基于转录组测序分析红光刺激对三叶崖爬藤酚类成分积累及调控作用

摘要

目的 通过转录组测序技术，探究红光刺激对三叶崖爬藤（三叶青）叶片酚类成分积累的影响，并揭示其潜在的分子调控机制。方法 以三叶青叶片为材料，设置白光组和红光组，白光组用175μmol/（m²·s）的自然光LED照明，光周期为12 h/d，红光组在白光基础上每天补充红光3 h，连续处理7 d。采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）定量分析2组叶片中6种酚类成分（新绿原酸、绿原酸、3-O-香豆酰奎宁酸、荭草苷、牡荆苷、牡荆素鼠李糖苷）的含量变化。同时，利用Illumina HiSeq平台对2组样本进行转录组测序，将高质量序列（clean reads）与参考基因组进行序列比对，通过StringTie软件将clean reads组装成转录本（transcripts），使用GffCompare软件与三叶青参考基因组的注释信息比较，从中发现新基因并挖掘差异表达基因，采用FPKM算法对基因表达水平进行标准化计算。将差异表达基因进行GO、KEGG数据库注释与富集分析，筛选出酚类生物合成关键通路及差异表达基因。通过qRT-PCR实验验证香豆酰奎宁酸3'-单加氧酶（CYP98A3）、过氧化物酶（POD）、肉桂醇脱氢酶（CAD）的相对表达量和FPKM算法结果趋势是否一致。结果 与白光组比较，红光组6种酚类成分含量均显著提高（P<0.05）。转录组测序共获得20 561 252～29 588 801条clean reads，经组装后得到101 099个新基因，其中，共筛选出11 455个差异表达基因，其中有4 977（43.45%）个基因在红光处理后上调，6 478（56.55%）个基因在红光处理后下调。GO功能富集分析显示：差异表达基因在生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）分别富集了270、25和85条，BP主要富集在通路限制性SMAD蛋白磷酸化的负调控、SMAD蛋白信号转导的负调控、上皮结构维持等方面，CC主要富集在细胞基底部分、MCM复合体、凯氏带等方面，MF主要富集在甲基吲哚酸-3-乙酸酯酶活性、三羟基苯合酶活性、ATP依赖性微管运动活性（正端导向）等方面；KEGG通路富集分析表明：差异表达基因显著富集于二苯乙烯类-二芳基庚烷类和姜辣素生物合成、苯丙烷生物合成、异黄酮生物合成、类黄酮生物合成、花青素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成6条酚类生物合成通路中。在这6条通路中共鉴定出61个差异表达基因，编码19种关键酶，其中CCoAOMT、4CL、CCR等6个关键酶中的差异表达基因均上调，共计22个；FLS、F6H1、CYP98A等7个关键酶中的差异表达基因均下调，共计8个；CAD、POD、BGL等6个关键酶中的差异表达基因既有上调又有下调，其中20个差异表达基因上调，11个差异表达基因下调。qRT-PCR结果表明：CYP98A3、POD和CAD的相对表达量和FPKM趋势与转录组一致。结论 红光处理可显著促进三叶青叶片酚类成分的积累，其机制可能与苯丙烷和黄酮类生物合成途径中关键酶基因的上调表达有关。

关键词

三叶青 / 转录组学 / 红光补光 / 差异表达基因 / 酚类合成途径