美国白蛾自噬基因HcAtg8的鉴定及其对沉默HcV-ATPase A的响应

摘要

为明确美国白蛾Hyphantria cunea调控细胞能量代谢的V型质子ATP酶催化亚基A(V-type proton ATPase catalytic subunit A,V-ATPase A)基因HcV-ATPase A与自噬相关基因（autophagyrelated gene,Atg）HcAtg8的级联效应，采用PCR技术克隆HcAtg8基因，分析该基因的生物学信息及系统进化关系，利用原核表达系统体外表达HcAtg8，并进行Western blot检测，通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术分析美国白蛾不同龄期及不同肠道部位中HcAtg8基因的表达情况，以及沉默HcV-ATPase A后中肠自噬相关组织的病理学变化及HcAtg8基因的表达情况。结果显示：克隆得到的美国白蛾自噬基因HcAtg8编码区为354 bp，编码117个氨基酸，HcAtg8蛋白和家蚕Bombyx mori BmAtg8聚在一个分支，亲缘关系较近。构建得到p MAL-c2XHcAtg8重组表达质粒，体外原核表达得到大小为56.4 kD的HcAtg8蛋白，诱导8 h后表达量最高。美国白蛾HcAtg8基因在不同龄期和不同肠道部位均有表达，在蛹中和中肠的表达量最高。沉默HcV-ATPase A后，处理组自噬溶酶体数量为11.0个，显著高于对照组的3.5个，自噬溶酶体数量上调3.1倍，处理组脂滴数量为73.8个，显著高于对照组的12.5个，脂滴数量上调5.9倍；沉默HcVATPase A后溶酶体酸性环境改变，导致自噬小体及相关代谢产物积累；qRT-PCR结果显示自噬相关基因HcAtg8在24 h时的表达量为对照的6.1倍，在48 h时表达量最高，为对照的375.2倍；在72 h时该基因表达量降低，为对照的2.5倍，与组织切片的结果相符。表明通过沉默HcVATPase A导致了HcAtg8的高表达以及自噬小体和脂滴的积累，破坏了中肠细胞的稳态，导致细胞功能障碍或者死亡。

关键词

美国白蛾 / 自噬相关基因 / 基因克隆表达 / 沉默HcV-ATPase A / 中肠组织变化