Circ0063517过表达靶向调控miR-31-5p信号通路对小鼠脑缺血再灌注损伤的改善作用

Ameliorative effect of Circ0063517 overexpression on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice by targeting the miR-31-5p signaling pathway

摘要

目的 探讨小鼠脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤相关circ0063517表达在I/R损伤发展中的作用及其作用机制。 方法 构建小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，采用微阵列分析鉴定MCAO/R差异调控的circRNA。在MCAO/R诱导前48 h，在小鼠中诱导circ0063517过表达或miR-31-5p敲低，并在I/R后24 h后进行神经功能缺损的评估，通过三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色测量梗死面积和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色检测凋亡神经细胞。通过荧光素酶分析检测circ0063517和miR-31-5p之间的相互作用。采用定量实时聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测大脑皮质组织中circ0063517、miR-31-5p表达。 结果 微阵列分析显示circ0063517在MCAO/R后24 h小鼠皮质中明显下调。与pCDH-CMV组相比，注射circ0063517过表达质粒的MCAO/R小鼠神经功能障碍的评分显著降低（P<0.05），并且脑梗死面积和皮质细胞凋亡均显著减少（P<0.001）。双荧光素酶报告基因实验证实circ0063517靶向miR-31-5p，并且注射circ0063517过表达质粒的小鼠在I/R后皮质miR-31-5p表达水平较pCDH-CMV组显著降低（P<0.01）。与si-NC组相比，注射si-miR-31-5p的MCAO/R小鼠神经功能障碍的评分显著降低（P<0.05），并且脑梗死面积和皮质细胞凋亡均显著减少（P<0.001）。 结论 Circ0063517过表达通过竞争结合miR-31-5p作为ceRNA，来减轻I /R诱导的损伤。这些结果有助于了解circRNA在I/R损伤发展中的作用，并为其治疗提供新的靶点。

Abstract

Objective To explore the role and mechanism of action of cerebral ischemia-reperfusion（I/R） injury-related circ0063517 expression in the development of I/R injury in mice. Methods A mouse model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R） was established，and the differentially regulated circRNA of MCAO/R was identified by microarray analysis. Circ0063517 overexpression or miR-31-5p knockdown was induced in mice 48 hours before MCAO/R induction，and neurological defects were assessed 24 hours after I/R. The infarct area was measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride staining，and apoptotic neural cells were determined by terminal-deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay. The interaction between circ0063517 and miR-31-5p was determined by luciferase analysis. The expression levels of circ0063517 and miR-31-5p in cerebral cortex were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction. Results Microarray analysis showed that circ0063517 was significantly downregulated in the cortex of mice 24 hours after MCAO/R. Compared with the pCDH-CMV group，the neurological dysfunction score of MCAO/R mice injected with circ0063517 overexpression plasmid was significantly decreased（P<0.05），and the cerebral infarction area and cortical cell apoptosis were significantly reduced（P<0.001）. Dual-luciferase reporter assay confirmed that circ0063517 targeted miR-31-5p，and the expression level of miR-31-5p in the cortex of mice injected with circ0063517 overexpression plasmid was significantly lower than that of the pCDH-CMV group after I/R（P<0.01）. Compared with the si-NC group，the neurological dysfunction score of MCAO/R mice injected with si-miR-31-5p was significantly lowered（P<0.05），and the cerebral infarction area and cortical cell apoptosis were significantly reduced（P<0.001）. Conclusion Overexpression of circ0063517 attenuates I/R-induced injury by competitive binding to miR-31-5p as ceRNA. These results are helpful to understand the role of circRNA in the development of I/R injury and provide new targets for the treatment of I/R injury.

Graphical abstract

关键词

Circ0063517 / miR-31-5p / 小鼠 / 脑缺血再灌注 / 大脑中动脉闭塞/再灌注

Key words

circ0063517 / miR-31-5p / mice / cerebral ischemia reperfusion / middle cerebral artery occlusion/reperfusion

优先出版：https://link.cnki.net/urlid/50.1046.R.20250717.0941.010

（2025-07-17）

脑缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤发生在脑组织缺血一段时间血供恢复后，并与高发病率、死亡率和致残率相关^[1]。脑I/R发展涉及基因和环境因素的结合，但是目前对其确切的发病机制尚不清楚。环状RNA（circRNA）是一种内源性非编码RNA，其通过充当microRNA（miRNA）海绵，在发育过程中发挥重要的基因表达调控功能^[2-3]。此外，由于circRNA没有明确的5'和3'末端而无法进入RNase，因此其半衰期非常稳定，通常超过48 h^[4]。最近，越来越多的证据表明，circRNA与中枢神经系统疾病有关，例如中枢神经系统肿瘤、局部缺血、卒中和神经退行性疾病^[5]。然而，I/R损伤相关circRNA的知识仍然有限。为了解I/R损伤是否会影响circRNA的表达，本研究于小鼠I/R损伤后24 h对circRNA进行了表达谱微阵列分析以预测潜在的损伤相关circRNA。结果发现脑I/R损伤后circ0063517显著下调，研究进一步对其在I/R损伤中的作用进行分析。

1 材料与方法

1.1 动物

使用体质量20~25 g的成年C57BL/6雌性（8~10周龄）小鼠。将小鼠饲养在23 ℃、12 h的明/暗周期循环的环境中，可以自由获取食物和水。研究方案经本院伦理委员会批准（批件号：20200511）。

最小样本量计算公式：n=2·(Z_1-α/2+Z_1-β)²·σ²/Δ²，其中n为每组所需样本量，Z_1-α/2为显著性水平对应的Z值（α=0.05时，Z_0.975=1.96），Z_1-β为统计效能对应的Z值（效能=0.8时，Z_0.84=0.84），σ为组内标准差（通过预实验估计为0.7），Δ为预期组间均数差异。通过PASS软件估算，各组需至少6只小鼠。

1.2 局灶性脑I/R损伤的小鼠模型建立

根据文献方法，对小鼠进行大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）诱导局灶性缺血^[6]。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）（美国Sigma-Aldrich公司）麻醉并将其头和四肢固定在37 ℃的加热板上。暴露左颈内动脉，插入尼龙缝线并前进通过颈动脉分叉，直至阻塞中动脉根部。闭塞1 h后，通过从血管中移除缝合线对小鼠进行再灌注。假手术小鼠在没有MCAO/R的情况下进行了相同的手术程序。

1.3 微阵列分析

MCAO/R后24 h，8只小鼠（MCAO/R组4只和假手术组4只）麻醉，收集损伤部位脑组织，快速保存在液氮中。使用RNAiso Plus试剂盒（日本TAKARA公司）提取总RNA。采用NanoDrop^TM 2000分光光度计（美国NanoDrop公司）和Aligent2100生物分析仪（美国Agilent Technologies公司）对提取的总RNA进行质量检测。合格的总RNA样品[RNA完整性数（RIN）≥7.0，28S/18S≥0.7]通过RNeasy mini试剂盒（德国QIAGEN公司）和RNase-Free DNase Set试剂盒（德国QIAGEN公司）进一步纯化。之后，将其扩增并用LowInput QuickAmp Labeling Kit One-Color试剂盒（美国Agilent Technologies公司）进行标记。应用SBC小鼠（4*180 K）ceRNA微阵列V1.0（上海生物芯片有限公司）筛选circRNA表达谱，该谱涵盖了37852个circRNA。根据从Circbase（9365），GENCODE v21/Ensembl（6094），Deepbase（379），Lncrnadb（12），Noncode v5（80101），UCSC/NCBI（21258）和Shbio（32216）获得的转录本的最新序列信息设计所有探针。使用DEseq/DESeq2/edgeR/DEseq软件，通过调整P<0.05和|log2（foldchange）|>1获得具有统计学意义的差异表达基因。在分子杂交炉（Agilent Technologies）中使用Gene Expression Hybridization试剂盒（Agilent Technologies）将每张玻片与1.65 μg Cy3标记的cRNA杂交。杂交17 h后，在染色皿中使用Gene Expression Wash Buffer Kit（美国Agilent Technologies公司）对载玻片进行洗涤，然后使用默认设置通过安捷伦微阵列扫描仪（美国Agilent Technologies公司）进行扫描。使用功能提取软件12.0（美国Agilent Technologies公司）提取数据。

1.4 慢病毒制备和质粒构建

表达载体的寡核苷酸序列由汉恒生物科技(上海)有限公司设计和合成。序列如下：Circ0063517过表达引物5'-CAACATAGACGTAGATCCGATG-3'（正向）和5'-ACATTCGATGGCTCGCAAGGCT-3'（反向）；和Circ-NC引物5'-TACGAGACCATGAAGGAGTTGA-3'（正向）和5'-AGCTGATGGACGAGACCATGAA-3'（反向）；miR-31-5p短干扰（si）RNA，5'-GAGTGGACTACAGCGACTTAG-3'；阴性对照（NC）siRNA，5'-AGATGAAATTGTGGCTCTAAA-3'。实验中使用了10⁹ TU/mL的慢病毒滴度；在MCAO/R诱导前48 h，通过立体定位仪向小鼠脑室内注射2.5 μL含慢病毒的上清液。

对于Circ0063517过表达载体，将纯化的PCR产物克隆到EcoRI和NotI位点之间的pCDH-CMV载体（System Biosciences）中。对于miR-31-5p敲低构建体，将siRNA寡核苷酸插入MluI和ClaI限制性酶切位点之间的pLVTHM载体（美国System Biosciences公司）中。通过DNA测序确认构建体。在MCAO/R诱导前48 h，通过立体定位仪向小鼠脑室内注射2.5 μL含500 pmoL质粒^[7]。

1.5 神经功能缺损的测量

再灌注后24 h后进行神经功能缺损的评估^[8]。缺陷的评分标准为0~5分（0分：无缺陷；1分：对侧前肢伸展困难；2分：不能伸展对侧前肢；3分：对侧轻度旋转；4分：严重盘旋；5分：对侧下降），得分越高，表明运动障碍越严重。

1.6 三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色和梗死面积测量

再灌注后24 h评估梗死面积。安乐死后，将小鼠断头并取出大脑，并立即在-20 ℃下冷冻6 min。然后将其切成2 mm的切片，在37 ℃下用2% TTC染色30 min，并在4%多聚甲醛中固定。使用高分辨率数码相机（日本SONY公司）拍摄照片。通过从完整对侧半球的面积中减去同侧半球的非梗死组织的面积确定梗死面积。

1.7 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling，TUNEL）

使用TUNEL凋亡检测试剂盒（上海Beyotime公司）评估大脑皮质中的细胞凋亡。将脑切片在二甲苯中脱蜡并用分级乙醇脱水，然后加入100 μg/mL的蛋白酶K溶液并于37 ℃的环境下孵育30 min。随后将切片与TUNEL反应混合物在37 ℃下孵育1 h，并使用二氨基联苯胺复染。在缺血区域中随机计数了5个非重叠显微视野的TUNEL阳性细胞数量。凋亡率是指单位面积中凋亡细胞与细胞总数的比率。

1.8 双荧光素酶报告分析

将含有miR-31-5p靶点的circ0063517 3'UTRs野生型或突变序列分别扩增并克隆到荧光素酶报告基因pMIR载体中。用Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）将miR-31-5p模拟物（终末浓度50 μmol/L）和构建的pMIR载体（150 μg）转染到HEK293细胞中。转染48 h后，用荧光素酶检测试剂盒（上海Beyotime公司）检测荧光素酶活性。

1.9 定量实时聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）

使用TRIzol试剂（美国Life Technologies公司）从大脑皮质组织样品中提取总RNA。使用HiScript Q Select RT SuperMix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）和茎环RT引物（广州RiboBio公司）对RNA（2 μg）进行反转录。使用Rotor-Gene 3000仪器（澳大利亚Corbett Research公司）中SYBR Green进行定量实时PCR（RT-qPCR）。将通过RT-qPCR确定的CircRNA水平标准化为18 S水平，将miR-31-5p水平标准化为U6水平。正向和反向引物序列如下：Circ0063517，5'-ATTTTAGCTGCGTTTCCCTCTGT-3'（正向）和5'-ATCACAAGAGTGTCTGTGCCG-3'（反向）； miR-31-5p，5'-ACCTCCAGCCCCAGTCATCA TTG-3'（正向）和5'-CGAAGCCCTGAGAGAAGAGGGAGT-3'（反向）；U6，5′-GGTGAGCTGTGACAACTGGAT-3′（正向）和5′-CCGCACCATGTCAATGATCTC-3′（反向）；18S，5'-CAGCGTTTGCTCTCTCGTCT-3'（正向）和5'-TCAATCAACGCCAGACACGG-3'（反向）；Circ7079，5′-ACTTTAACCCCCGCTTCAAT-3′（正向）和5′-GCCTGTCCTGGTTATTGTCC-3'（反向）；Circ27348，5′-ATTGAGCAAAGAGGCGATCACA-3'（正向）和5'-CTCAGGCTCCT CCAGATGGT-3'（反向）；和Circ4675，5′-CCTTCAACGCTCGCATCTCT-3'（正向）和5'-GCTGAGCATCCCGGTTATCTC-3'（反向）。基因相对表达水平是通过使用2^-ΔΔCT方法与内部参考进行比较来确定。

1.10 统计学方法

使用SPSS 21.0或Prism 5.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，2组之间比较采用独立样本t检验。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 微阵列数据资料

根据微阵列数据，在MCAO/R后24 h，1224个circRNA差异表达（倍数变化>2，P<0.05），包括503个上调的circRNA（38.00%）以及759个下调的circRNA（62.00%）。二维分层聚类热图描述了失调的circRNA的表达特征（图1A）。为了进一步验证微阵列数据，随机选择4个原始强度>300和>3倍变化的circRNA，并通过实时PCR进行验证。结果发现circRNA的表达趋势与微阵列数据一致（图1B、C）。研究最终选择Circ0063517作为进一步的靶点。

2.2 Circ0063517过表达减轻小鼠脑I/R诱导的损伤

通过将pCDH-CMV或circ0063517过表达质粒注射到小鼠的侧脑室中以研究脑circ0063517在体内的作用。再灌注24 h后，用RT-qPCR评估皮质circ0063517水平。与对照组小鼠相比，在sham组和MCAO/R组中注射circ0063517过表达质粒的小鼠皮质中circ0063517均显著上调（F=15.620、21.874，均P<0.001；图2A），这与MCAO/R小鼠神经功能障碍评分降低有关（F=7.362，P=0.015；图2B）。此外，与pCDH-CMV组相比，注射circ0063517过表达质粒的MCAO/R小鼠脑梗死面积[（39.0±5.2）% vs. （24.3±3.1）%]和皮质细胞凋亡[（1.0±0.6）% vs. （4.2±0.5）%]均显著减少（t=5.752、8.583，均P<0.001；图2C~F）。

2.3 miR-31-5p是circ0063517的靶标

生物信息学分析（StarBase v.2.0和circBase）揭示了circ0063517中的miR-31-5p结合位点（图3A）。为了确定circ0063517是否是miR-31-5p的直接靶标，将HEK293细胞用含有circ0063517 wt或mut和miR-31-5p模拟物或模拟物对照的荧光素酶报告载体共转染。与circ0063517 mut组相比，miR-31-5p模拟物显著降低了circ0063517 wt组的荧光素酶活性（F=14.871，P<0.05；图3B）。为了确定在大脑I/R诱导的损伤是否通过调节circ0063517表达来改变miR-31-5p功能，在I/R前48 h给小鼠注射pCDH-CMV或circ0063517过表达质粒。与假手术组相比，I/R小鼠中的miR-31-5p表达显著升高（P<0.01）。与pCDH-CMV组相比，注射circ0063517过表达质粒的小鼠在I/R后皮质miR-31-5p表达显著降低（F=31.822，P<0.01；图3C）。

2.4 miR-31-5p敲低对小鼠脑I/R诱导的损伤具有保护作用

为了检查大脑miR-31-5p在体内的作用，在I/R前48 h给小鼠注射si-miR-31-5p或si-NC。RT-qPCR分析证实，与对照组相比，在sham组和MCAO/R组小鼠中注射si-miR-31-5p可显著降低大脑中miR-31-5p水平（F=11.694、15.309，均P<0.001；图4A），这与MCAO/R小鼠神经功能障碍的评分降低有关（F=5.226，P<0.05；图4B）。此外，与si-NC组相比，注射si-miR-31-5p的MCAO/R小鼠脑梗死面积[（46.0±3.9）% vs. （22.0±3.6）%]和皮质细胞凋亡[（7.6±0.5）% vs. （3.9±0.2）%]均显著减少（t=11.440、17.250，均P<0.001；图4C~F）。

3 讨论

脑卒中是人类死亡和残疾的主要原因。目前还没有开发出保护脑组织免受卒中影响的有效疗法，并且溶栓剂常导致脑缺血再灌注损伤^[9]。越来越多的证据表明，卒中后miRNA的表达谱发生改变，并且几种miRNA在缺血性病理生理中起着重要的调节作用。CircRNA可充当miRNA海绵来逆转miRNA对靶基因表达的调控作用^[3]。CircRNA参与了许多生物学过程和病理状况，例如癌症和肺动脉高压^[10-11]。特别是，近年来的研究突出了circRNA在缺血性卒中的发病机制中作为ceRNA的作用。例如，circUCK2通过充当ceRNA来靶向miR-125b-5p/GDF11信号通路，从而在体外和体内调节缺血性神经元死亡^[12]。本研究采用微阵列分析MCAO/R后24 h小鼠皮质中差异表达circRNA，确定了circ0063517明显下调，并且其通过直接靶向miR-31-5p显著改善了I/R损伤。这些发现强调了ceRNAs→miRNAs→调节轴是治疗I/R的潜在靶标。

CircRNA是非编码转录物的一个很大的亚组，最近引起了人们的极大兴趣。Circ0063517首先被表征为人类子痫前期的敏感和特异性标记物，并且KEGG富集分析显示circ0063517参与血管内皮细胞损伤修复^[13]。最近研究发现circ0063517在脊髓损伤后大鼠中呈低表达，其可通过抑制DNA损伤导致细胞周期G1/M期转变促进NSC-34运动神经元的增殖能力^[14]。在I/R损伤的发展中，circ0063517下调的机制及其其他生物学功能在很大程度上是未知的。本研究发现，在MCAO/R组中注射circ0063517过表达质粒明显改善了小鼠神经功能障碍评分，并减轻了小鼠脑梗死面积和皮质细胞凋亡。因此，circ0063517在I/R损伤的发展中起保护作用。尽管有证据表明circRNA和miRNA之间存在调节相互作用^[15-16]，但尚不清楚这是否与脑I/R损伤有关。本研究通过生物信息学分析预测了circRNA-miRNA的相互作用，并在circ0063517中鉴定了miR-31-5p结合位点。荧光素酶报告分析证实circ0063517抑制了miR-31-5p的转录活性。本研究的发现证实了circ0063517的过表达能够部分抑制了I/R小鼠中miR-31-5p的表达，从而证实了其直接相互作用。此外，miR-31-5p敲低对小鼠脑I/R诱导的损伤具有保护作用。先前研究已证实，miR-31-5p敲低减轻蛛网膜下腔出血后的脑损伤和血脑屏障损伤^[17]。还有研究发现，miR-31-5p敲低通过调节小胶质细胞M1的激活来抑制神经炎症^[18]。这些发现强调了miR-31-5p敲低的神经保护作用。

总之，本研究提供的证据表明，大脑I/R损伤后circ0063517表达下调。Circ0063517过表达通过竞争结合miR-31-5p作为ceRNA，来减轻I /R诱导的损伤。这些结果有助于了解circRNA在I/R损伤发展中的作用，并为其治疗提供新的靶点。然而，circ0063517也可能有其他miRNA的靶向结合位点，这在本文中没有描述。因此，在将来应该探索大脑I/R损伤后circ0063517作用的更多和更进一步的机制。

参考文献

[1] 林斯革，陈　皓，蔡雪峰，等. MiR-153通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路改善脑缺血再灌注后的炎症反应及保护神经元功能的研究[J]. 免疫学杂志，2020，36（9）：737-747.

[2] Lin SG， Chen H， Cai XF，et al. miR-153 improves inflammatory response and protects neuron function after cerebral ischemia-reperfusion by regulating Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Immunol J，2020，36（9）：737-747.

[3] 袁　阳，陈怀龙，张高峰，等. 环状RNA在脑缺血性损伤中作用机制的研究进展[J]. 国际麻醉学与复苏杂志，2021，42（1）：103-107.

[4] Yuan Y， Chen HL， Zhang GF，et al. Study progress on the mechanism of circular RNAs in cerebral ischemic injury[J]. Int J Anesthesiol Resusc，2021，42（1）：103-107.

[5] 高永超，王　爽，王静，等. 环状RNA在神经系统疾病中的研究进展[J]. 中国医药导报，2020，17（29）：45-47.

[6] Gao YC， Wang S， Wang J，et al. Research progress of circular RNA in nervous system diseases[J]. China Med Her，2020，17（29）：45-47.

[7] 周　涛，高士豪，张　伟，等. 微小RNA-130a-3p靶向硫氧还蛋白结合蛋白减轻缺氧/复氧心肌微血管内皮细胞的炎性反应[J]. 中华实验外科杂志，2023，40（1）：83-86.

[8] Zhou T， Gao SH， Zhang W，et al. MicroRNA-130a-3p targeting thioredoxin-interacting protein reduces the inflammatory response of myocardial microvascular endothelial cells after hypoxia reoxygenation[J]. Chin J Exp Surg，2023，40（1）：83-86.

[9] Dergunova LV， Vinogradina MA， Filippenkov IB，et al. Circular RNAs variously participate in coronary atherogenesis[J]. Curr Issues Mol Biol，2023，45（8）：6682-6700.

[10] Franke M， Bieber M， Kraft P，et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice[J]. Brain Behav Immun，2021，92：223-233.

[11] Wu RL， Yun Q， Zhang JP，et al. Knockdown of circular RNA tousled-like kinase 1 relieves ischemic stroke in middle cerebral artery occlusion mice and oxygen-glucose deprivation and reoxygenation-induced N2a cell damage[J]. Bioengineered，2022，13（2）：3434-3449.

[12] 雷爱弟，张健莉，周　衡. HIF-1α/BNIP3信号通路在IL-4减轻小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其与自噬的关系[J]. 中国免疫学杂志，2023，39（10）：2149-2153，2159.

[13] Lei AD， Zhang JL， Zhou H. Role of HIF-1α/BNIP3 signaling pathway in IL-4 attenuating cerebral ischemia-reperfusion injury in mice and its relationship with autophagy[J]. Chin J Immunol，2023，39（10）：2149-2153，2159.

[14] Jiang WW， Long XQ， Li ZC，et al. The role of circular RNAs in ischemic stroke[J]. Neurochem Res，2023，48（9）：2607-2620.

[15] Ostolaza A， Blanco-Luquin I， Urdánoz-Casado A，et al. Circular RNA expression profile in blood according to ischemic stroke etiology[J]. Cell Biosci，2020，10：34.

[16] Wu FF， Han B， Wu SS，et al. Circular RNA TLK1 aggravates neuronal injury and neurological deficits after ischemic stroke via miR-335-3p/TIPARP[J]. J Neurosci，2019，39（37）：7369-7393.

[17] Chen WH， Wang H， Feng J，et al. Overexpression of circRNA circUCK2 Attenuates Cell Apoptosis in Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via miR-125b-5p/GDF11 Signaling[J]. Mol Ther Nucleic Acids，2020，22：673-683.

[18] Ma B， Zhao HQ， Gong LL，et al. Differentially expressed circular RNAs and the competing endogenous RNA network associated with preeclampsia[J]. Placenta，2021，103：232-241.

[19] Qin C， Liu CB， Yang DG，et al. Circular RNA expression alteration and bioinformatics analysis in rats after traumatic spinal cord injury[J]. Front Mol Neurosci，2019，11：497.

[20] Su Y， Yi YX， Li L，et al. circRNA-miRNA-mRNA network in age-related macular degeneration： From construction to identification[J]. Exp Eye Res，2021，203：108427.

[21] 袁浩桐，姜博文，李真鹏，等. 基于生物信息学构建肝细胞癌预后相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络[J]. 中国医科大学学报，2023，52（5）：413-419.

[22] Yuan HT， Jiang BW， Li ZP，et al. Construction of circRNA-miRNA-mRNA regulatory network related to liver cancer prognosis based on bioinformatics[J]. J China Med Univ，2023，52（5）：413-419.

[23] Cai L， Ge BH， Xu SB，et al. Up-regulation of circARF3 reduces blood-brain barrier damage in rat subarachnoid hemorrhage model via miR-31-5p/MyD88/NF-κB axis[J]. Aging（Albany NY），2021，13（17）：21345-21363.

[24] Zhou X， Zhang JY， Li YX，et al. Astaxanthin inhibits microglia M1 activation against inflammatory injury triggered by lipopolysaccharide through down-regulating miR-31-5p[J]. Life Sci，2021，267：118943.

基金资助

湖北省卫生和计生委员会资助项目(20210KHA054)