羟基酪醇对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤的保护作用及其机制

Protective effect of hydroxytyrosol on acetaminophen induced liver injury and its mechanism

摘要

非甾体抗炎药物对乙酰氨基酚（APAP）在临床应用中常引起肝损伤，且缺少有效的治疗方法，羟基酪醇（HT）对于防治该肝损伤具有很大潜力与前景.本研究采用APAP诱导的AML-12细胞损伤和小鼠肝损伤模型，通过检测与细胞凋亡和铁死亡密切相关的生物标志物、病理切片、Nrf2/GPX4与LKB1/AMPK通路相关靶标的变化、HT与Nrf2/GPX4通路靶标蛋白的分子模拟对接，探索羟基酪醇对APAP诱导的肝损伤的保护作用及其机制.研究结果表明，HT能明显改善APAP导致的小鼠肝损伤，其效果与阳性药水飞蓟素相当.HT可缓解氧化应激相关标志物的异常变化，抑制APAP诱导的AML-12细胞和小鼠肝脏中的细胞凋亡和铁死亡，促进小鼠肝脏和AML-12细胞中LKB1和AMPK的磷酸化，上调Nrf2，促进其下游GPX4的表达.HT通过细胞的Nrf2/GPX4信号通路调控抗氧化应激反应和铁死亡过程，在APAP诱导的肝损伤保护中发挥关键的作用.

Abstract

Acetaminophen （APAP）， a widely used non-steroidal anti-inflammatory drug frequently induces hepatotoxicity in clinical practice with limited therapeutic options. Hydroxytyrosol （HT）， a natural phenolic compound， demonstrates significant potential as a therapeutic agent for drug-induced liver injury. In this study， APAP-induced AML-12 cell injury and mouse liver injury models were used to explore the protective effect and mechanism of hydroxytyrosol on APAP-induced liver injury by detecting biomarkers closely related to apoptosis and ferroptosis， pathological sections， changes in targets related to Nrf2/GPX4 and LKB1/AMPK pathways， and molecular mimetic docking of target proteins of HT and Nrf2/GPX4 pathways. The results showed that HT could significantly attenuate APAP-induced liver injury in mice， achieving comparable efficacy to the standard hepatoprotective agent silymarin. HT was able to alleviate the abnormal changes of oxidative stress-related markers， inhibit apoptosis and ferroptosis induced by APAP in AML-12 cells and mouse liver， promote the phosphorylation of LKB1 and AMPK in mouse liver and AML-12 cells， upregulate Nrf2， and promote the expression of GPX4 downstream in mouse liver. These indicated that HT plays a key role in APAP-induced liver injury protection by regulating antioxidant stress response and ferroptosis through the cellular Nrf2/GPX4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

羟基酪醇 / 对乙酰氨基酚 / 肝损伤 / Nrf2 / 铁死亡

Key words

hydroxytyrosol / acetaminophen / liver injury / Nrf2 / ferroptosis

对乙酰氨基酚（acetaminophen， APAP）作为一种非甾体抗炎药被广泛应用.然而，其过量摄入可能导致有毒代谢物在肝脏中过度积累，最终诱发严重的肝损伤^［1］，若未能及时进行干预，肝损伤可能进一步恶化，演变为致命的肝功能衰竭^［2］.近年来，APAP诱导的肝损伤（APAP-induced liver injury， AILI）已成为临床常见情况，药物性肝损伤的一个重要原因就是过量服用APAP^［3］.目前临床治疗AILI只有一种常用药，且治疗效果并不理想^［4］.因此，寻找能改善AILI的新型天然活性物质具有重要的临床意义.

铁死亡作为一种铁依赖性的细胞死亡模式，其病理特征主要表现为脂质过氧化物的蓄积、铁离子超载及谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）的活性下降^［5］.近年来的研究发现，铁死亡在药物诱导的肝损伤中扮演着关键角色，进而指出调节铁死亡可能成为一种潜在的治疗策略^［6］.核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2），作为调节氧化应激反应的核心因子，其不仅可以激活抗氧化防御系统以清除自由基，还能够通过抑制肝细胞的凋亡及铁死亡来发挥保护作用^［7］.此外，某些天然活性成分能够通过激活Nrf2/GPX4途径，减轻急性肝损伤^［8］.这些研究成果表明，通过激活Nrf2/GPX4通路来提升细胞抗氧化能力并抑制铁死亡是治疗AILI的可行策略.

羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT）是一种主要存在于橄榄中的活性物质，具有强大的抗氧化能力，能清除ROS并抑制其在体内引起的氧化应激.先前的研究揭示HT可通过调节氧化应激，进而改善肝脏的脂质代谢^［9］.另外，HT能抑制ERK通路和调节巨噬细胞极化来抑制炎症发挥肝保护作用^［10］.然而，目前尚不清楚其是否具有调节肝脏Nrf2/GPX4信号传导抑制铁死亡来减轻AILI的能力.因此，本研究旨在评估HT对AILI的保护效果，并探讨其背后的潜在分子机制.

1 实验材料

1.1 实验动物与细胞

SPF级雄性C57BL/6J小鼠：20 ± 2 g，6~8周鼠龄，由湖北省实验动物研究中心提供，动物实验方案通过中南民族大学实验动物与生物医学伦理委员会的审查和批准（编号：2024-SCUEC-002）.

小鼠AML-12细胞株购自武汉普诺赛生物科技公司.细胞贴壁生长在DMEM高糖完全培养基中，并置于含有5% CO₂的细胞培养箱中培养.

1.2 药物与试剂

羟基酪醇由实验室自制（含量98.5%，详见下文中2.1部分）.对乙酰氨基酚、羟基酪醇标准品（含量≥98%）、水飞蓟素（上海源叶生物科技有限公司）.

胎牛血清、DMEM高糖基础培养基（武汉普诺赛生物科技公司）；蛋白Marker（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；细胞裂解液、免疫染色固定液、免疫染色通透液、PVDF膜（上海默克化工技术有限公司）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin， HE）、天狼星红（Sirius red， SR）、苏木精-丽春红-苯胺蓝（Masson）染色染色试剂盒（武汉皮诺飞生物科技有限公司）；细胞裂解液、细胞核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）.

谷丙转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、微量还原型谷胱甘肽（superoxide dismutase，GSH）检测测试盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；CCK-8试剂盒、caspase3/8/9活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；总铁含量比色试剂盒、脂质过氧化物（lipid peroxide， LPO）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）.

抗体：LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、Nrf2、LaminB、GPX4、FTL、FTH、β-actin兔单抗、及HRP Goat抗兔IgG（H+L）（武汉爱博泰克生物科技有限公司）.

1.3 主要仪器

高效液相色谱仪（LC-50F，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；电泳仪（DYY-6D，北京六一生物科技有限公司）；凝胶成像分析系统（Gel DocTM XR+，美国Bio-Rad公司）；荧光显微镜（NIKON ECLIPSE CI，日本尼康）.低温高速离心机（TG16-W，长沙湘鹰离心机有限公司）.

2 实验方法

2.1 羟基酪醇的制备与检测

本研究所用羟基酪醇为本实验室从橄榄叶中提取制备：从橄榄叶中提取橄榄苦苷，再降解为羟基酪醇，经二次柱层析纯化得到羟基酪醇.

羟基酪醇含量的HPLC检测：色谱柱：Thermo C₁₈柱（250×4.6 mm，5 μm）.柱温：25 ℃，流速：1 mL∙min^-1，检测波长：232 nm，进样量：20 μL.流动相及梯度洗脱程序见表1.液相与薄层检测结果表明，制备的羟基酪醇为高纯度的单一成分，含量为98.5%（图1）.

2.2 细胞实验

2.2.1 细胞活力检测

取对数生长期的AML-12细胞接种于96孔板中，每孔细胞密度为1×10⁵个，待细胞贴壁完全，分别加入浓度为0、15、30、60、120、240 μmol∙L^-1的HT溶液.孵育48 h后每孔中加入10 μL的CCK-8试剂，继续培养1 h，酶标仪检测其在450 nm处的吸光值，确定细胞活力.

2.2.2 HT对APAP诱导的AML-12细胞损伤的保护作用

将处于对数生长期的AML-12细胞以每孔5×10⁴个的密度接种于6孔板中，设置空白组、APAP模型组、HT低和高浓度组，每组设3个复孔，独立重复实验3次.待细胞贴壁率达80%后，给药组加入HT（15、30 μmol·L^-1）预保护培养24 h，模型组、HT组每孔加入APAP（5 mmol·L^-1）诱导24 h，进行样本制备与检测.

2.2.3 样本制备与检测方法

诱导结束后，采用4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光检测（方法见2.4），并行免疫印迹分析（方法见2.5）.另取平行样本经3 500 r∙min^-1离心5 min（4 °C）收集细胞沉淀，使用手持式匀浆器间歇匀浆3次（每次10秒，间隔30秒，冰浴），参照各试剂盒说明书检测匀浆液的蛋白浓度（BCA法）、GSH、MDA、铁离子、LPO的含量与SOD及caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性.所有数据采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析.

2.3 动物实验

2.3.1 实验分组及处理

将实验小鼠随机分为6组（n = 8），正常组、APAP模型组、低剂量、中剂量组、高剂量组、阳性药物组.适应性饲养7 d，低、中、高剂量分别按15、30、60 mg∙kg^-1每天灌胃HT一次，连续7 d；阳性药物组按100 mg∙kg^-1每天灌胃水飞蓟素一次，连续7 d；正常组、APAP模型组灌胃等体积的生理盐水，灌胃次数同实验组.最后一次给药2 h后，除正常组外其余5组小鼠腹腔注射APAP（300 mg∙kg^-1）^［11］.禁食不禁水12 h后，对麻醉状态下的小鼠，实施眼球采血，离心取血浆；取部分肝组织用福尔马林固定进行肝组织病理学检测与免疫组化检测，其余组织在-80 ℃冻存，进行后续检测.

2.3.2 肝组织病理学检测

小鼠肝脏组织固定后用乙醇脱水，脱水完毕将肝组织嵌入石蜡切成5 μm的薄片.用HE、SR、Masson染色试剂进行染色，显微镜下观察并拍照.

2.3.3 血清和肝组织生化指标检测

取各组小鼠血液1 mL，室温静置4 h后，4 ℃，3 500 r∙min^-1离心10 min，收集血清，按照试剂盒说明书检测血清中ALT、AST、SOD的活性.按照试剂盒说明书制备适宜浓度的肝组织匀浆，检测GSH、MDA、铁离子、LPO的含量与caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性.所有数据采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析.

2.3.4 免疫组化检测

2.3.2中切片，采用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）热介导进行抗原修复，经3% H₂O₂孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，5% BSA室温封闭30 min后与特异性一抗（Nrf2、GPX4、Bax、Bcl-2、FTL、FTH，按说明书稀释）4 ℃孵育过夜.PBS洗涤后，用相应二抗（1∶200）室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染核，中性树胶封片.光学显微镜下观察、拍照.

2.4 免疫荧光检测

2.2.2中固定的细胞经0.1% Triton X-100透膜10 min后，于1% BSA中封闭1 h，采用2.3.4中相同的一抗4 ℃ 孵育过夜，二抗孵育1 h，DAPI染液（1 μg·mL^-1）复染细胞核10 min，抗淬灭封片剂封固，荧光显微镜下观察、拍照.

2.5 免疫印迹

参照试剂盒说明书，提取AML-12细胞蛋白及核蛋白；肝组织总蛋白和核蛋白.采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳转膜，室温封闭20 min，随后分别使用β-actin、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、Nrf2、Lamin B和GPX4等一抗4 ℃孵育过夜，Tris-HCl-Tween20缓冲液（TBST）摇洗后采用二抗（山羊抗兔）室温孵育1 h.再次洗涤后于凝胶成像系统获取目标图像，蛋白条带使用数据处理软件进行定量分析.本研究采用Image J分析软件对蛋白质条带进行半定量分析.

2.6 分子对接

从PubChem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取HT的2D结构，经Chem3D 20.0生成3D构象.靶蛋白Nrf2晶体结构（PDB：2FLU）从UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）下载，使用Discovery Studio 2021软件去除水分子及非关键配体，补全缺失残基并质子化，设置pH 7.4 的CHARMM力场条件，采用CDOCKER模块对HT与Nrf2进行半柔性对接，生成相互作用图.

2.7 统计方法

各实验数据均以平均值±标准偏差（mean ± SD）表示.通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计显著性，p < 0.05视为有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 HT对APAP诱导的AML-12细胞损伤的保护作用

细胞形态观察显示，APAP可导致AML-12细胞形态明显异常，发生皱缩、凋亡、丧失贴壁能力，HT处理的细胞形态异常情况明显改善，且30 μmol·L^-1 HT处理组的细胞形态与空白组基本一致，对APAP导致的AML-12细胞损伤有显著的保护作用（图2a）.CCK-8检测结果表明，15~240 μmol·L^-1的HT不影响AML-12细胞的生长，无细胞毒性（图2b）.细胞活力与LDH检测结果表明，HT能明显拮抗APAP导致的细胞活力丧失，减少细胞LDH的释放（图2c~2d）.在氧化应激的调控方面，APAP处理显著降低细胞内GSH含量及SOD的活性（图2e~2f），而HT可有效逆转上述氧化应激标志物的异常变化.上述结果表明，HT通过抑制APAP诱导的细胞损伤、维持细胞内抗氧化防御系统稳态，从而发挥对AML-12细胞的保护作用.

3.2 HT对AML-12细胞中Nrf2/GPX4通路的调控作用

免疫荧光检测结果显示，HT可显著增强APAP诱导的AML-12细胞内的Nrf2及其下游靶标GPX4的荧光信号强度（图3a~3c），提示HT通过Nrf2/GPX4信号通路调控细胞的抗氧化应激反应.分子对接结果表明，HT与Nrf2蛋白的结合能为-35.295 kJ·mol^-1，表明两者具有较强亲和力（图3d~3e）.WB结果表明，HT处理可显著促进LKB1和AMPK的磷酸化，并促进Nrf2的蛋白表达及其核易位（图3f~3i）.此外，HT可显著增强GPX4的蛋白表达（图3f、3j）.上述结果表明，HT通过激活LKB1/AMPK信号轴，增强Nrf2的转录活性与核定位，进而上调GPX4表达，从而调控细胞的氧化应激反应水平，是HT对APAP诱导的AML-12细胞损伤具有保护作用的关键机制.

3.3 HT抑制APAP诱导的AML-12细胞凋亡

TUNEL荧光检测显示，在APAP诱导的AML-12细胞中TUNEL阳性细胞比例显著升高，而HT干预可有效抑制这一凋亡特征（图4a）.WB和免疫荧光结果表明，APAP能显著下调AML-12细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并上调促凋亡蛋白Bax的表达，HT可逆转上述蛋白的异常表达（图4a~4f）.此外，APAP可显著激活细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性（图4g~4i），而HT可有效抑制其活化.上述结果表明，HT通过调控凋亡相关蛋白的表达，阻断caspase的级联反应，从而抑制APAP诱导的AML-12细胞凋亡.

3.4 HT抑制APAP诱导的AML-12细胞铁死亡

免疫荧光与WB检测结果显示，APAP可显著抑制AML-12细胞中铁蛋白轻链（ferritin light chain，FTL）和重链（ferritin heavy chain，FTH）的表达，HT干预后得到显著改善（图5a~5f）.此外，APAP可显著升高细胞内丙二醛（MDA）和脂质过氧化物（LPO）含量，并导致游离铁离子异常蓄积（图5g~5i），HT可有效抑制这些铁死亡特征性指标的异常变化.上述结果表明，HT通过调控铁储存蛋白（FTL/FTH）的表达、减少游离铁释放及减少脂质过氧化物的积累，从而抑制APAP诱导的AML-12细胞铁死亡.

3.5 HT对APAP诱导小鼠肝损伤的保护作用

APAP诱导的小鼠肝组织形态由光滑红润转为粗糙暗沉（图6a），肝组织病理切片HE染色显示，肝小叶结构混乱并伴随炎症细胞的浸润；Masson和SR染色显示，胶原纤维有异常沉积（图6a）.与模型组相比，HT能显著改善肝组织的形态异常，显著降低肝指数及血清中ALT、AST的活性（图6b~6d）.在氧化应激的调控方面，HT能有效逆转抗氧化指标（GSH、SOD）的降低，并呈剂量依赖性（图6e~6f）.

3.6 HT对小鼠肝细胞中Nrf2/GPX4通路的调控作用

WB与免疫组化检测结果显示，HT可显著上调小鼠肝细胞中Nrf2及其下游GPX4的表达（图7a~7d、7g~7h），进一步的研究结果表明，HT可显著增强小鼠肝细胞中LKB1和AMPK的磷酸化水平，并促进Nrf2入核（图7d~7f）.上述结果提示，HT通过激活LKB1/AMPK信号轴，驱动Nrf2转录活性及其核易位，进而上调GPX4表达，通过抑制脂质过氧化及铁死亡发挥肝保护作用.

3.7 HT对小鼠肝细胞凋亡的抑制作用

TUNEL染色结果显示，APAP可明显导致小鼠肝细胞中DNA的断裂，HT可有效抑制这一凋亡特征（图8a）.WB和免疫组化检测结果表明，APAP可显著上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，HT处理可逆转上述蛋白的表达异常（图8a~8f）.Caspase蛋白检测结果表明，APAP可显著激活caspase-3、caspase-8、caspase-3，而HT能显著抑制其活化（图8g~8i）.上述结果表明，HT可通过调控凋亡相关蛋白（抑制Bax/Bcl-2失衡）及阻断caspase级联反应抑制APAP诱导的肝细胞凋亡.

3.8 HT对小鼠肝细胞铁死亡的抑制作用

WB与免疫组化检测结果表明，APAP可显著抑制肝组织FTL和FTH的表达（图9a~9f），导致肝内游离铁离子蓄积（图9h），HT可显著恢复FTL/FTH蛋白表达水平，降低铁离子浓度.同时，APAP模型组小鼠肝脏脂质过氧化标志物MDA和LPO水平显著升高，HT可显著抑制其异常升高（图9g~9i）.上述结果表明，HT通过调控铁代谢稳态、抑制脂质过氧化物积累，从而发挥肝保护作用.

4 讨论

羟基酪醇是一种强抗氧化的酚类物质^［12］，现有研究证实其具有抗氧化、抗炎、抗病毒以及抗动脉粥样硬化的生物活性^［13-15］，但羟基酪醇对AILI的保护作用及其机制研究较少，本研究旨在从天然活性产物中筛选抗AILI的先导化合物，提供临床候选药物.

氧化应激在AILI的发生发展中起关键作用.APAP在肝脏代谢过程中生成的活性代谢物N-乙酰对苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine， NAPQI）会与GSH结合，而过量NAPQI则会导致GSH耗竭，进而引发肝细胞氧化还原稳态失衡并最终导致肝损伤^［16］.近年来研究显示，乔松素、二氢杨梅素等天然活性成分可通过调控氧化应激通路有效缓解AILI^［17-18］.本研究中，给予HT后，AML-12细胞及肝组织中组的GSH含量、SOD活性均显著高于模型组，提示HT可能通过其卓越的抗氧化能力在缓解AILI中发挥关键作用.这一发现为天然产物治疗药物性肝损伤提供了新的实验依据.

肝细胞凋亡被认为是肝损伤的致病因素^［19］.天然产物如白藜芦醇、姜黄素等可抑制肝细胞凋亡并改善肝衰竭^［20-21］.同时，有研究显示HT能够在心肌缺血再灌注模型中降低心肌细胞的凋亡率^［22］.本研究发现，在APAP介导的AML-12细胞损伤模型中，HT可有效降低与细胞凋亡密切相关的caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白酶的活性，促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax的表达.此外，这一机制已在进一步的动物实验中得到了验证.以上研究结果表明HT能通过抑制肝细胞的凋亡，从而在AILI中发挥保护作用.

近年来，铁死亡与肝损伤之间的关系受到越来越多的关注.如在肝纤维化、肝缺血再灌注等疾病中，其病理特征表现为肝细胞铁代谢紊乱和脂质过氧化物异常累积^［23-25］.同时，铁死亡抑制剂铁他汀-1等已被证明可以在AILI中发挥肝保护作用^［6］.本研究进一步揭示，APAP可诱导AML-12细胞发生铁死亡的标志性改变：包括铁离子蓄积、铁储存蛋白（FTH/FTL）表达下调、LPO堆积及GPX4活性抑制^［26］.HT干预可剂量依赖性逆转上述病理表型，并通过动物实验证实其通过抑制铁死亡途径缓解AILI.上述结果不仅明确了铁死亡在AILI发病机制中的核心地位，更提示靶向铁死亡调控或将成为AILI治疗的新策略.

Nrf2是细胞抗氧化防御系统的核心调控因子，通过激活下游靶基因参与肝脏保护^［27］.有研究表明天然活性成分（如灵芝多糖、葛根素等）可通过激活Nrf2通路显著减轻AILI^［28-29］，而Nrf2基因敲除小鼠则表现出肝保护效应的敏感性显著降低^［30］.机制上，Nrf2直接调控铁死亡关键抑制因子GPX4的表达：在APAP的介导下，LPO累积导致GPX4耗竭并触发铁死亡，而Nrf2通过转录上调GPX4阻断该进程^［31］.同时，Nrf2激活可协同增强超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性，降低活性氧（ROS）介导的肝细胞损伤^［32］.值得注意的是，当Nrf2核转位受阻时，GPX4活性下降将削弱其对LPO的代谢能力，进一步加剧铁死亡^［33］.

AMPK作为Nrf2的上游正向调控因子，其激活可通过AMPK/Nrf2信号轴减轻氧化应激并抑制AILI^［34-35］.LKB1作为AMPK的上游正调节因子，一些天然产物通过激活LKB1来增强AMPK的活性，从而发挥对肝脏的保护作用^［36］.本研究发现HT在APAP介导的AML-12细胞模型中增加了LKB1与AMPK的磷酸化水平，此过程是HT介导的Nrf2活性增强的关键前置事件.体内实验进一步证实，HT通过激活LKB1/AMPK信号轴促进Nrf2核转位及转录活性，上调GPX4表达发挥保护作用缓解AILI.

本研究系统揭示了HT在AILI中的多靶点保护机制：在表型层面，HT通过抑制肝细胞氧化应激、凋亡及铁死亡；在分子机制层面，HT通过激活LKB1/AMPK信号轴驱动Nrf2核转位，进而上调GPX4的表达水平.这些发现提示HT具有开发为AILI新型治疗制剂的潜力.本研究的不足之处在于未能证明LKB1与GPX4的联系，后续将尝试在活体小鼠的肝细胞中敲低或者过表达LKB1，并探索这些改变对HT在AILI的保护作用中的影响.同时，本研究的预处理给药方案主要验证了药物的预防性保护作用.然而在临床场景中，APAP中毒往往在药物过量摄入后才被识别，因此治疗性干预的研究同样至关重要.当前实验设计的侧重点在于阐明药物作用的关键分子机制，这为后续开发兼具预防和治疗功能的肝保护策略提供了理论依据.

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基金资助

国家自然科学基金项目(82374144)