新型WDR5抑制剂Bithionol与Regorafenib的筛选与鉴定

Screening and identification of novel WDR5 inhibitors Bithionol and Regorafenib： based on the strategy of drug repurposing

摘要

WDR5作为一种高潜力的治疗靶点，在血液瘤及实体瘤的治疗领域展现出了广阔的应用前景.迄今为止，针对WDR5开发的小分子抑制剂主要聚焦于其WIN结构域，这一独特的精氨酸结合口袋能够招募多种与癌症病理过程密切相关的分子伴侣，从而导致疾病的发生发展.老药新用策略是一种将现有治疗方法应用于新型疾病的药物研发方法，因具有降低药物风险、缩短临床评估周期、低成本和高效性等优势，成为目前研究的热点.本文采用老药新用策略对上市药物进行了大规模筛选，旨在挖掘具有新颖WDR5抑制活性的化合物.通过综合运用差示扫描荧光法（DSF）及竞争性荧光标记实验，成功筛选出两种老药（Bithionol与Regorafenib），它们靶向结合WDR5的WIN位点.进一步用分子对接技术进行验证，结果表明两种老药与WDR5之间具有较高的相互作用.综上所述，本文验证了老药新用策略的实际可行性，为后续开发新型、高效的WDR5抑制剂奠定了坚实的理论基础，并开辟了新颖的研究路径，有望为血液瘤及实体瘤的治疗带来突破性进展.

Abstract

As a high-potential therapeutic target， WDR5 has shown broad application prospects in the treatment of hematoma and solid tumor. To date， the small molecule inhibitors developed for WDR5 have focused on its WIN domain， a unique arginine-binding pocket that recruits a variety of molecular partners closely related to cancer pathological processes， leading to the occurrence and development of disease. The strategy of drug repurposing is a drug development method that applies existing treatment methods to new diseases. Due to its advantages of reducing drug risk， shortening clinical evaluation cycle， low cost and high efficiency， it has become a hot topic in current research. In this paper， drug repurposing was used to screen the marketed drugs on a large scale， aiming to find out the novel WDR5-inhibiting compounds. Two old drugs （Bithionol and Regorafenib） were successfully screened through a combination of differential scanning fluorimetry （DSF） and competitive fluorescence labeling experiments， which targeted the WIN site of WDR5 binding. Further verification by molecular docking technology showed that the two old drugs had a high interaction with WDR5. In summary， this paper verifies the practical feasibility of the drug repurposing， lays a solid theoretical foundation for the subsequent development of new and efficient WDR5 inhibitors， and opens up a novel research path， which is expected to bring breakthrough progress for the treatment of hematoma and solid tumor.

Graphical abstract

关键词

WDR5 / 抑制剂 / 筛选 / 差示荧光扫描法（DSF） / 分子对接 / 老药新用

Key words

WDR5 / inhibitor / screening / differential scanning fluorescence （DSF） / molecular docking / drug repurposing

WDR5（WD repeat domain 5）是WD40重复蛋白家族中高度保守的成员之一，具有特征性的圆桶形7叶β螺旋桨结构^［1-3］.WDR5在多蛋白复合物中扮演着核心支架的角色，广泛参与表观遗传调控与染色质动态平衡的维持^［4-5］.其独特的结构特征体现在两个关键结合位点：WBM位点（WDR5 binding motif site）和WIN位点（WDR5 interaction motif site），分别坐落于蛋白质的底部和顶部，能够精准地招募并稳定多样化的伴侣蛋白，进而组装成功能各异的蛋白质复合物，这些复合物对于调控广泛的生物过程至关重要^［6］.众多的WDR5相互作用伙伴及其在表观遗传学中的独特作用赋予了WDR5多种生物学功能，包括繁殖^［7-8］、新陈代谢^［9］、免疫与炎症反应^［10-11］，以及神经和体液调节^［12］.此外，WDR5的异常表达与疾病状态紧密关联^［13］，尤其是在肿瘤学领域，其过表达已被证实与前列腺癌^［14-15］、白血病^［16］等多种癌症的发生、发展密切相关，且常预示不良的临床预后^［17-18］.因此，鉴于其在疾病进程中的多重角色与关键调控地位，WDR5已成为科研与药物开发领域长期关注的焦点，为探索新型治疗手段提供了宝贵的契机^［19］.

从蛋白结构的角度来看，WDR5功能抑制核心策略聚焦于其独特的WIN位点，这一结构清晰、功能明确的活性位点口袋，能够精确且高效地介导与多种WDR5互作的伴侣蛋白中富含精氨酸的WIN基序相互作用^［2］.目前，WIN位点抑制剂大多通过荧光偏振技术（fluorescence polarization， FP）、等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）等方法进行筛选和鉴定.尽管这些方法可以精准地鉴定化合物与WDR5之间的结合能力，然而这些方法在筛选过程中时间和经济成本较高，并不适用大规模筛选鉴定.差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）通过测量加热过程中，蛋白质疏水部分结合的染料的荧光变化来评价蛋白质的热稳定性，是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，具有蛋白样品损耗少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白与配体之间相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等方面的研究，是识别和开发候选药物重要途径之一^［20］.分子对接技术是一种用于研究生物大分子和药物小分子之间相互作用的方法.通过预测它们之间结合模式和结合能力，对药物活性和选择性以及药物与蛋白之间相互作用进行评估，最终从药物分子数据库中发现合适的小分子作为大分子的配体，即新药研发的候选药物^［21］.例如，Zhou等^［22］通过分子对接虚拟筛选，发现并鉴定了DC-B01作为Bcl-2的一种新型小分子抑制剂，并在体内外实验中验证了其结合能力及抗肿瘤作用.

老药新用策略是指已经上市的药物在其原始用途或最初批准的适应证之外开发药物新的用途^［23］.近年来，制药公司开发疾病相关新药物带来的高昂成本和极低的成功率，使得老药新用策略越来越受到关注^［24］.与传统药物开发相比，老药新用具有降低药物风险、缩短研发及临床评估周期、低成本和高效性能等诸多优势^［25］.例如，西地那非最初用于治疗心绞痛，后被重新用于治疗勃起功能障碍^［26］.同样，米诺地尔起初用于治疗溃疡，但在早期试验中，发现该药物一定程度上可以促进血管扩张，被重新用于治疗严重的高血压^［27］.

鉴于WDR5在癌症治疗领域展现出的巨大潜力，本文通过“老药新用”策略，探索并开发针对WDR5的新型抑制剂.采用DSF高通量筛选方法对上市药物进行初步筛选，设计并进行一系列基于硝基苯并恶二唑（NBD）标记的OICR-9429^［28］（一种已知的WIN位点抑制剂）荧光分子探针P3的竞争性试验，成功筛选出两种老药（Bithionol与Regorafenib），并通过分子对接验证进一步证明该策略的可行性，展示老药重定位策略在药物发现中的巨大潜力，为后续新型抑制剂的研发开辟了全新的思路与方向.

1 试剂与仪器

1.1 试剂与材料

WDR5（33～334 aa）质粒由本实验室保存；胰异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside， IPTG）、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉和卡那霉素（德国BioFroxx）；NaCl、二甲基亚砜（dimethyl sulfone， DMSO）（国药集团化学试剂有限公司）；96孔黑色低透细胞培养板（Biosharp公司）；超滤杯（美国Millipore）；四通光比色皿（江苏伟鑫仪器有限公司）；上市老药库（https：//www.tsbiochem.com/library/approved_drug_library），初始储存浓度为10 mmol·L^-1，购买自上海陶术生物有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京庄盟生物）；荧光染料SYPRO Orange dye（美国Thermo Fisher）.

1.2 主要仪器

高速冷冻离心机（美国Beckman）；电泳仪、凝胶成像系统（北京君意东方）；小型低温离心机（德国Eppendorf）；低温高压细胞破碎仪（广州聚能纳米生物科技股份有限公司）； AKTAprime plus层析系统、Biacore 1K分子互作分析系统（上海Cytiva）；分子筛层析柱（GE Healthcare）；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche）；日立F-4700荧光分光光度计（日本Hitachi）；酶标仪（美国BioTek）.

2 实验方法

2.1 蛋白表达及纯化

将WDR5序列（33～334 aa）克隆到pET-28a载体中.转化的大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL感受态细胞在补充有50 mg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB（Luria-Bertani）培养基中过夜生长.将过夜培养物传代培养至LB培养基（2×1 L）中，并在37 ℃下生长至D（600）= 0.6~0.8，加入IPTG（终浓度为0.5 mmol·L^-1），14 ℃低温诱导16 h.将诱导后的菌液以4 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，收集菌体并将其悬浮在含有Tris-HCl（20 mmol·L^-1，pH 7.5），NaCl（500 mmol·L^-1）及50%甘油的裂解缓冲液中，滤网过滤后低温高压破碎，将破碎后产物以4 ℃、10 000 r·min^-1离心1 h.收集上清并将其加入到平衡好的镍柱中，待上清流尽，依次使用含有20 mmol·L^-1和50 mmol·L^-1咪唑的缓冲液［含Tris-HCl（20 mmol·L^-1，pH 7.5），NaCl（150 mmol·L^-1）］洗涤，然后用含有250 mmol·L^-1咪唑的缓冲液（成分同上）洗脱目的蛋白.将所得蛋白分别取样进行SDS-PAGE电泳，根据结果选取蛋白样品，利用超滤杯对所选样品进行低温离心浓缩（4 ℃，4 000~5 000 r·min^-1）至5 mL左右，选择分离效率适宜的凝胶过滤层析柱进行纯化.借助AKTA系统，采用注射上样的方式通过Superdex75分子筛分离纯化.根据蛋白相对分子量大的先流出来，蛋白相对分子量小的后流出来的原理，收集目的蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，取纯度较高的目的蛋白进行浓缩至14 mg·mL^-1备用.

2.2 差式扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）高通量筛选

反应体系参照Niesen等^［20］方法进行优化，对上市老药库2 720种药物化合物分子进行筛选，将每种药物化合物分别溶于DMSO中，且浓度都为1 mmol·L^-1.将反应缓冲液、WDR5蛋白和荧光染料（SYPRO Orange dye）在5 mL EP管内混匀，分装至96孔板内，每个检测孔内总体积为24 μL.取1 μL不同药物化合物加入到各孔中，空白对照组加入1 μL DMSO，混合均匀并使每孔总体积为25 μL.4 000 r·min^-1离心2 min去除气泡后分装至384孔板，每孔总体积为10 μL，每个检测组设两组重复.利用荧光定量PCR仪进行检测，将激发与发射波长分别设定为465 nm与580 nm，升温速率设定为3.6 ℃·min^-1，温度变化范围从20 ℃~90 ℃，每1 ℃~3 ℃测定一次荧光强度，通过分析软件可绘制出荧光强度随温度的变化曲线，从而测定出样品的T_m值.所得数据在荧光PCR仪中预处理后，使用GraphPad Prism 8.0进行分析.

2.3 荧光试验

将WDR5、分子探针P3和反应缓冲液依次加入到96孔板，反应终体系为100 μL.以DMSO作为对照实验，每孔分别加入所筛选的老药化合物，并于酶标仪读取480 nm/550 nm荧光强度.分子探针与WDR5结合会有强烈荧光，在存在抑制剂的情况下，抑制剂与分子探针竞争性结合WDR5的WIN位点，荧光强度下降.同时为了数据的可靠性，通过荧光分光光度计对所筛选的10个化合物进行荧光试验，将激发波长调至480 nm，监测500~650 nm区间荧光强度变化趋势.

2.4 表面等离子体共振（surface plasmon resonance， SPR）分析

使用Biacore 1K系统在25 °C下评价化合物与WDR5的相互作用.使用标准氨基偶联程序将高纯度的WDR5蛋白固定在CM5传感器芯片上.用含有0.5% DMSO的PBS-P⁺（20 mmol·L^-1 phosphate buffer，2.7 mmol·L^-1 KCl，137 mmol·L^-1 NaCl，0.5% Surfactant P20）作为运行缓冲液.以30 μL·min^-1的流速单独进样进行结合亲和力研究，使用运行缓冲液将老药分子连续稀释至一定浓度范围.使用Biacore Insight Evaluation 软件进行数据分析，通过动力学分析或稳态亲和力法获得亲和力值（K_d）.

2.5 分子对接

经由荧光试验成功筛选出针对WIN位点的老药化合物，并用ChemDraw构建相应的结构对接输入文件.从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载WDR5蛋白晶体结构（PDB ID： 6E23），并用Pymol进行处理.随后，利用Schrödinger分子模拟软件，将优化后的蛋白模型与筛选出的老药化合物逐一进行高精度的分子对接实验.在对接过程中计算化合物与WIN位点的结合能力，不仅考虑空间构象的匹配度，还综合评估能量稳定性、相互作用力等多种因素.

3 实验结果

3.1 化合物初筛结果

为探索最适反应缓冲液、蛋白浓度和荧光染料浓度，进行DSF预实验.最终选取ITC buffer成分为20 mmol·L^-1Tris-HCl （pH 7.5）与150 mmol·L^-1 NaCl，蛋白终浓度为0.6 mg·mL^-1和荧光染料终浓度为8×的反应体系，利用DSF对化合物库里2 720个化合物进行初步筛选（图1a）.根据DSF原理可知，蛋白与配体之间如果存在结合，与没有加入配体的蛋白相比，其荧光强度会发生改变，使T_m值发生变化（ΔT_m）.T_m值增大的为正迁移，T_m值减小的为负迁移.初筛结果显示，老药化合物正迁移与负迁移ΔT_m主要集中在0 ℃~4 ℃与-5.5 ℃~0 ℃.综合化合物的结构、官能团等方面情况，选取并购买10种老药化合物（ΔT_m ≥ 0.8 ℃）进行后续实验研究（图1b）.

3.2 老药化合物竞争性结合WIN位点情况

通过前期实验，确定反应体系中蛋白与P3的终浓度分别为5 μmol·L^-1和10 μmol·L^-1，以确保实验条件的一致性和可重复性.针对初筛得出的10种具有潜力的老药化合物，采用DMSO作为溶剂，将其溶解至适宜的浓度范围，并利用酶标仪系统地测试这些老药在终浓度为40 μmol·L^-1时对荧光强度的抑制效果.为确保数据的直观性与可比性，对实验结果进行归一化处理.结果表明，Travogyn、Bithionol、Nisoldipine和Regorafenib可以竞争结合WDR5的WIN位点，其抑制效果分别达到30%、75%、23%和68%（图2）.进一步选取抑制效果最好的两种老药（Bithionol和Regorafenib）进行不同浓度老药的竞争性荧光试验，对两种老药在550 nm处的荧光强度变化进行归一化处理并拟合其IC₅₀值（半数抑制浓度）.实验结果表明，随着药物浓度的递增，荧光强度呈现显著下降趋势（图3a~3b），表明这两种老药具有较强的荧光抑制效果，与先前的实验结论一致.通过数据整理分析，Bithionol和Regorafenib的IC₅₀分别达到了22.98 μmol·L^-1和40.51 μmol·L^-1（图3c~3d）.

3.3 Regorafenib与WDR5结合验证

通过氨基偶联程序确定WDR5的固定化水平为约15 000个共振单位（RU），对老药Regorafenib进行结合验证.实验结果表明Regorafenib的K_d值达到62.1 μmol·L^-1（图4）.

3.4 Bithionol和Regafenib与WDR5分子对接分析

应用Pymol软件对目标老药化合物进行删除水分子、加氢等预处理.以目标化合物为中心对其周围0.4 nm以内的相互作用的氨基酸残基进行可视化作图分析其相互作用力.两种老药化合物与WDR5的WIN位点结合情况如图5所示.Bithionol与Regafenib均可深入WIN位点结合口袋与WDR5结合.其中，Bithionol的一个酚羟基与Cys261的主链氨基和羧基分别形成氢键，另一个酚羟基与Ser91和Ser49的侧链形成氢键，并与Phe133、Phe263的侧链形成疏水作用（图5a）.Regafenib可与Phe263侧链苯环形成π-π堆积，并与Phe133形成疏水作用.其脲结构与亚氨基结构可与Ser49主链羧基、Ser91侧链、Asp107侧链形成氢键相互作用（图5b）.通过与已报道的WDR5抑制剂（PDB ID： 4QL1）对比分析发现^［28］，Ser91、Phe133、Phe263等氨基酸残基在药物分子与蛋白结合互作中以形成氢键、疏水作用力等形式发挥关键作用.上述结果进一步表明，所筛选出的两种老药化合物与WDR5的WIN位点具有较强的结合能力.

4 讨论

WDR5作为表观遗传调控网络中的关键蛋白，通过其独特的分子伴侣相互作用机制，直接或间接地介入癌症的起始、进展及维持过程，其重要性在多项研究中得到了充分阐述^［13］.WDR5与其他蛋白质或分子相互作用的结合位点，尤其是其WIN位点，是设计靶向WDR5的药物的关键因素之一^［5］.

分子对接结果显示2种老药（Bithionol和Regorafenib）小分子一侧的苯环可以深入到WDR5的WIN位点口袋内部，并通过其特定的分子构象与周围的氨基酸残基相互作用，紧密结合.而其他8种老药结构即使有的含有苯环，但由于其分子构象可能无法与WDR5的WIN位点很好的契合，所以导致其无法与WDR5结合.Bithionol是一种治疗蠕虫感染的二线口服药物，获得美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration，FDA）批准并已在人体中安全给药^［29］.据报道，Bithionol可对若干癌细胞有抑制作用并在几种临床前癌症模型中被证明可以抑制实体瘤的生长^［30］，证实本文中Bithionol在癌症等疾病中的潜在药用价值.Regorafenib是一种口服多激酶抑制剂，在临床上被批准用于转移性结肠癌和胃肠道间质瘤的治疗^［31］.在本文中Regorafenib或可作为其他与WDR5疾病相关的潜在药物.本文通过DSF高通量筛选以及竞争性荧光试验筛选综合分子对接技术，验证了两种药物在与WDR5相关疾病治疗的潜在价值，也为后续新型抑制剂的研发开辟了全新的思路与方向.老药新用策略在药物发现中的巨大潜力为癌症等疾病的治疗带来了新的希望与可能.然而由于体内研究的缺乏、细胞的活性与亲和力不匹配等问题，使得本文存在一定局限性，其药用性和适用性还需要进一步探索和研究.

参考文献

[1] TRIEVEL R C， SHILATIFARD A. WDR5， a complexed protein［J］. Nature Structural & Molecular Biology， 2009， 16（7）： 678-680.

[2] GUARNACCIA A D， TANSEY W P. Moonlighting with WDR5： A cellular multitasker［J/OL］. Journal of Clinical Medicine， 2018， 7（2）［2024-12-01］.

[3] SCHAPIRA M， TYERS M， TORRENT M， et al. WD40 repeat domain proteins： a novel target class ［J］. Nature Reviews Drug Discovery， 2017， 16（11）： 773-786.

[4] YU X F， LI D X， KOTTUR J， et al. Discovery of potent and selective WDR5 proteolysis targeting chimeras as potential therapeutics for pancreatic cancer［J/OL］. Journal of Medicinal Chemistry， 2023， 66（23）［2024-12-01］.

[5] SILADI A J， WANG J， FLORIAN A C， et al. WIN site inhibition disrupts a subset of WDR5 function［J/OL］. Scientific Reports， 2022， 12（1） ［2024-12-01］.

[6] TEUSCHER K B， MEYERS K M， WEI Q Q， et al. Discovery of potent orally bioavailable WD repeat domain 5 （WDR5） inhibitors using a pharmacophore-based optimization［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2022， 65（8）： 6287-6312.

[7] JIANG D H， GU X F， HE Y H. Establishment of the winter-annual growth habit via FRIGIDA-mediated histone methylation at FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis ［J］. The Plant Cell， 2009， 21（6）： 1733-1746.

[8] XU Z， GAO X X， HE Y H， et al. Synergistic effect of SRY and its direct target， WDR 5， on Sox9 expression［J/OL］. PLoS One， 2012， 7（4） ［2024-12-01］.

[9] RAVNSKJAER K， HOGAN M F， LACKEY D， et al. Glucagon regulates gluconeogenesis through KAT2B- and WDR5-mediated epigenetic effects［J］. The Journal of Clinical Investigation， 2013， 123（10）： 4318-4328.

[10] GOMEZ J A， WAPINSKI O L， YANG Y W， et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-γ locus［J］. Cell， 2013， 152（4）： 743-754.

[11] TENNANT B R， HURLEY P， DHILLON J， et al. The TrxG complex mediates cytokine induced de novo enhancer formation in islets［J/OL］. PLoS One， 2015， 10（10） ［2024-12-01］.

[12] BIBONNE A， NÉANT I， BATUT J， et al. Three calcium-sensitive genes， fus， brd3 and wdr5， are highly expressed in neural and renal territories during amphibian development［J］. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research， 2013， 1833（7）： 1665-1671.

[13] HUANG X L， ZHANG C， SHANG X C， et al. The NTE domain of PTENα/β promotes cancer progression by interacting with WDR5 via its SSSRRSS motif［J/OL］. Cell Death & Disease， 2024， 15［2024-12-01］.

[14] KIM J Y， BANERJEE T， VINCKEVICIUS A， et al. A role for WDR5 in integrating threonine 11 phosphorylation to lysine 4 methylation on histone H3 during androgen signaling and in prostate cancer［J］. Molecular Cell， 2014， 54（4）： 613-625.

[15] KIM J Y， YU J D， ABDULKADIR S A， et al. KAT8 regulates androgen signaling in prostate cancer cells［J］. Molecular Endocrinology， 2016， 30（8）： 925-936.

[16] CUI Z J， LI H B， LIANG F， et al. Effect of high WDR5 expression on the hepatocellular carcinoma prognosis［J］. Oncology Letters， 2018， 15（5）： 7864-7870.

[17] GE Z， SONG E， LI J Y， et al. Clinical significance of WDR5 high expression and its effect on tumorigenesis in adult leukemia［J］. Blood， 2015， 126（23）： 3657.

[18] GE Z， SONG E J， KAWASAWA Y I， et al. WDR5 high expression and its effect on tumorigenesis in leukemia［J］. Oncotarget， 2016， 7（25）： 37740-37754.

[19] CHEN X， XU J J， WANG X H， et al. Targeting WD repeat-containing protein 5 （WDR5）： a medicinal chemistry perspective［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2021， 64（15）： 10537-10556.

[20] NIESEN F H， BERGLUND H， VEDADI M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability［J］. Nature Protocols， 2007， 2（9）： 2212-2221.

[21] 刘景陶， 刘映雪. 分子对接在药物研发中的应用［J］. 科技创新与应用， 2018， 8（1）： 167-168.

[22] LIU J T， LIU Y X. Application of molecular docking in drug research and development［J］. Technology Innovation and Application， 2018， 8（1）： 167-168. （Ch）.

[23] ZHOU J Y， YANG R R， CHANG J， et al. Discovery and identification of a novel small molecule BCL-2 inhibitor that binds to the BH4 domain［J］. Acta Pharmacologica Sinica， 2023， 44（2）： 475-485.

[24] SIMSEK M， MEIJER B， VAN BODEGRAVEN A A， et al. Finding hidden treasures in old drugs： The challenges and importance of licensing generics［J］. Drug Discovery Today， 2018， 23（1）： 17-21.

[25] BAKER N C， EKINS S， WILLIAMS A J， et al. A bibliometric review of drug repurposing［J］. Drug Discovery Today， 2018， 23（3）： 661-672.

[26] CARLEY D W. Drug repurposing： identify， develop and commercialize new uses for existing or abandoned drugs. Part I［J］. IDrugs， 2005， 8（4）： 306-309.

[27] GHOFRANI H A， OSTERLOH I H， GRIMMINGER F. Sildenafil： from angina to erectile dysfunction to pulmonary hypertension and beyond［J］. Nature Reviews Drug Discovery， 2006，5： 689-702.

[28] WATKINS J， DARGIE H J， BUNE A， et al. Reduction of beta-blocking drugs in hypertensive patients treated with minoxidil［J/OL］. The BMJ， 1976， 1［2024-12-01］.

[29] GETLIK M， SMIL D， ZEPEDA-VELÁZQUEZ C， et al. Structure-based optimization of a small molecule antagonist of the interaction between WD repeat-containing protein 5 （WDR5） and mixed-lineage leukemia 1 （MLL1）［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2016， 59（6）： 2478-2496.

[30] BACQ Y， BESNIER J M， DUONG T H， et al. Successful treatment of acute fascioliasis with bithionol［J］. Hepatology， 1991， 14（6）： 1066-1069.

[31] AYYAGARI V N， BRARD L. Bithionol inhibits ovarian cancer cell growth in vitro - studies on mechanism（s） of action［J/OL］. BMC Cancer，2014，14（1） ［2024-12-01］.

[32] CRONA D J， KEISLER M D， WALKO C M. Regorafenib： a novel multitargeted tyrosine kinase inhibitor for colorectal cancer and gastrointestinal stromal tumors［J］. The Annals of Pharmacotherapy， 2013， 47（12）： 1685-1696.

基金资助

国家自然科学基金项目(32360926)

华中师范大学中央高校基本科研业务费项目(CCNU22JC003)

华中师范大学中央高校基本科研业务费项目(CCNU24ai006)