，increase the number of fecal particles and fecal water content，improve the intestinal motility of rats，and change the miRNA-mRNA network expression in the colon，thereby improving constipation in rats.

Graphical abstract

关键词

增液汤 / miRNA-mRNA表达谱 / 功能性便秘

Key words

Zengye Decoction / microRNA-messenger ribonucleic acid expression profile / functional constipation

功能性便秘是一种常见的胃肠道疾病，影响所有年龄段人群。其特征为便秘和排便不完全^[1]，且女性的患病率略高于男性^[2]。老年人是慢性便秘的主要人群，功能性便秘的患病率随着年龄的增长而增加^[3]。有研究表明，改善胃肠蠕动是治疗便秘的有效方法^[4]。

在现代医学中，功能性便秘与饮食习惯、肠道微生态、肠道转运动力学、肠神经系统异常等因素有关^[5-6]。在中医中，将便秘归因于胃肠热、肠湿等原因^[7-8]。增液汤是一种中药配方的名称，摘自《文治转志》第二卷，这是治疗干燥的药。它有增加水流的作用，用于治疗阳明温病，无上焦证，在人阴虚、程气不可行的情况下，服用后数日可大便^[9]。症状表现为便秘、口渴、舌干、脉细或凹陷无力，临床上多用于温热病液虚、肠干便秘^[10]。

MiRNA是生物体内的一种非编码小RNA。通过与靶基因mRNA的互补配对，在转录后水平调控基因表达^[11]，并广泛参与细胞内信号和功能调控^[12]。由于每个miRNA具有多个靶基因，且同一基因受到多个miRNA的调控，形成了一个复杂的调控网络^[13]。中医治疗具有多靶点、多机制的特点，通过构建中药治疗后的miRNA-mRNA网络图谱，可以更全面、更广泛地解释中药对细胞功能和信号通路的调控机制。本研究旨在探讨增液汤对功能性便秘大鼠结肠组织miRNA表达的影响，构建增液汤调控的miRNA-mRNA网络图谱，为解释增液汤改善功能性便秘提供新的靶点和调控机制。

1 材料与方法

1.1 增液汤药物制备

增液汤成分为玄参30 g、细生地24 g、麦冬24 g，常法煎制、滤渣、浓缩药液，用超纯水调配成含生药0.51 g/mL的药液。

1.2 动物分组与设计

SPF级雄性SD大鼠18只（160±20） g，购自成都达硕实验动物有限公司[SCXK（川）2021-0036]。实验在川北医学院附属医院进行，实验动物在SPF级动物设施中饲养，室温为（23±1） °C，湿度为65%~75%，12 h的光暗循环，自由饮食进水。所有实验程序均经华西医院伦理委员会批准（批准编号：2022216001）。适应喂养7 d后，将大鼠随机分为3组:对照组（n=6）、模型组（n=6）和治疗组（n=6），模型组和治疗组分别给予复方地芬诺酯混悬液4 mL（10 mg/kg）灌胃7 d，对照组灌胃相应体积生理盐水。模型组大鼠干便较少时，功能性便秘大鼠模型成功建立。从第8天起，试验组小鼠灌胃增液汤2 mL（0.51 g/mL），连续7 d，对照组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水。

1.3 样品收集

实验第14天时，每组大鼠灌胃2 mL墨汁，并将每组大鼠置于代谢笼中6 h。在此期间，仔细收集并记录6 h窗口内产生的粪便颗粒数，测量并记录粪便重量。随后，粪便样品在60 ℃下进行12 h的干燥过程，再次称重以确定其干重。粪便含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。6 h后，大鼠注射1%戊巴比妥钠（300 mg/kg）麻醉处死。打开腹腔，取出从幽门至回盲的肠管，平放于检查台上。测量墨水推进长度和小肠总长度（cm）。墨水推进率计算公式为：墨水推进长度/小肠总长度×100%。取肛门上端5 cm处结肠组织，用生理盐水洗涤，保存在-80 ℃的低温冰箱中。

1.4 HE染色

经脱水透明处理后，将大鼠结肠组织包埋于石蜡中，制备厚度为5 μm的薄石蜡切片。切片用二甲苯脱蜡，然后进行梯度乙醇处理再水化。然后按照HE染色方案提供的说明，按照顺序程序对切片进行染色。切片常规脱水，使其透明并密封，然后在显微镜下观察评估结肠组织的形态特征。

1.5 转录组测序

转录组测序由北京诺禾致源科技有限公司完成。在提取、纯化和构建RNA文库后，使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序。通过转录组分析进行差异基因表达（differential expression analysis，DEG）分析，并将结果进行GO分析和KEGG富集分析。筛选标准设置在P≤0.05的显著性水平。通过GO功能富集鉴定差异表达基因的生物学功能，通过KEGG代谢途径分析鉴定差异表达基因的主要生物学代谢途径。

1.6 RT-qPCR

本研究采用RT-qPCR对差异表达基因进行分析，取10~20 mg结肠组织于EP管中并加入350 μL裂解液LB，用高速低温组织研磨仪捣碎。按照制造商的说明，分别用Trizol试剂提取总RNA。取5 μg的总RNA，通过反转录反应合成cDNA。纯化的RNA作为模板，使用Mir-X miRNA第一链合成试剂盒合成cDNA。用cDNA、Mir-X miRNA RT-qPCR TB Green^®试剂盒和U6的基因特异引物进行RT-qPCR。所有引物都是由生工生物技术（上海）有限公司合成。反应结束后，计算机自动分析每个样品的Ct值，通过2^-ΔΔCt计算相对mRNA表达量。引物序列见补充文件。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，用均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 增液汤对便秘大鼠肠道功能的影响

经过14 d的排便观察，与对照组比较，模型组大鼠首粒黑便排出时长明显延长（P<0.001），粪便颗粒数明显减少（P<0.001），粪便含水量明显降低（P<0.001）；小肠推进率明显降低（P<0.001）；与模型组比较，治疗组大鼠首粒黑便排出时长明显缩短（P<0.001），14 d粪便颗粒数明显增加（P<0.01），粪便含水量明显增加（P<0.001）；小肠推进率明显上升（P<0.001）。见表1。

2.2 增液汤对便秘大鼠结肠组织形态的影响

HE结果显示，对照组大鼠结肠组织结构较完整，未见明显变性、坏死或脱落；模型组大鼠结肠组织损伤，肌层肌纤维萎缩，黏膜固有层局部炎性细胞浸润，与对照组比较黏膜厚度明显降低（P<0.001）；治疗组大鼠结肠组织组织结构较为完整，未见上皮细胞变性、坏死、脱落，未见明显病理改变，与模型组比较结肠厚度明显增加（P<0.001）。见图1。

2.3 增液汤对大鼠结肠组织mRNA-miRNA的影响

为了进一步了解增液汤的作用机制，通过RNA-seq鉴定了各组的差异mRNA和miRNA水平。通过RNA-seq数据和miRNA-seq数据共筛选出541个基因，其中差异上调基因300个，差异下调基因241个。其中，显示明显上调的基因包括Hoxb13、LOC286960、LOC103690354、Cela3b和Cpa1（表2；图2A~C）；表现出下调的前5个deg为LOC103690108、Gpat2、Scn4a、Cyp2c23和Il13（表3；图2A~C）。

此外，本研究鉴定了17个差异miRNA，分别为5个上调的差异基因和12个下调的差异基因。负责上调差异基因表达的miRNA为：rno-miR-1298、rno-miR-216b-5p、rno-miR-216b-3p、rno-miR-217-5p、rno-miR-547-3p、rno-miR-216a-5p、rno-miR-216a-3p、rno-miR-1193-3p、rno-miR-144-3p（表4；图2D~F）。下调差异表达miRNA包括rno-miR-18a-5p、rno-miR-10a-5p、rno-miR-10b-5p、rno-miR-1298（表5；图2D~F）。同时，本研究进行了RT-qPCR验证（图3）。

在mRNA的GO分析结果中，在对照组和模型组中，细胞成分（CC）分析表明，靶基因主要富集于细胞外区域（GO:0005576）和细胞外空间（GO:0005615）（图4A）。在治疗组中，生物过程（BP）分析表明，靶基因富集在免疫系统过程（GO:0002376）相关（图4B）。在miRNA靶基因的GO分析中，对照组和模型组中，细胞组分（CC）分析显示，靶基因主要富集于膜结合细胞器（GO:0043227）和细胞内膜结合细胞器（GO:0043231）（图4C），而模型组和治疗组细胞组分CC分析显示靶基因主要富集于细胞内（GO:0005622）（图4D）。

mRNA-miRNA KEGG分析结果显示，增液汤治疗前后cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路靶基因显著富集（图5）。

3 讨 论

增液汤是临床上常用的一种中药，因其治疗消化不良和便秘的疗效而受到好评^[14]。本研究结果进一步验证了它的潜力，证明了其对复方地芬诺酯所致功能性便秘大鼠的排便促进作用。此外，本研究观察到增液汤增加了粪便的含水量，增强了小肠推进率，并增强了结肠收缩的频率。上述结果提示增液汤具有缓解便秘的作用。

功能性便秘的发病率每年都在增加。目前，西医主要依靠对症治疗，如刺激性泻药、渗透性泻药和润滑泻药^[15]。虽然这些治疗提供了缓解，但其疗效远非理想，往往伴随着明显的不良反应^[15]。相比之下，中医在治疗功能性便秘方面具有明显的优势^[16]。增液汤在临床上广泛用于治疗津液不足引起的便秘。实验研究证实增液汤能兴奋肠道平滑肌，促进肠道蠕动，促进排便^[17]。本研究结果显示，复方地芬诺酯灌胃后，模型组大鼠第一次黑便排泄时间延长，粪便颗粒数量减少，粪便含水量降低。经过增液汤治疗后，大鼠首黑便排泄时间缩短，大便颗粒数增加，大便含水量增加，说明增液汤改善了大鼠的排便功能，恢复了肠道转运功能。

miRNA能够靶向调控细胞，改善靶细胞的生理病理活动，参与疾病的发生发展过程^[18]。在基因调控网络中，miRNA具有准确传递和放大信号的能力^[19]。最新研究表明，miRNAs在调节胃肠运动相关细胞的形态和功能方面发挥着重要作用，是功能性便秘研究的重要靶点^[20]。有研究证实，miRNA及其相关网络参与肠道菌群失衡，是功能性便秘发病的关键^[13,20-21]。相关miRNA缺乏可能导致肠道微生物紊乱，粪便miRNA移植可重建肠道菌群，缓解胃肠道症状^[21]。差异表达的miRNAs可以通过靶向和调控相关基因的转录水平来改变肠道微生物的代谢途径^[22]。肠道疾病患者的肠道组织和外周循环中部分miRNA表达明显改变^[23-24],对于部分患者的肠道病理改变如肠道通透性增加，有确切的证据证明miRNA-29a在对其进行调控，而且Zhu H等^[25]通过大样本的临床研究和实验研究表明miRNA-29a的下游调控因子是紧密连接蛋白ZO-1和claudin-1（CLDN 1），在腹泻患者肠道内，miRNA-29a出现上调，ZO-1和CLDN 1表达则明显下调，从而导致了患者的肠道通透性显著增高，进而导致最终的腹痛腹泻等症状。miRNA-29a-肠道通透性及内脏高敏感完整通路的探明^[26],将在很大程度上有利于未来将miRNA用于肠道疾病的诊断，并将特异性的miRNA作为治疗靶点，例如可以利用miRNA类似物或抑制剂对下游效应因子进行调控从而达到治疗效果。而在功能性便秘小鼠的结肠中，miR-128的表达明显升高，p38 / mcf信号通路受到抑制^[29]。本研究结果表明，增液汤处理可以增加大鼠结肠rno-miR-18a-5p，rno-miR-10a-5p，rno-miR-10b-5p等的表达。通过转录组测序发现，mRNA-miRNA的靶基因在cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路中富集。这表明增液汤调控了便秘大鼠结肠中mRNA-miRNA的表达。综上所述，增液汤能缓解Lop诱导的功能性大鼠便秘症状，促进肠道蠕动，改善结肠组织形态，改变结肠miRNA-mRNA的表达。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82074429)

充市2020年市校科技战略合作专项资助项目(20SXQT0084)