基于重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12b技术的水稻胡麻叶斑病病原菌快速检测方法

郭凤; 刘华容; 吕世民; 李艺霖; 孙文献; 汪激扬

doi:10.13802/j.cnki.zwbhxb.2025.2025042

植物保护学报 ›› 2025, Vol. 52 ›› Issue (04) : 812 -821. DOI: 10.13802/j.cnki.zwbhxb.2025.2025042

基于重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12b技术的水稻胡麻叶斑病病原菌快速检测方法

郭凤, 刘华容, 吕世民, 李艺霖, 孙文献, 汪激扬

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摘要

为实现水稻胡麻叶斑病病原菌稻平脐蠕孢菌Bipolaris oryzae的快速检测，以稻平脐蠕孢菌基因BoAra43A的特征序列为靶标，利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）试剂盒筛选特异性引物，并根据靶基因序列设计CRISPR单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)，构建结合RPA技术与CRISPR-Cas12b系统的稻平脐蠕孢菌快速检测方法。结果显示：在40℃恒温条件下，利用筛选到的特异性引物RPA-BoAra43A-F/RPA-BoAra43A-R对稻平脐蠕孢菌基因组DNA扩增30 min后，使用基于CRISPR-Cas12b的荧光法和侧流层析试纸条法均可特异性检测到稻平脐蠕孢菌，且对其同属病原菌及水稻常见病原菌无假阳性。此外，荧光法和侧流层析试纸条法的检测极限为0.43 ng/μL基因组DNA，与传统PCR处于同一数量级。利用所建试纸条法可在1 h内完成田间水稻叶片样品的检测，具有操作简便和现场快速检测的优势。