虫害胁迫下豇豆不同组织中实时荧光定量PCR内参基因的筛选

摘要

为筛选适用于分析虫害处理下豇豆Vigna unguiculata根、茎、叶中和在不同组织间的内参基因，取三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii为害后的豇豆根、茎和叶样品，提取其总RNA并合成cDNA，根据虫害胁迫下大豆内参基因稳定性研究选择ACT11、CYP2、ELF1A、ELF1B、G6PD、TUA3、TUB4和UBC4作为候选基因，对这8个候选内参基因进行引物设计，检测引物的特异性、单一性和扩增效率，利用引物进行实时荧光定量PCR分析，利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种常用软件筛选在豇豆根、茎和叶中表达稳定的内参基因，并分析同一内参基因在豇豆不同组织间的表达稳定性。结果表明：设计的8对候选内参基因引物均具有较高的特异性，扩增效率在104.84%～110.38%之间，扩增效果良好；3种软件因算法逻辑差异导致筛选出的豇豆最优内参基因存在明显差异，经ReFinder软件综合评价确定CYP2为虫害处理下豇豆根、茎和叶中最稳定的内参基因，TUA3为不同组织间最稳定的内参基因；此外，CYP2的表达丰度在根、茎和叶中均最高。因此，建议采用CYP2作为内参基因分析虫害处理下豇豆根、茎、叶组织中目标基因的表达量，采用TUA3作为内参基因分析豇豆不同组织间目标基因的表达量。

关键词

豇豆 / 虫害 / 内参基因 / 实时荧光定量PCR / 引物 / 特异性 / 单一性 / 扩增效率