假单胞菌HS-D36偏苯三酚1,2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

摘要

由pnpC编码的偏苯三酚1,2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)降解菌HSD38(Pseudomonas sp.)中克隆pnpC基因,利用E.coli BL21(DE3)高效表达重组PnpC,通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明:HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873bp,编码290个氨基酸,酶蛋白相对分子量33KD;20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可高效表达重组PnpC;重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯;纯酶比活力9.3U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8%;重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0;Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用,Ni 2+则显示抑制效应.

关键词

对硝基苯酚 / 偏苯三酚1,2-双加氧酶 / 表达纯化 / 催化特性