微小RNA-302a-3p靶向溶酶体相关膜蛋白5抑制口腔鳞状细胞癌侵袭转移的研究

miR-302a-3p targeting lysosomal-associated membrane protein 5 inhibits the invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma

摘要

目的 探讨溶酶体相关膜蛋白5（LAMP5）和miR-302a-3p在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达及其对OSCC侵袭转移的影响。 方法 癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析OSCC中LAMP5的表达及其作为预后指标的灵敏度。蛋白质印迹、定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和细胞免疫染色检测LAMP5在OSCC组织及细胞中的表达。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、细胞免疫染色、迁移和侵袭实验评估LAMP5对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。微小RNA（miR）靶向预测网站预测调控LAMP5的miR并采用双荧光素酶报告实验验证。裸鼠荷瘤模型评估敲低LAMP5对OSCC生长的影响。 结果 LAMP5在OSCC组织和细胞中高表达且具有较高的诊断灵敏度。敲低LAMP5显著抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭；而过表达LAMP5则促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。LAMP5的表达受miR-302a-3p的调控。敲低LAMP5显著抑制荷瘤小鼠OSCC肿瘤的生长。 结论 LAMP5通过增加OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭促进OSCC的恶性进展，其表达受到miR-302a-3p因子的负向调控。

Abstract

Objective This study aimed to explore the expression of lysosomal-associated membrane protein 5 (LAMP5) and microRNA (miR)-302a-3p in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and their functional mechanism on the invasion and metastasis of OSCC. Methods The expression of LAMP5 in OSCC and its sensitivity as a prognostic indicator were analyzed on the basis of The Cancer Genome Atlas database. Western blot, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, and cell immunocytochemistry were used to detect the expression of LAMP5 in OSCC tissues and cells. The effect of LAMP5 on the proliferation, migration, and invasion of OSCC cells was evaluated through cell counting kit-8, immunocytochemistry, migration, and invasion assays, respectively. The miRNA targeting prediction websites were used to predict the miR that regulates LAMP5 and verify the targeted regulatory effect of miR-302a-3p on LAMP5. The effect of LAMP5 knockdown on OSCC tumor growth was evaluated in a nude mouse tumorigenesis model. Results LAMP5 was highly expressed in OSCC tissues and cells. It showed high sensitivity in the early diagnosis of OSCC. LAMP5 knockdown significantly inhibited the proliferation, migration, and invasion of OSCC cells, whereas LAMP5 overexpression increased these cell activities. The expression of LAMP5 was regulated by miR-302a-3p. In vivo, LAMP5 knockdown significantly inhibited the growth of OSCC tumor. Conclusion LAMP5 promotes the malignant progression of OSCC by enhancing the proliferation, migration, and invasion of OSCC cells. The expression of LAMP5 is negatively regulated by miR-302a-3p.

Graphical abstract

关键词

微小RNA-302a-3p / 溶酶体相关膜蛋白5 / 口腔鳞状细胞癌 / 侵袭转移

Key words

microRNA-302a-3p / lysosomal-associated membrane protein 5 / oral squamous cell carcinoma / inva-sion and metastasis

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，约占口腔癌的90%以上^[1-2]。OSCC的侵袭性强，易发生远处转移^[3]。2022年，全球约有39万新确诊OSCC病例和19万死亡病例^[4]。OSCC患者预后较差^[5]，5年生存率停滞在50%~60%^[6-7]。因此，探讨OSCC侵袭转移的分子机制具有重要的理论和临床意义。

溶酶体相关膜蛋白5（lysosomal-associated membrane protein 5，LAMP5）是一种溶酶体膜蛋白，参与调控细胞的增殖、自噬、代谢以及信号转导等过程^[8]。研究发现，LAMP5在胃癌^[9]、结直肠癌^[10]和混合谱系白血病^[11]等多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的侵袭转移和恶性进展。然而，LAMP5在OSCC中的具体作用及其上游调控机制仍未被深入探讨。微小RNA（microRNA，miR）是一类内源性非编码小RNA，通过与靶基因mRNA的3’非编码区（3’ untranslated region，3’UTR）结合，负调控基因表达^[12]。miR在多种肿瘤中发挥抑瘤的作用^[13]。miR-302a-3p在多种恶性肿瘤中调控肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭能力。在食管癌中，miR-302a-3p通过抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭起到肿瘤抑制的作用^[14]；在黑色素瘤中通过靶向甲基转移酶3抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移^[15]；此外，在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中靶向乙酰辅酶A乙酰转移酶1抑制NSCLC的进展^[16]。以上研究提示miR-302a-3p负调控肿瘤进展，然而，miR-302a-3p是否通过靶向调控LAMP5的表达抑制OSCC的进展尚有待进一步的解析。

本研究拟通过生信分析、细胞实验和动物实验，分析miR-302a-3p和LAMP5在OSCC中的表达以及miR-302a-3p对LAMP5的调控作用，探讨miR-302a-3p/LAMP5信号轴在OSCC侵袭转移中的作用机制，尝试为OSCC的诊断及靶向治疗提供新的理论依据和潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2023年7月—2024年8月西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科收治的OSCC患者31例为实验组。入选标准：1）无放化疗史；2）病理确诊为OSCC。排除标准：合并其他器官的恶性肿瘤，免疫系统、心血管系统功能异常的患者。选取同期西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科阻生牙拔除9例患者的健康牙龈为对照组。本研究通过西南医科大学附属口腔医院医学伦理审查（编号20230725001），所有纳入对象均签署知情同意书。

1.2 细胞系和主要试剂

人OSCC细胞HSC-4、CAL-27（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）；人永生化表皮细胞（Hacat，上海中乔新舟生物科技有限公司）；氨基酸和葡萄糖培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、最低必需培养基（minimum essential eagle medium，MEM）、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、LA-MP5、增殖标志物Kiel 67（marker of proliferation Kiel 67，Ki67）、miR-302a-3p引物序列合成（上海生工生物技术服务公司）；逆转录试剂盒（Thermo fisher公司，美国）；RNA提取试剂盒、miR-302a-3p逆转录、定量聚合酶链反应（quantitative real-ti-me polymerase chain reaction，qRT-PCR）逆转录、定量试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；Ki67抗体（bs-23103R，北京博奥森生物科技有限公司）；LAMP5抗体（ABIN-1385955，antibodies-online GmbH公司，德国）；β-

actin抗体（湖南艾方生物科技有限公司）；3, 3’-二氨基联苯胺（3, 3’-diaminobenzidine，DAB）试剂盒、PV9000型免疫组化染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；miR-302a-3p阴性对照（negative control，NC）、miR-302a-3p过表达模拟物（mimic）、shRNA-LAMP5和过表达RNA-LAMP5（上海和元生物技术股份有限公司）；蛋白质印迹检测相关试剂（上海碧云天生物技术股份有限公司）；Transwell小室（康宁公司，美国）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（成都傲锐赛思生物科技有限公司）。

1.3 生物信息学分析

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载并整理TCGA-ALL（泛癌）、TCGA-OSCC项目STAR的RNAseq数据并提取TPM格式的数据，舍弃没有临床信息对应的数据，经log2（1+TPM）方式进行归一化处理。分析LAMP5基因在肿瘤组织与癌旁组织中的表达差异，采用ggplot2软件制图。使用pROC包对数据进行受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，结果用ggplot2进行可视化处理。

通过miR靶向预测综合分析网站Terget Scan、miRDB及DIANA tool查询与LAMP5存在靶向关系的miR，取交集找出LAMP5的潜在调控miR，绘制韦恩图。相关性分析构建LAMP5与miR-302a-3p的表达相关性。

1.4 qRT-PCR

RNA提取试剂盒提取组织、细胞总RNA，逆转录合成cDNA，采用SYBR法检测基因表达水平。qRT-PCR扩增条件：预变性（95 ℃，2 min）；变性（95 ℃，30 s），退火（60 ℃，30 s）；延伸（65 ℃，2 min），共40个循环；最后延伸（70 ℃，5 min）。mirVana miRNA分离试剂盒提取细胞mi-RNAs。miRNAs用All-in-One miRNA qRT-PCR试剂盒进行检测。采用2^-ΔΔCT法统计各组基因及miR-302a-3p的表达差异。

1.5 蛋白质印迹

组织匀浆中加入裂解液，提取OSCC组织和正常口腔黏膜组织的总蛋白进行凝胶电泳，蛋白分离后转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，含0.1% Tween^® 20去垢剂的Tris缓冲盐水（Tris-buffered saline with 0.1% Tween^® 20 detergent，TBST）洗脱后加入LAMP5抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜。次日TBST洗脱3遍，加入相应二抗室温孵育1 h。用TBST洗脱3遍，增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒显色，胶片曝光显像。分析蛋白条带的灰度值计算目标蛋白的相对内参（β-actin）的相对表达量。

1.6 细胞免疫染色（immunocytochemistry，ICC）

细胞接种于细胞爬片，待细胞长至密度为70%~80%时，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定，一抗LAMP5（1∶100）、Ki67（1∶100）染色，羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 594二抗孵育，4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（4’, 6-diami-dino-2-phenylindole，DAPI）复染；或与羊抗兔IgG（H+L）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗孵育，DAB显色后苏木素复染细胞核。使用BX-43型直立光学显微镜或BX-53型正交荧光显微镜拍照，ImageJ软件对阳性区域进行定量分析。

1.7 细胞转染和分组

分别培养CAL-27和HSC-4细胞，对CAL-27细胞进行LAMP5的敲低处理，分为对照组（sh-control）和LAMP5敲低组（shLAMP5）；对HSC-4细胞进行LAMP5的过表达处理，分为对照组（oe-control）和LAMP5过表达组（oe-LAMP5）。将敲低或过表达的慢病毒载体分别转染至CAL-27细胞和HSC-4细胞，嘌呤霉素筛选稳定敲低LA-MP5（shLAMP5）以及稳定过表达LAMP5（oe-LAMP5）的细胞，qRT-PCR和ICC检测敲低/过表达效率。

培养CAL-27细胞，按照Lipofectamine^TM 3000转染试剂盒操作说明书操作步骤对CAL-27细胞进行转染，分为：miR-NC组（miR-NC转染细胞）、miR-302a-3p mimic组（miR-302a-3p mimic转染细胞）。

1.8 CCK-8细胞增殖实验

将细胞以5×10³个/孔接种于96孔培养板，空白组不接种细胞仅加入培养基。分别培养24、48和72 h后加入CCK-8溶液；孵育2 h后测定450 nm处的吸光度值。细胞活力=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%，其中As为实验组吸光度，Ac为对照组吸光度，Ab为空白组吸光度。

1.9 Transwell迁移和侵袭实验

将细胞以2×10⁵个/孔接种于Transwell上室并加入10%FBS的DMEM培养基，下室加入10%FBS的DMEM培养基，每组3个复孔，迁移24 h后用棉签移去上室未迁移细胞并用4%PFA固定细胞，随后进行苏木素染色，拍照进行定量分析。侵袭实验在接种细胞前对Transwell小室进行Matrigel试剂包备，侵袭时间为48 h，其余步骤与迁移实验相同。

1.10 3D细胞迁移和侵袭实验

采用非粘附U行板培养细胞，300个细胞/3D细胞，待24 h细胞长成3D细胞后转移至平板培养皿中，于0、12和24 h拍照观察3D细胞的迁移情况；3D细胞侵袭实验在将3D细胞转移至平板培养皿之前，对平板培养皿使用Matrigel试剂进行包备，拍照时间点为0、24和48 h。计算细胞迁移和侵袭的面积以评估迁移和侵袭能力。

1.11 双荧光素酶报告基因实验

构建含有miR-302a-3p结合位点的LAMP5的3’UTR野生型质粒（pGL3-LAMP5 3’UTR-WT，LAMP5-WT）和不含有miR-302a-3p结合位点的突变型质粒（pGL3-LAMP5 3’UTR-MUT，LAMP-5-MUT），将LAMP5-WT和LAMP5-MUT分别与miR-302a-3p mimic或miR-NC共转染于CAL-27细胞，37 ℃、5%CO₂培养48 h后弃培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤；加入被动裂解缓冲液（passive lysis buffer，PLB）裂解15 min；收集裂解液，测定荧光素酶活性。

1.12 肿瘤细胞成球实验

收集对数期oe-control组和oe-LAMP5组的HSC-4细胞，将细胞以1×10⁴个/孔接种于超低黏附的96孔板并培养24 h，拍照观察成球情况。

1.13 裸鼠移植瘤模型

基于慢病毒载体转染技术构建LAMP5稳定敲低的CAL-27细胞（shLAMP5-CAL-27）。分为sh-control-CAL-27组和shLAMP5-CAL-27组，分别接种5×10⁶个shcontrol-CAL-27和shLAMP5-CAL-27细胞于裸鼠右背部皮下。注射1周后开始每4 d 1次测量肿瘤的体积和裸鼠体重，肿瘤体积计算公式为（长×宽²）/2。在第31天处死裸鼠取出肿瘤并称重。苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin stai-ning，HE）和免疫组化（immunohistochemistry，IHC）分别检测2组肿瘤组织的病理特征和Ki67的表达。裸鼠均在无特定病原体的条件下饲养。动物实验获得西南医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：SWMU20249989）。

1.14 统计学分析

所有数据以3次独立实验的平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，两组间比较采用Student-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP5在OSCC中的表达及诊断灵敏度

在多数肿瘤的非配对样本中，LAMP5在肿瘤组织中的表达显著高于正常组织（图1A）。排除非配对样本信息后获取23种肿瘤配对样本，差异表达结果显示LAMP5在多种肿瘤组织中高表达（图1B）。

在OSCC非配对样本中，OSCC中LAMP5的表达水平明显高于正常组织（图1C）。同时，在OSCC配对样本的肿瘤组织同样检测到了LAMP5的表达上调（图1D）。LAMP5的AUC值为0.889，提示LAMP5在预测结局上诊断效果较好。此外，LAMP5预测肿瘤转移分险的AUC值为0.757，对预测肿瘤转移分险具有较高的准确率。

2.2 LAMP5在OSCC组织样本和OSCC细胞中的表达

LAMP5在OSCC组织中的表达明显高于正常口腔黏膜组织（图2A-C）。此外，OSCC细胞株HSC-4和CAL-27中的LAMP5的基因表达显著高于Hacat（图2D）。在蛋白水平上同样检测到HSC-4和CAL-27中的LAMP5的表达显著高于Hacat（图2E、F），与基因表达水平一致。

2.3 敲低LAMP5对OSCC细胞增殖的影响

为研究LAMP5对OSCC细胞增殖的影响，通过慢病毒载体转染构建了LAMP5稳定敲低（shLAMP5）的CAL-27细胞，并使用qRT-PCR和ICC检测了敲低效率，结果显示LAMP5的敲低效率高于80%（图3A-C）。

CCK-8结果显示，24 h时，sh-LAMP5组与shcontrol（对照组）之间的细胞增殖差异无统计学意义，而在48 h和72 h时，shLAM-P5组的细胞增殖均显著低于对照组（图3D）。shLAMP5组的Ki67的基因表达水平显著低于对照组（图3E）。shLAMP5组的Ki67的蛋白表达水平显著低于对照组（图3F、G）。

2.4 过表达LAMP5对OSCC细胞增殖的影响

qRT-PCR和ICC结果显示成功构建LAMP5过表达细胞株（图4A-C）。

CCK-8检测结果示，与oe-control（对照组）相比，oe-LAMP5组在24 h的细胞增殖差异无统计学意义，而在48 h和72 h时细胞增殖显著增加且细胞增殖呈时间依赖性趋势（图4D）。此外，oe-LAMP5组细胞的Ki67的基因表达水平（图4E）和蛋白表达水平（图4F、G）均显著高于对照组。

2.5 敲低LAMP5对OSCC细胞迁移和侵袭的影响

获得迁移和侵袭能力是肿瘤细胞向远处转移的运动基础。Transwell小室迁移实验结果显示，shLAMP5组细胞迁移率明显低于对照组（图5A、B）。Transwell小室侵袭实验结果显示，shLAMP5组发生侵袭的细胞数量明显低于对照组（图5A、C）。此外，因为3D细胞比2D单层培养系统更能有效的重现体内肿瘤生长的生物学特征，因此，笔者构建了3D细胞并评估shLAMP5对CAL-27细胞迁移和侵袭能力的影响。与2D细胞Transwell迁移和侵袭实验结果一致，shLAMP5组发生迁移（图5D、E）和侵袭（图5F、G）的细胞数量显著降低。

2.6 过表达LAMP5对OSCC细胞迁移和侵袭的影响

过表达LAMP5（oe-LAMP5组）后细胞的迁移效率显著高于对照组（图6A、B）。同时，oe-LAMP5组发生侵袭的细胞数量明显高于对照组（图6A、C）。

2.7 调控LAMP5的miRNA预测结果

miRNA靶向预测综合分析网站Terget Scan、miRDB和DIANA tool分析得出与LAMP5存在靶向关系的miRNA的韦恩图（图7A）。miR-302a-3p与LAMP5结合位点预测结果（图7B）。

2.8 LAMP5的表达受到miR-302a-3p的调控

qRT-PCR检测到CAL-27细胞中的miR-302a-3p表达水平显著低于Hacat（图8A），且miR-302a-3p的表达与LAMP5的表达水平负相关（图8B）。过表达miR-302a-3p明显降低野生型LAMP5-WT的荧光素酶活性，而对突变型LAMP5-MUT的荧光素酶活性无明显影响（图8C），说明miR-302a-3p能直接靶向作用于LAMP5。与NC mimic组相比，过表达miR-302a-3p明显降低LAMP5的基因表达水平（图8D）和蛋白表达水平（图8E、F）。

2.9 过表达LAMP5对OSCC细胞成球能力的影响

基于构建的oe-LAMP5细胞，肿瘤细胞成球实验发现，相比对照组，oe-LAMP5组的细胞成球能力更显著，具体表现为24 h后oe-LAMP5组的细胞成球数量明显增多且球体直径更大（图9）。

2.10 敲低LAMP5对裸鼠体内OSCC肿瘤生长的影响

对照组和shLAMP5组2组裸鼠的体重无明显差异（图10A）。与对照组相比，shLAMP5组的肿瘤体积和重量明显降低（图10B-E）。HE染色结果显示shLAMP5组的细胞密度降低，空泡结构丰富，出现核碎裂等细胞坏死迹象（图10F）。shLAMP5组肿瘤组织中Ki67的表达量显著低于对照组（图10G、H）。以上结果表明敲低LAMP5可抑制肿瘤的体内生长。

3 讨论

OSCC是恶性程度较高的头颈部肿瘤，可导致患者面部畸形、咀嚼困难、吞咽障碍和味觉丧失等症状，严重威胁患者生命健康^[17-18]。肿瘤转移是OSCC患者主要的死亡原因，占比超过90%^[19-20]。本研究系统性分析了miR-302a-3p/LAMP5信号轴在OSCC进展中的调控机制，并揭示了LAMP5在促进OSCC增殖、迁移和侵袭方面的关键作用。靶向miR-302a-3p/LAMP5信号轴将有望用于控制OSCC的进展和转移。

研究^[21]结果指出，LAMP5在多发性骨髓瘤中高表达并且于预后不良相关，而沉默LAMP5可通过降低P38蛋白的表达诱导细胞凋亡。Umeda等^[9]研究结果发现LAMP5在转移性胃癌组织高表达，敲低LAMP5通过增加胃癌细胞的凋亡和细胞周期停滞抑制胃癌细胞的增殖，同时敲低LAMP5可显著抑制转移性肿瘤的生长。

本研究中，LAMP5在OSCC组织中的表达较正常组织上调，qRT-PCR和ICC显示LAMP5在OSCC细胞中表达升高。敲低或过表达LAMP5后进行增殖、Transwell迁移和侵袭以及3D细胞迁移和侵袭实验，分别证实了LAMP5促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的作用。此外，在本研究的荷瘤鼠模型中，敲低LAMP5可显著抑制OSCC肿瘤的生长，本研究结果进一步验证了LAMP5在体内的促癌作用。此外，本研究细胞和动物实验结果的一致性双重验证了本课题提出的LAMP5作为OSCC促癌基因的假设。本研究结果提示LAMP5可促进肿瘤细胞的增殖，与LAMP5在其他肿瘤中促细胞增殖的研究结果一致。

miR-302a-3p已被证实参与调控多种肿瘤的恶性进展^[22-23]，且与靶基因的异常表达密切相关。miR-302a-3p在肝细胞癌中低表达，过表达miR-302a-3p可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示miR-302a-3p低表达是预测肝细胞癌患者预后不良的潜在生物标志物^[22]。在人NSCLC中，miR-302a-3p直接与铁转运蛋白的3’UTR结合以抑制其蛋白表达来诱导NSCLC发生铁死亡从而抑制NSCLC的进展^[23]。

本研究发现，LAMP5在促进OSCC进展中的作用受到miR-302a-3p的直接调控。通过miRNA靶向预测综合分析网站预测miR-302a-3p与LAM-P5存在结合位点，且双荧光素酶报告实验验证了LAMP5是miR-302a-3p的直接靶基因。过表达miR-302a-3p可显著抑制LAMP5的表达，敲低LAMP5可显著降低OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达LAMP5可显著提升OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，本研究揭示了miR-302a-3p通过抑制LAMP5的表达影响OSCC增殖、迁移和侵袭的关键作用，提示LAMP5可能是OSCC治疗的新靶点。本研究结果对学习OSCC发生发展中LAMP5的功能提供了一个新的途径，并有望为OSCC治疗提供一个新策略。然而，miR-302a-3p调控LAMP5的分子机制仍有待研究，探索LAMP5参与癌症相关信号通路的作用机理将是未来的研究重点之一。

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