新型止血材料再生氧化纤维素ORC止血颗粒的理化性质及止血效果

Physicochemical properties and hemostatic efficacy of oxidized regenerated cellulose （ORC） hemostatic aggregate： a comparative study

摘要

本研究以松木浆来源的再生氧化纤维素（ORC）聚积颗粒为新型止血材料，与多糖类止血粉进行系统比较.扫描电镜显示ORC颗粒粒径为200 ~ 400 μm且呈聚积状，明显大于多糖止血粉1（10 ~ 45 μm）和多糖止血粉2（40 ~ 90 μm）的止血粉粒径.沉降实验显示ORC止血颗粒1 min内完全沉降，而两种多糖粉1 h仍悬浮于液体表面，三者溶血率均 小于 5%.体外动态凝血显示，ORC止血颗粒在1.5 min和3 min的全血凝血指数分别达92.75%和98.06%，多糖粉12 min时仍不足10%；兔肝穿孔模型中，ORC止血颗粒3 min完成止血，显著快于多糖止血粉的 大于或等于 5 min.综上，ORC止血颗粒较球状多糖粉兼具快速沉降、凝血及更高效的体内止血效果，可为临床提供一种更迅速、稳定的出血控制新材料.

Abstract

This study evaluated an innovative hemostat-oxidized regenerated cellulose （ORC） aggregate derived from pine pulp-against two polysaccharide-based powders. Scanning electron microscopy revealed that the ORC aggregate has a particle size of 200-400 μm， significantly larger than the polysaccharide-based powders （10-45 μm and 40-90 μm）. In penetration tests， the ORC aggregate reached the bottom of the blood column within 1 min， while the polysaccharide-based powders remained floating on the surface for over an hour. All tested hemostats demonstrated hemolysis rates below the 5% safety threshold. In vitro coagulation assays showed that the ORC aggregate achieved whole blood coagulation index of 92.75% at 1.5 minutes and 98.06% at 3 min. In contrast， the polysaccharide-based powders failed to reach 10% even after 12 min. In an in vivo rabbit liver-bleeding model， the ORC aggregate achieved hemostasis within 3 min， significantly faster than the polysaccharide-based powders， which required more than 5 minutes. These results indicate that the ORC aggregate offers higher penetration， faster coagulation kinetics， and superior in vivo hemostatic efficacy， demonstrating its potential as a more effective and reliable hemostatic agent for surgical applications.

Graphical abstract

关键词

ORC止血颗粒 / 新型止血材料 / 凝血效率 / 全血凝血指数 / 止血效果

Key words

ORC hemostatic aggregate / innovative hemostats / whole blood coagulation index / hemostatic efficacy

外科手术中的出血问题一直为术者及医院管理者所高度关注，术中止血不彻底可引发诸多并发症，影响患者痊愈，甚至危及患者生命^［1］.因此，及时、有效、彻底止血对加速患者术后恢复、降低术后并发症、促进医院高质量管理、提升术者手术效率均具有重大意义.近年来局部止血材料的研发和应用为这一课题提供了许多新的方法^［2］.应用可高效止血的局部止血材料可起到显著的止血效果.局部止血材料也被称为辅助性局部可吸收止血剂，包括基于氧化纤维素（oxidized cellulose，OC）^［3］、再生氧化纤维素（oxidized regenerated cellulose， ORC）^［4］、胶原蛋白、明胶^［5］、壳聚糖^［6-7］、甲壳素和多糖的产品^［8］.

本文探究的ORC止血颗粒是一种新型止血材料，为可吸收ORC材质，是由ORC细纤维聚积形成的聚积颗粒形态的止血颗粒，并保留了母体ORC织物的生化和抑菌特性^［4，9］.它可在手术中广泛弥漫性渗血的创面上有效发挥作用，并能形成稳定且牢固的血凝块.本文在探究其理化性质的基础上，将ORC止血颗粒与2种多糖类止血粉应用于体外动态凝血实验，并利用兔皮肤创伤、肝出血2种动物体内出血模型对3种不同的局部止血材料进行止血速度、出血量和血凝块稳定性观察，为新型止血材料的临床应用提供参考依据.

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与止血材料

选用6月龄雄性新西兰大白兔（上海交通大学医学院实验动物中心提供）体重（5 ± 0.25）kg笼养1 周后进行实验.

3款止血材料分别为可吸收再生氧化纤维素止血颗粒（简称ORC止血颗粒）以及2款市面常见的多糖类止血粉（简称多糖止血粉1、多糖止血粉2）.

实验仪器及设备包括：蔡司场发射扫描电子显微镜GeminiSEM 300 SEM扫描电镜（上海交通大学医学院基础医学扫描电镜分析技术平台），SpectraMax^® iD5多功能酶标仪（美国Molecular Devices），Sartorius BSA623S电子天平（德国赛多利斯），Heraeus Multifuge X1R 台式常温离心机（美国Thermo Fisher）.

1.2 扫描电镜分析

每个样品均匀的撒在样品台上，然后用Leica EM ACE200离子溅射使供试样品导电.使用ZEISS Gemini SEM300场发射扫描电镜观察止血颗粒微观结构.

1.3 生物相容性检测

1.3.1 沉降实验

精确称量样品1 g，加入含有10 mL PBS的试管中，观测止血材料的沉降情况.

1.3.2 溶血实验^［10］

4% 的红细胞悬液的制备：取1 mL兔抗凝全血，加入到10 mL PBS 中，摇匀洗涤，2 000 r·min^-1离心5 min，去上清液，重复上述步骤2次后将所得红细胞（记为质量分数100%）加入到23 mL PBS， 得质量分数为4% 的红细胞悬浮液.

实验组将止血材料用PBS配制成50、37.5、25、12.5和6.25 mg·mL^-1的悬浮液.取每个质量分数的样品500 μL，加入到1.5mL离心管中，并加入相同体积4%的红细胞悬液，37℃恒温孵育3 h，2 000 r·min^-1离心10 min，取上清液测D（545）值.同时设置阳性和阴性对照组，分别为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液和PBS.每组进行3次以上独立重复实验.计算公式为：

溶血率（%）=

［D（545）_实验组-D（545）_{阴性对照组}］/

［D（545）_阳性对照-D（545）_阴性对照］×100%.

1.4 体外动态凝血实验

1.4.1 全血凝血指数的测定方法

取直径6 cm无菌培养皿，放入生化培养箱中于37 ℃下保温5 min待用.随后取出待用的培养皿，用移液枪向培养皿内2 cm圆形中均匀滴加200 μL抗凝牛血液，并将其随机分一个空白对照组和三个实验组.实验组分别取ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2，每组均取80 mg止血颗粒或止血粉均匀地覆盖在血液上，不留未覆盖区域.立即将培养皿放置在摇床上以37 ℃、30 r·min^-1的条件充分振荡3 min后，加入10 mL ddH₂O，继续在摇床上以37 ℃、80 r·min^-1条件充分震荡洗涤1 min.用移液枪吸取4 mL液体，收集在5 mL离心管中，在离心机中以300 r·min^-1， 25 ℃离心 5 min.离心结束后，用移液枪吸取200 μL离心后的上清，使用紫外分光光度计测量样本在545 nm波长下的吸光度D（545）.其中样品对照组不加牛血，其他操作同上.计算全血凝血指数（whole blood clotting index， I_WBC）：

I_WBC（%）=｛D（545）_对照-［D（545）_样品-

D（545）_样品对照］ ｝/ D（545）_对照×100% ^［11］.

1.4.2 凝血时间测定

按全血凝血指数测定方法，实验组分别加入质量均为80 mg的ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2，将凝血反应时间分别设定在1.5、3、6、12 min，其他条件同1.4.1，比较全血凝血指数.

1.4.3 单位面积凝血用量测定

按全血凝血指数测定方法，3个实验组的ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2均分别取80 mg、100 mg和120 mg三种不同剂量，然后将止血颗粒或止血粉均匀覆在200 μL牛血液上，其他条件同1.4.1，比较全血凝血指数.

1.4.4 凝血稳定性

按全血凝血指数测定方法，取80 mg ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2，待凝血反应3 min后，加入2 mL ddH₂O，在摇床上以37 ℃条件洗涤1 min，转速分别设为30 、60 、120和220 r·min^-1，其他条件同1.4.1，观察不同转速情况下血凝块的牢固程度.

1.5 动物体内止血实验

所有试验动物均按照《实验动物管理与使用指南》中颁布的现行标准进行处理和维护.该研究的所有方面经上海交通大学医学院实验动物管理和使用委员会审查后予以批准，依据中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会指定的政策方法，按照动物管理政策DLAS-SOP-VET.13（Version 3.0）和DLAS-MP-ANIM.06执行.在试验期间对动物进行全身麻醉，试验完成后在动物深度麻醉状态下实施安乐死.

1.5.1 止血材料对新西兰大白兔背部创面的止血性能研究

取新西兰大白兔3只，雄性，每只体重约5 kg.使用1 mL注射器取速眠新0.1 ~ 0.2 mL，肌肉注射麻醉.在背侧皮肤随机切开三个长度约1 cm的创口，暴露一侧竖脊肌，使完全离断，自由出血5 s，随后分别用含量均为80 mg的 ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2均匀覆盖出血部位，不留未覆盖伤口.止血材料施用完成后开始计时，分别在3 min、5 min时观察出血部位，并用10 mL PBS冲洗创口处止血颗粒或止血粉，观察创伤处渗血情况^［12］.

1.5.2 止血材料对新西兰大白兔肝溢血模型的止血作用研究

取新西兰大白兔3只，雄性，每只体重约5 kg.检疫合格后，使用1 mL注射器取速眠新0.1 ~ 0.2 mL，肌肉注射麻醉，用手术剪和手术刀逐层开腹，暴露出肝脏，在肝左外叶、右中叶分别用直径1 cm圆孔的锐器制造机械创伤口，迅速用含量均为80 mg ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2均匀覆盖出血部位，不留未覆盖伤口.止血材料施用完成后开始计时，分别于3 min、5 min时用10 mL生理盐水对止血的部位进行冲洗，并在另一个30 s观察期内观察止血部位是否渗血^［13］.

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 23.0 软件进行分析，多组间的整体比较采用方差分析，两组间的比较采用t检验^［14］.p < 0.05 时认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 ORC止血颗粒的微观结构分析

多糖止血粉1及多糖止血粉2止血材料主要成分为多微孔多聚糖，其微观结构下的微粒的形貌呈球状^［15］.多糖止血粉1微粒呈球状，表面较为粗糙，多糖止血粉2的微粒多呈凹陷状，且多糖止血粉1止血粉的孔径远小于多糖止血粉2.而ORC止血颗粒不同于多糖止血粉1及多糖止血粉2（图1）.ORC止血颗粒是由ORC细纤维加工聚积而成接近球形的ORC聚积颗粒.每个ORC聚积颗粒均由许多个ORC细纤维组成，这些细纤维在离散点上相互连接形成连锁纤维网.从图中可以看出ORC止血颗粒都是近球形体积状，颗粒表面比较粗糙，其粒径为200 ~ 400 μm，远大于多糖止血粉1（10 ~ 45 μm）及多糖止血粉2（40 ~ 90 μm）止血材料的粒径.

2.2 ORC止血颗粒的沉降实验检测

取1 g止血材料加入含有10 mL PBS的试管中，发现ORC止血颗粒迅速沉降管底，而多糖止血粉1和多糖止血粉2悬浮于液体表面，约1 h后仍旧悬浮于液体表面，表现出较弱的吸水现象（图2）.这也说明了ORC止血颗粒快速克服液体表面张力、进入液体内部的沉降作用，具备了直达出血源头、快速形成血凝块达到止血的条件.

2.3 ORC止血颗粒的溶血率检测

不同止血材料的试验组和阴性对照组上清液未见红色浑浊溶血状态，无明显红细胞破裂.不同浓度（50.0、37.5、25.0、12.5 和 6.25 mg·mL^-1）的ORC止血颗粒溶血率分别为（1.28%、1.87%、1.28%、-0.51%、-1.16%）均小于5%，多糖止血粉1、多糖止血粉2的溶血率也均 小于 5%（图3）.判定标准：溶血程度≤5%时不会发生溶血.结果表明ORC止血颗粒、多糖止血粉1和多糖止血粉2均不会引起急性溶血，三者均具备了安全的止血作用.

2.4 ORC止血颗粒的体外止血效果

在止血起效时间测定中，与对照组多糖止血粉1和多糖止血粉2相比，ORC止血颗粒在1.5 min、3 min使牛血液全血凝血指数达92.75%、98.06%，而对照组多糖止血粉1和多糖止血粉2在12 min时，全血凝血指数仍未超过10%（表1）.说明ORC止血颗粒相较于多糖止血粉1和多糖止血粉2具有凝血效果良好并起效快.

在单位面积凝血用量测定中，发现80 mg ORC止血颗粒可以使直径9 cm培养皿内的2 mL血液凝固；同等条件下血液凝固需要多糖止血粉1和多糖止血粉2均多于160 mg（图4）.同时，在血凝块的稳定程度检测中发现在220 r·min^-1转速振摇时，ORC止血颗粒产生的血凝块仍保持稳定，紧实不散开；然而对照组多糖止血粉1和多糖止血粉2产生的血凝块在30 r·min^-1时就已经松散，即ORC止血颗粒止血完成后形成的血凝块更稳定（图5）.以上体外止血实验表明ORC止血颗粒比多糖止血粉1和多糖止血粉2具有更快速有效且血凝块更稳定的体外止血效果.

2.5 ORC止血颗粒的体内止血效果

ORC止血颗粒的体内止血效果分别利用表皮划痕凝血实验和肝脏打孔凝血实验检测，其模型分别为新西兰大白兔背部创伤和肝溢血.并通过与多糖止血粉1和多糖止血粉2的凝血效果对比止血效果.

在表皮创伤凝血的实验中，发现3种不同止血材料的止血效果不同.ORC止血颗粒作用3 min后，发现对照组多糖止血粉1和多糖止血粉2作用的创伤口有明显的渗血情况，未有效止血，而ORC止血颗粒具有有效的止血效果，已于创面形成明显棕黑色血凝块，且3次独立实验结果一致（图6）.

在肝脏打孔凝血实验中，止血材料作用5 min后发现，仅对照组多糖止血粉2作用的创伤口有明显的渗血情况，不能有效的止血，而对照组多糖止血粉1及ORC止血颗粒表现有效的止血效果；止血材料作用时间缩短到3 min后发现，对照组多糖止血粉1、多糖止血粉2作用的创伤口有明显的渗血情况，不能有效的止血，仅ORC止血颗粒表现出较佳的止血效果，已形成棕黑色血凝块，且3次独立实验结果一致（图7）.

3 讨论

外科手术术中的失控出血可能会导致休克甚至死亡^［16］.对于大面积、复杂创面的出血，需要通过止血材料、止血带等措施进行控制.理想的止血材料应该具备高效止血性、生物相容性佳、无毒性、易于使用等特征^［17］.

本研究所用的止血颗粒是从加工自松木木浆的再生氧化纤维素中提取而来，通过专有的物理工艺，将ORC细纤维加工成独特的聚积颗粒形态，但同时仍100%保持了原有ORC织物的生物相容性、抑菌性及表面能^{［9， 18-19］}.粒径分布均匀、高球形度、聚积颗粒形态的止血颗粒，相较于其他ORC材质的止血材料，与血液结合得更好，且与血液反应能形成更稳定牢固的血凝块^［9］.将止血颗粒喷洒于局部创面时，ORC止血颗粒中的ORC细纤维充当分子筛，使血液中的血小板、红细胞和纤维蛋白聚集在颗粒表面，形成一种凝胶状混合物以达到即刻止血的目的^［20］.通过扫描电镜测试可以看出，多糖类止血粉的微观结构多呈不规则凹陷的球状，而ORC止血颗粒呈近球形体积状，且颗粒表面比较粗糙.这种近球形、ORC纤维聚积形成的立体网状的微观结构能够增大与液滴分子的接触面积，提高亲水性，利于血液中的血小板、红细胞和纤维蛋白聚集在颗粒表面，具备了理想止血材料的条件^［21］.同时，从微观结构上来看，止血粉类为单一粒子，ORC止血颗粒是由细小的ORC纤维聚积形成的集合体，比止血粉粒径大5~10倍，因而ORC止血颗粒解决了止血粉容易漂浮在血液表面的问题，可快速克服血液表面张力，渗入血液内部，与创面紧密贴合，从而在出血源头更快止血.

进一步将ORC止血颗粒与多糖类止血粉进行体内外凝血效果进行对比试验后发现，ORC止血颗粒优于两款多糖类止血粉，且可形成粘附持久、稳定牢固的血凝块，明显优于对照组两款多糖类止血粉.这可能是因为多糖类止血粉的微孔形态不足以弥补其和ORC止血颗粒在化学性质和表面能方面的差异^［22］.相较于ORC止血颗粒，多糖类止血粉具有更高的内聚力及更强的自我作用倾向，从而导致其分散效果不如ORC止血颗粒，与血液的接触面积小于ORC止血颗粒，故止血效果不如ORC止血颗粒.

另外，在本研究过程中，发现ORC止血颗粒的施用装置具有高便捷性，且单次喷洒用量均匀受控，其施用便捷与灵活性在实际外科手术中可进一步缩短手术时间、提升止血效率，且具有专利腔镜导管，满足开放及腔镜手术需求，但本研究暂未将施用装置纳入研究范围.

综上所述，ORC止血颗粒与多糖类止血粉相比，与血液反应更快、结合更好，可快速克服血液表面张力，不漂浮，从出血源头止血，并产生了更坚固稳定的血凝块，整体止血性能更佳，说明新型止血材料ORC止血颗粒是一种具有优势的外科止血产品.

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基金资助

上海交通大学医学院-强生（上海）医疗器材有限公司校企合作项目(JJMC/JJMS/HCS-2012DV4)

上海交通大学新进教师启动计划项目(21X010501194)