低相对分子质量石斛多糖双酶解工艺的优化及抗光损伤活性

Optimization of double enzymatic hydrolysis of polysaccharide from dendrobium dendrobium with low molecular weight and study on its anti-photodamage activity

摘要

石斛多糖因其相对分子质量较大黏度高限制了其在护肤领域的应用.本文采用水提醇沉结合凝胶层析制备了石斛多糖，用酶E306、E752和E896对石斛多糖进行酶解，发现酶解可降低石斛多糖黏度，且用酶E752和酶E896双酶体系水解石斛多糖的抗光损伤活性最强.利用正交试验优化双酶酶解条件，最佳酶解条件是酶E752（pH 6.0、温度40 ℃、底物浓度50 mg·mL^-1、酶浓度4.0%），酶E896（pH 5.5、温度50 ℃、底物浓度10 mg·mL^-1、酶浓度3.0%）.酶解后石斛多糖的单糖组成仍然主要为D-甘露糖和D-葡萄糖，其物质的量之比为64.0∶31.6，甘露糖由77.8%降低至64.0%，葡萄糖由22.2%升高至31.6%，相对分子量从1 680k降至277k、1k和0.4k.研究发现优化后低相对分子质量石斛多糖显著提高UVB造成的HaCaT细胞FLG蛋白表达下降和UVA引起NIH/3T3细胞的细胞活力下降，且活性优于优化前；其可逆转UVB诱导的小鼠表皮损伤，降低结痂面积，减少皮肤受损程度，降低表皮厚度，抑制UVA诱导的小鼠皮肤胶原蛋白水平的下降，改善UVA引起的皮肤光损伤；另外，其可通过抑制UVA和UVB诱导中ROS的水平，改善光损伤.本研究建立了低相对分子质量石斛多糖双酶解工艺，并评价其抗光损伤活性，为石斛多糖在美容护肤领域的应用提供了坚实的基础.

Abstract

Dendrobium polysaccharide limited its application in skin care because of its high molecular weight and high viscosity. Dendrobium polysaccharide was prepared by water extraction and alcohol precipitation combined with gel chromatography. The polysaccharide was enzymatically hydrolyzed with E306, E752 and E896. It was found that the viscosity of dendrobium polysaccharide was decreased by enzymatic hydrolysis, and the polysaccharide hydrolyzed with E752 and E896 had the strongest anti-photodamage activity. The orthogonal experiment was used to optimize the enzymatic hydrolysis conditions of the double enzymes. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows for enzyme E752: pH 6.0, temperature 40 ℃, substrate concentration 50 mg·mL^-1, and enzyme concentration 4.0%. Enzyme E896: pH 5.5, temperature 50 ℃, substrate concentration 10 mg·mL^-1, enzyme concentration 3.0%. After enzymatic hydrolysis, the monosaccharide composition of Dendrobium polysaccharides was still mainly D-mannose and D-glucose, with a molar ratio of 64.0∶31.6. Mannose decreased from 77.8% to 64.0%, glucose increased from 22.2% to 31.6%, and the molecular weight decreased from 1 680k to 277k、1k and 0.4k. The research found that the optimized low-molecular-weight dendrobium polysaccharides significantly increased the decrease in FLG protein expression in HaCaT cells caused by UVB and the decrease in cell viability of NIH/3T3 cells caused by UVA, and the activity was better than that before optimization. It can reverse the epidermal damage in mice induced by UVB, reduce the scab area, decrease the degree of skin damage, reduce the epidermal thickness, inhibit the decline of collagen level in mouse skin induced by UVA, and improve the skin photodamage caused by UVA. In addition, it can improve light damage by inhibiting the levels of ROS in the induction of UVA and UVB. In this study, the enzymatic hydrolysis process of light damage resistant low molecular weight dendrobium polysaccharide was established and its activity was evaluated, which provided a solid foundation for the application of dendrobium polysaccharide in the field of beauty and skin care.

Graphical abstract

关键词

石斛 / 多糖 / 双酶解 / 抗光损伤

Key words

Dendrobium nobile Lindl. / polysaccharides / enzymatic hydrolysis / light damage resistance

皮肤急性光损伤俗称晒伤，是最常见的皮肤损伤之一，临床表现为红肿、灼热、疼痛、皮肤脱屑等，治疗不当不仅会导致皮肤老化和美观问题，甚至会引发皮肤癌^［1］.紫外线（ultraviolet， UV）引起的皮肤细胞损伤是造成光损伤的主要因素^［2］.皮肤受到紫外线B（ultraviolet B， UVB）过量辐射后会使角质细胞受损，导致皮肤水分流失、皮肤炎症和角化异常，该过程与角质细胞中多种基质的表达紊乱相关，如丝聚蛋白（filaggrin， FLG）^［3-4］.紫外线A（ultraviolet A， UVA）照射后会产生大量的活性基团，从而进一步激活多种转录因子，这将影响到细胞的增殖、凋亡、坏死以及细胞功能性蛋白的表达^［5］.此外，UV照射会使皮肤细胞内的发色团产生光化学反应，并形成活性氧（reactive oxygen species， ROS）等自由基，这些自由基会造成脂质过氧化和DNA损伤^［6］.

石斛（Dendrobium nobile Lindl.）为兰科石斛属植物，最早记载于《神农本草经》，具有极高的药用价值^［7］.现代研究表明，石斛提取物在皮肤中具有保湿、抗氧化、抗衰老等生物活性^［8-9］.石斛多糖是石斛的重要活性物质，具有降血糖、免疫调节、抗肿瘤等生物活性^［10］.此外，石斛多糖也具有一定的护肤功效，如抗氧化、保湿及抗衰老等^［11-13］，然而其对皮肤光损伤的抑制活性未见报道.

石斛多糖的结构如单糖组成、连接方式、相对分子质量等特征复杂，正是这种复杂的结构特征限制了其在护肤上的应用，石斛多糖的亲水性和大分子结构可能影响其在皮肤的吸收作用.目前酶解是制备低相对分子质量多糖的常用手段之一，酶解可以使多糖糖苷键断裂，相对分子量降低^［14-15］.此外，酶解后的多糖可能会暴露更多的活性基团，进一步提升其生物活性^［16］.有研究表明，酶解后的菟丝子多糖相对分子量降低，可以显著提升其抗黑色素生成和抗氧化作用^［17］，云芝多糖经酶解后相对分子量变小，抗氧化和抗炎作用也得到增强^［18］.本研究建立并优化石斛多糖的酶解制备方法，评价酶解前后其抗皮肤光损伤的活性，检测酶解前后其单糖组成及相对分子质量的变化，并探究低相对分子质量石斛多糖在体内和体外抗皮肤光损伤的活性，为石斛多糖的进一步应用提供了支持.

1 材料与方法

1.1 细胞及动物

小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3、人类永生化表皮细胞系HaCaT均购自长春晶美生物有限公司.6~8周龄的BALB/c雄性小鼠购自长春晶美生物有限公司.

1.2 试剂药品

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura & Migo）茎，产地浙江省杭州市临安区.

糖苷酶E306、糖苷酶E752、糖苷酶E896均购自东恒华道生物酶有限公司、Sephalife FF（西安蓝晓科技新材料有限公司）、Sepharose 4B（上海源叶生物有限公司）、基础培养基（Gibco）、胰蛋白酶（Gibco）、青霉素-链霉素双抗（上海源叶生物有限公司）、胎牛血清（赛默飞世尔科技公司）、小牛血清（赛默飞世尔科技公司）、磷酸盐缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司）、DCF-DA探针（上海碧云天生物技术有限公司）.

1.3 仪器设备

中压制备液相工作站（瑞士步琦有限公司）；倒置显微镜（日本奥林巴斯）；CO₂细胞培养箱（赛默飞世尔科技公司）；超净工作台（中国苏州苏净集团）；紫外辐照器（上海希格玛高技术有限公司）；紫外强度检测仪（深圳市林上科技有限公司）；血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）、岛津LC-2030C Plus高效液相色谱仪（日本岛津）、流式细胞仪（BD Biosciences公司）.

1.4 石斛多糖的制备

将干燥石斛粉碎后，用蒸馏水作为提取溶剂加热回流提取，料液比1∶25（m∶V），提取时间1 h，提取温度100 ℃，提取2次.提取结束后将提取液的温度冷却至室温，并用终浓度为75%的乙醇进行醇沉处理，静置过夜.次日离心取沉淀，用75%乙醇清洗沉淀3次后加入蒸馏水复溶，并维持黏度低于300 mPa·s.将复溶后的提取物用0.22 μm的囊式过滤器过滤并澄清，然后进样于Sepharose 4B层析柱进行分离，层析柱径高比为30，流速为0.2 cm·mL^-1，流动相为水，220 nm处的指示峰即为石斛多糖.苯酚-硫酸法测定多糖的含量方法如下：称取10 mg固体多糖样品，用蒸馏水溶解，定容至100 mL配成待测液，得0.1 mg·mL^-1待测多糖样品溶液.精确称取葡萄糖10 mg，溶解定容至100 mL，得0.1 mg·mL^-1葡萄糖标准溶液.分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL母液至试管，用蒸馏水补充至1 mL，每管加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀并迅速加入5 mL浓硫酸并沸水浴加热15 min，反应结束迅速冷却至室温.于490 nm处测定吸光度（以0管为空白），绘制标准曲线.取1 mL待测液按上述步骤显色，平行3次，记录吸光度，并计算样品中多糖的浓度（mg·mL^-1），并按如下公式计算多糖含量：

\mathrm{多糖}\mathrm{含量}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{多糖}\mathrm{浓度}}{\mathrm{待测}\mathrm{样品}\mathrm{浓度}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.

1.5 低分子量石斛多糖的制备

选取目前应用广泛的E306、E752和E896三种工业酶，设计7组酶解组别：单酶组3组，分别为E306组、E752组和E896组；双酶组3组：分别为E306+E752组、E306+E896组和E752+E896组；三酶组即E306+E752+E896组.底物石斛多糖终浓度为20 mg·mL^-1，酶的浓度均为1%，pH为6.0，酶解温度为45 ℃，酶解时间为6 h，真空冷冻干燥收集即获得酶解后的石斛多糖.

1.6 石斛多糖的黏度检测

多糖的相对分子质量与黏度呈正相关，黏度可以作为相对分子质量的指示剂，用以比较相同浓度下石斛多糖的平均相对分子质量，使用数控黏度计对各组的酶解样品黏度进行检测.

1.7 细胞培养

HaCaT细胞生长在含10%的胎牛血清、100 U·mL^-1的青霉素和100 μg·mL^-1的链霉素的DMEM培养基中，NIH/3T3细胞生长在含有10%的小牛血清、100 U·mL^-1的青霉素和100 μg·mL^-1的链霉素的DMEM培养基中，两者均置于含有5%CO₂的37 ℃细胞培养箱中培养.

1.8 酶联免疫吸附试验（ELISA）

取对数生长期的HaCaT细胞，密度为每毫升6×10⁴~8×10⁴个，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h，待细胞长满底部后，加入含有相应浓度受试样品的培养基进行处理，然后用30 mJ·cm^-2的UVB辐射细胞，并将细胞置于培养箱中继续培养.24 h后，取细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书，检测各组细胞中的FLG水平.

1.9 细胞活力检测

细胞活力采用MTT法进行测定.将对数生长期的NIT/3T3细胞接种于96孔板中，接种密度为每毫升5×10⁴~6×10⁴个，每孔100 μL.培养24 h，待细胞生长至瓶底的60%时，弃去培养基，加入含有相应浓度受试样品的培养基进行处理，然后用18 J·cm^-2的UVA辐射细胞，并将细胞置于培养箱中继续培养.24 h后，弃去细胞上清液，每孔加入100 μL 5 mg·mL^-1的MTT溶液，于培养箱中孵育4 h，移除MTT溶液后每孔加入150 μL的DMSO，震荡5 min后用酶标仪测定490 nm处的吸光度，并计算细胞活力.

\mathrm{细胞}\mathrm{活力}=\frac{D{(\mathrm{490})}_{\mathrm{样品}}}{D{(\mathrm{490})}_{\mathrm{空白}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.

1.10 低相对分子质量石斛多糖制备条件的优化

利用正交试验对酶解条件进行优化，在酶解过程中，分别选取酶解温度、酶浓度、底物（石斛多糖）浓度及pH值为参数建立正交表，进行四因素四水平的正交实验，优化石斛多糖的酶解条件.各因素水平如表1和表2所示.将酶解后的各组石斛多糖进样于Sephalife FF 凝胶层析柱进行检测，根据其保留时间的变化确定其相对分子质量的降低程度，并将其作为评判检测的指标.

1.11 石斛多糖及酶解石斛多糖的单糖组成的检测

1.11.1 酸水解

称取1 mg样品，加入1 mL盐酸甲醇溶液，充N₂后于80 ℃恒温金属浴中反应16 h.将反应后样品中的盐酸甲醇用氮吹仪吹干，然后加入1 mL 2 mol·L^-1的三氟乙酸，于120 ℃反应1 h，反应结束后再将其吹干.

1.11.2 单糖衍生化

向上述干燥的单糖样品中加入500 μL 0.3 mol·L^-1的NaOH，使其完全溶解.然后加入500 μL 0.5 mol·L^-1的PMP-甲醇，PMP和NaOH迅速发生扩散并混合，吹打底部，使不溶物分散均匀.取200 μL混合液，将其放入70 ℃的水浴锅中反应30 min.在反应后的样品中加入100 μL 0.3 mol·L^-1的HCl，会产生大量沉淀，随后加入700 μL的二氯甲烷进行萃取，分离水相和有机相.将样品进一步震荡、混匀并离心，用注射器吸取下层有机相，重复两次.将剩余的水相用0.22 μm的有机滤膜过滤，随后在高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC）中进样.

1.12 石斛多糖及酶解石斛多糖的相对分子量检测

1.12.1 测定方法

用HPLC技术分别采用TSK-Gel G4000PW_XL色谱柱和TSK-Gel G3000PW_XL色谱柱对酶解前后石斛多糖相对分子质量进行检测.以0.2 mol·L^-1的NaCl为流动相进行等度洗脱，柱温为40 ℃，流速为0.6 mL·min^-1.

1.12.2 供试品溶液的制备

称取石斛多糖样品，加入0.2 mol·L^-1的NaCl溶解，配制成终浓度为2 mg·mL^-1的样品溶液，并用0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤，滤液为供试品溶液.

1.12.3 对照品溶液的制备

精密称取普鲁兰多糖标准品，加入0.2 mol·L^-1的NaCl溶解，配制成终浓度为1 mg·mL^-1的溶液，并用0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤，滤液对照品溶液.

1.13 光损伤小鼠皮肤模型的制备

将48只6~8周龄的BALB/c雄性小鼠饲养在温度（20±2）℃、相对湿度（60±5）%的环境中，每天正常给予水和食物.造模前，将小鼠背部的毛发剔除.将所有小鼠随机分为8组，每组6只.其中UVB光损伤修复实验分为：空白组，不做任何处理；UVB损伤模型组，仅UVB照射；低剂量药物组，低分子量石斛多糖（10 mg·mL^-1）+UVB；高剂量药物组，低相对分子质量石斛多糖（50 mg·mL^-1）+UVB.照射前，在小鼠背部皮肤均匀涂抹不同浓度的石斛多糖，然后将小鼠放置于UVB紫外灯下进行照射，UVB照射剂量为150 mJ·cm^-2，每24 h一次，连续照射4 d.UVA光损伤修复试验分为：空白组，不做任何处理；UVA损伤模型组，仅UVA照射；低剂量药物组，低相对分子质量石斛多糖（10 mg·mL^-1）+UVA；高剂量药物组，低相对分子质量石斛多糖（50 mg·mL^-1）+UVA.照射前，在小鼠背部皮肤均匀涂抹不同浓度的石斛多糖，然后将小鼠放置于UVA紫外灯下进行照射，UVA照射剂量为200 J·cm^-2，每24 h一次，连续照射4 d.每天照射结束后观测小鼠背部红斑及皮肤受损程度.实验结束后，对小鼠实施安乐死，并收集背部皮肤样本进行进一步研究.所有动物实验均遵循长春中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2022472），并严格遵守国际实验动物护理评估认证协会指南.

1.14 苏木精-伊红染色（HE染色）

将小鼠皮肤石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，水洗，获得小鼠皮肤组织切片.完成后将切片置于苏木精染色液中5 min，取出后经两次水洗放置于伊红染色液30 s.结束后在多功能成像工作站成像.

1.15 马松染色（Masson染色）

将小鼠皮肤石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，水洗，获得小鼠皮肤组织切片.用Masson蓝化液返蓝，水洗后用丽春红染色5 min，之后使用磷钼酸溶液清洗2 min，醋酸溶液清洗1 min.然后将切片放置于苯胺蓝染色液中染色1 min，再次用醋酸清洗1 min.用95%乙醇迅速脱水后使用二甲苯透明化切片3次，最后用中性树脂封片并在多功能成像工作站成像.

1.16 流式细胞术检测ROS

取对数生长期的HaCaT和NIH/3T3细胞，密度分别为每毫升6×10⁴~8×10⁴个和5×10⁴~6×10⁴个，接种于12孔板中，培养24 h后，分别30 mJ·cm^-2的UVB和18 J·cm^-2的UVA辐射相应的细胞，并用不同浓度的石斛多糖处理细胞，孵育3 h后，收集细胞，并用预冷的PBS清洗细胞3次.然后将细胞与DCF-DA活性氧探针在37 ℃避光孵育30 min.随后离心并用PBS清洗细胞，利用流式细胞仪进行检测并分析.

1.17 统计分析

利用SPSS Statistics 20对正交试验的数据进行分析，利用GraphPad Prism 9.5对所有数据进行统计分析，所有数据均以平均数±标准差表示，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析对数据进行统计分析.p<0.05被认为具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 石斛多糖的制备

石斛经加热回流提取，获得石斛水提物，利用乙醇进行醇沉处理，收集沉淀部分，获得石斛粗多糖.沉淀进一步用75%的乙醇进行多次清洗，清洗后的沉淀用蒸馏水复溶，并经Sepharose 4B凝胶层析柱进行分离得到石斛多糖，如图1所示，峰1多糖含量93.7%，220 nm未检测到明显的吸收峰，表明其几乎不含蛋白质、核酸等紫外吸收杂质，符合高纯度多糖特征；峰2多糖含量为63.5%，在220 nm波长扫描出现微弱峰，推测可能含有少量结合蛋白质或者酚类；峰3多糖含量为37.6%，紫外吸收显著，提示存在较多蛋白质或小分子杂质.基于上述结果选择峰1样品，作为石斛多糖（简称SH）用于后续研究.

2.2 石斛多糖水解酶的筛选及低分子量石斛多糖的制备

本研究采用酶解法处理石斛多糖，筛选最适合的工具酶类型，在降低其相对分子质量的基础上提高石斛多糖的抗光损伤活性.如表3所示，与未经酶解的石斛多糖相比，无论是经过单酶水解还是多酶水解，石斛多糖的黏度均有所下降，且多酶水解的黏度较单酶水解的黏度低，说明酶解后石斛多糖的分子量较酶解前有所降低.进一步利用细胞模型评价各组石斛多糖的抗光损伤活性.如图2所示，与UVB损伤模型相比，酶解前后的石斛多糖均可提高UVB诱导的HaCaT细胞中FLG的水平，其中经酶E752和酶E896双酶水解获得的石斛多糖LMSH1活性最优，明显强于酶解前的石斛多糖SH，其他酶解组与SH相比无显著差异；与UVA损伤模型组相比，酶解前后的石斛多糖均可提高UVA诱导的NIH/3T3细胞的活力，其中LMSH1促进UVA损伤细胞的增殖活性最优，其余酶解组与SH组无显著差异.根据以上结果，最终确定采用酶E752和酶E896的双酶水解体系对石斛多糖进行酶解.

2.3 低分子量石斛多糖酶解制备条件的优化

2.3.1 正交实验评价标准的选择

图3为酶解前后石斛多糖的凝胶色谱图，由图可知，酶解前石斛多糖的保留时间在75 min左右，而酶解后石斛多糖的保留时间明显增加，在100 min左右.这是因为酶解后石斛多糖的相对分子质量变小，在凝胶层析中的迁移率变缓，保留时间增加.因此，选择保留时间作为正交实验的评价标准.

2.3.2 酶E752正交条件的优化

首先对酶E752进行正交试验，根据正交试验表对每组进行检测，其结果如表4所示，并对数据进行单因素方差分析，其结果如表5所示.根据表5的结果可知，在利用酶E752对石斛多糖进行水解的过程中，4种因素对保留时间的影响从大到小依次为：酶解pH值、酶解底物浓度、酶E752浓度、酶解温度，其中酶解pH值和酶解温度具有显著性.酶E752酶解的最佳条件为：酶解pH值为6.0、酶解温度为40 ℃、酶解底物浓度为50 mg·mL^-1、酶E752浓度为4.0%.

2.3.3 酶E896正交条件的优化

在确定了酶E752的最佳优化条件后，选择该条件的试验组进一步对酶E896进行正交条件优化，其结果如表6~表7所示.在利用酶E896石斛多糖进行二次酶解的过程中，4种因素对保留时间的影响从大到小依次为：酶解pH、酶解温度、酶解底物浓度、酶E896浓度，其中酶解pH具有显著性.酶E896酶解的最佳条件为：酶解pH为5.5、酶解温度为50 ℃、酶解底物浓度为10 mg·mL^-1、酶E896浓度为3.0%.

2.4 酶解前后石斛多糖单糖组成的分析

本研究进一步对酶解前后石斛多糖的单糖组成进行了检测.如图4和表8所示，酶解前的石斛多糖主要含有D-甘露糖和D-葡萄糖，其物质的量之比为77.8∶22.2；酶解后的石斛多糖LMSH2的单糖组成仍主要为D-甘露糖和D-葡萄糖，其摩尔比为64.0∶31.6，甘露糖的比例由酶解前的77.8%降低至64.0%，葡萄糖的比例由酶解前的22.2%升高至31.6%，但有少量的岩藻糖，可能是加入酶制剂而外源引入的.以上结果表明石斛多糖经酶解后，其单糖的比例发生了改变.

2.5 酶解前后石斛多糖相对分子量的检测

本研究进一步对酶解前后石斛多糖的相对分子量进行检测，如图5所示，酶解前石斛多糖的相对分子量为1 680k，而酶解后石斛多糖LMSH2的相对相对分子质量降到了277k、1k及0.4k.结果表明，酶解后石斛多糖的相对分子量较酶解前有明显降低.

2.6 低相对分子质量石斛多糖抗紫外损伤的活性评价

采用上述优化后的双酶水解条件制备低相对分子质量石斛多糖LMSH2，进一步比较了酶解条件优化前后石斛多糖的抗光损伤活性变化.如图6所示，与空白组相比，UVB照射后，HaCaT细胞的FLG水平下降至35.26±11.26%，而与UVB组相比，LMSH1和LMSSH2均可显著提高HaCaT细胞的FLG水平，其FLG的水平分别为54.21±4.58%和68.49±6.49%，LMSH2的FLG水平较LMSH1显著升高.在NIH/3T3细胞活力的评价中也得到相似的结果，与空白组相比，UVA照射可显著降低NIH/3T3细胞的细胞活力，其细胞活力下降至41.41±3.37%，而LMSH1和LMSH2可将UVA诱导的NIH/3T3细胞的细胞活力提高至59.22±4.68%和74.82±7.11%，且LMSH2的细胞活力较LMSH1显著提高.以上结果说明，酶解条件优化后进一步提高低相对分子质量石斛多糖的抗光损伤活性.

2.7 低相对分子质量石斛多糖对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的影响

为进一步评价低相对分子质量石斛多糖对UVB诱导的体内皮肤光损伤的影响，本研究建立了小鼠背部光损伤模型.如图7所示，小鼠背部经UVB照射后，表现为局部皮肤粗糙，并伴有表皮损伤，结痂.这是由于小鼠皮肤屏障受损，水分丢失，角化异常，且UVB照射后引发局部炎症病变.而LMSH2可逆转UVB诱导的小鼠表皮损伤，降低结痂面积，减少皮肤受损程度.为进一步探究小鼠背部皮肤的病理变化，对各组小鼠的皮肤组织进行HE染色.与空白组相比，UVB照射后小鼠皮肤组织的角质层呈现明显的松散增厚，而与UVB组相比，LMSH2可抑制UVB诱导的表皮增厚.以上结果表明低相对分子质量石斛多糖能有效抑制UVB诱导的小鼠皮肤损伤，并降低表皮厚度，保护皮肤屏障.

2.8 低相对分子质量石斛多糖对UVA诱导的小鼠皮肤胶原蛋白的影响

为探究低相对分子质量石斛多糖对UVA诱导的小鼠皮肤光损伤的影响，本研究采用Masson染色检测了低相对分子质量石斛多糖对UVA诱导的小鼠皮肤胶原蛋白的影响.如图8所示，正常皮肤组织的胶原纤维（蓝色表示）紧密而丰富，经UVA照射后，可明显观察到皮肤真皮层中的胶原纤维分散且片段化严重，这一现象会导致真皮层失去原有的刚性结构和支撑作用，这也是真皮皮肤屏障受损的主要原因.与UVA组相比，低剂量的LMSH2可降低真皮胶原蛋白的片段化程度，而高剂量LMSH2组的胶原纤维基本恢复规则排布.这表明酶解石斛多糖可有效抑制UVA诱导的小鼠皮肤胶原蛋白水平的下降，改善UVA引起的皮肤光损伤.

2.9 低相对分子质量石斛多糖对UVB和UVA诱导的细胞ROS的影响

为了进一步探究低相对分子质量石斛多糖抗光损伤的具体机制，本研究进一步检测了低相对分子质量石斛多糖对UVB诱导的HaCaT细胞和UVA诱导的NIH/3T3细胞ROS的影响.如图9a所示，与空白组相比，HaCaT细胞经UVB照射后，细胞内ROS水平显著上升至157.67±9.07%，而经LMSH2处理后，ROS水平呈剂量依赖性下降，100 μg·mL^-1和200 μg·mL^-1 LMSH2分别使细胞内ROS水平降至135.67±4.04%和125.33±7.23%.LMSH2对UVA诱导的NIH/3T3细胞中ROS水平也产生相似的影响.如图9b所示，与空白组相比，UVA照射使NIH/3T3细胞内的ROS水平上升至174.67±15.04%，而经不同浓度的LMSH2处理后ROS水平显著下降，加入100 μg·mL^-1和200 μg·mL^-1 LMSH2，细胞内ROS水平分别降至148.33±8.14和131.67±10.69.以上结果表明，低分子量石斛多糖可通过降低UVB和UVA诱导的细胞ROS水平，防止DNA损伤，从而发挥抗光损伤的作用.

3 讨论

皮肤光损伤主要是由紫外辐射而引起的一系列皮肤反应和疾病，其中UVA和UVB起重要作用^［19］.多糖是治疗皮肤光损伤的主要成分，研究表明，姬松茸多糖通过下调JAK-STAT信号通路改善UVB引起的皮肤光损伤^［20］；黄芪多糖通过减少UVA诱导的细胞内ROS的产生和线粒体膜电位，从而保护细胞免受UVA诱导的光损伤^［21］.

石斛多糖是石斛的主要功效成分之一^［22］，醇沉是目前获取植物多糖最便捷的方法^［23］，本研究采用水提醇沉和凝胶层析的方法分离出石斛多糖.由于石斛多糖的相对分子质量较大，使其在对皮肤用药过程中无法到达有效部位.针对上述问题，目前常用皮肤植入剂、脂质包埋及酶解的方法解决药物递送的问题^［24-26］.前两者主要通过非极性分子或者两性分子携带药物穿过表皮的疏水区域到达有效部位^［27］，后者则是在不改变多糖活性的前提下，通过降低相对分子质量，增加其在皮肤中的渗透作用^［28］.本研究选择酶解的方法，通过选择三种常用的工业酶对石斛多糖进行水解，并对酶解前后的石斛多糖进行黏度检测，发现酶解后石斛多糖的黏度较酶解前的低.

HaCaT细胞具有人正常角质形成细胞的形状，通常用于评估化妆品、药物和食品的皮肤保护作用^［29］.此外，NIH/3T3细胞具有较高的增殖和分化能力，通常用于评估药物对细胞生长、分化和凋亡的影响^［30］.紫外线在自然界普遍存在，适当的紫外照射对皮肤有益，然而过度接触紫外线可导致皮肤屏障受损，引起一系列皮肤炎症^［31］.UVB能够穿透表皮，但是其不能穿透更深的真皮层，因此其所造成的损伤仅限于角质形成细胞和黑色素细胞，然而UVA却能透过表皮对真皮造成损伤^{［19， 32］}.本研究利用UVB和UVA分别在HaCaT细胞和NIH/3T3细胞中建立表皮细胞光损伤模型和真皮细胞光损伤模型，并对酶解前后石斛多糖抗光损伤的活性进行检测.FLG在维持表皮皮肤屏障的完整性方面起至关重要的作用，它将角蛋白聚集成丝，有助于皮肤屏障结构的稳定^［33］.本研究发现用酶E752和酶E896联合水解后，石斛多糖对FLG和细胞活力的提升能力最强，因此本研究选择该双酶体系对石斛多糖进行酶解.

石斛多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等单糖组成，连接方式主要为α-和β-型连接，相对分子量范围较广，从几千到几百万不等^［34-35］.本研究采用正交试验，并结合凝胶层析优化并确定了该双酶体系的酶解条件，进一步对酶解前后石斛多糖的单糖组成及比例进行分析，发现石斛多糖在酶解后，其D-甘露糖和D-葡萄糖的比例有所改变.另外，经检测，酶解后石斛多糖的相对分子量大幅度下降，从原有的1 680k降低到了277k、1k及0.4k，这个改变增加了其在皮肤领域应用的可能性.最后，本研究发现了优化后的酶解低相对分子质量石斛多糖可从体内和体外水平抑制UVA和UVB引起的细胞和小鼠皮肤的光损伤.ROS主要由细胞内的线粒体产生，UV辐射引起的ROS的升高是其造成皮肤细胞病变的主要原因，UV照射细胞后，细胞内的发色团转变为激发态，线粒体会释放更多的ROS而引发DNA损伤^［36］.本研究表明优化后的低相对分子质量石斛多糖可抑制UVA和UVB诱导的细胞内ROS水平的升高，从而发挥抗光损伤的作用，为石斛多糖的进一步研究和应用提供了坚实的基础.

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基金资助

吉林省科技发展计划项目(YDZJ202301ZYTS446)

吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20230984KJ)