铜离子掺杂径向介孔生物活性玻璃复合微球的制备及性能研究

Preparation and properties of copper ion doped radial mesoporous bioactive glass composite microspheres

摘要

介孔生物活性玻璃（MBG）因其具有良好的生物活性、高比表面积以及有序介孔结构，在骨修复领域具有良好的应用前景。而添加治疗性无机离子或有机分子可以赋予更多的生物学特性。通过微乳液辅助溶胶-凝胶法合成了掺杂铜离子（摩尔分数分别为1%，3%，5%）的径向结构介孔生物活性玻璃复合微球。结果表明，复合微球保留了MBG原有的球形形态和介孔结构，孔径为10~20 nm，粒径为250~310 nm。随铜离子含量的增加复合微球的比表面积从336.5 m²/g降低为149.1 m²/g。复合微球快速诱导了磷灰石的形成，显示出良好的生物活性。铜的引入显著提升了MBG的抗菌性，随着铜含量的增加复合微球的抗菌性随之增强，其中5Cu-MBG和大肠杆菌共培养24 h后的抗菌率达80%以上。

Abstract

Mesoporous bioactive glass （MBG） has a promising application in the field of bone repair， due to its good biological activity， high specific surface area， and ordered mesoporous structure. Adding therapeutic inorganic ions or organic molecules can achieve functional biological properties. Through a microemulsion-assisted sol-gel method， we synthesize radially structured mesoporous bioactive glass composite microspheres doped with copper ions （mole fraction： 1%， 3%， and 5%， respectively）. The composite microspheres retain the original spherical morphology and mesoporous structure of MBG， with a pore size of 10-20 nm and particle size of 250-310 nm. The specific surface area of copper-containing MBG decrease with the increase of copper ions， from 336.5 m²/g of 1Cu-MBG to 149.1 m²/g of 5Cu-MBG. The composite microspheres quickly induce apatite formation and show good biological activity. The introduction of copper significantly improves the antibacterial properties of MBG. As the copper content increases， the antibacterial properties of the composite microspheres are enhanced. Among them， the antibacterial rate of 5Cu-MBG reaches above 80% after co-culturing with E. coli for 24 h.

Graphical abstract

关键词

介孔生物活性玻璃 / 铜 / 抗菌性 / 生物活性

Key words

mesoporous bioactive glass / copper / antibacterial property / biological activity

骨缺损是骨科临床常见的疾病。因为车祸、事故、骨质疏松以及创伤感染等原因，每年都会有大量的骨缺损患者，严重影响患者生活质量。人体的骨骼具有一定的自我修复能力，小尺寸的骨缺损可以通过骨组织的自我修复实现自愈^［1］。然而骨组织的自我修复能力是有限的，当骨组织的缺损尺寸太大而超过骨组织的愈合能力时，纤维结缔组织将会主要占据骨缺损^［2］，需要进行骨植入手术来促进骨修复再生。骨缺损修复材料应该具有生物相容性和生物活性，同时为了促进骨组织的修复，还要具有刺激成骨和血管生成的能力 ^［3-5］。除此之外，植入材料的抗菌性能也至关重要。骨缺损往往会伴随有细菌的活动，这会使骨骼的自我修复进一步受到限制，并且会阻碍骨组织的愈合。

生物活性玻璃（bioactive glass，BG）是Hench教授等^［6］研发出来的一种用于骨修复的医用材料。生物活性玻璃表面可与生理环境发生快速的离子交换，最终通过矿化沉积作用形成类骨的碳酸羟基磷灰石，促进材料与宿主的骨结合^［7］，并且它溶解后会释放出Si、Ca、P等元素可促进骨骼再生，具有良好的生物相容性和生物活性。在生物活性玻璃的基础上，Yan等^［8］于2004年合成了介孔生物活性玻璃（mesoporous bioactive glass，MBG）。MBG与传统BG相比，具有更高的比表面积和可调节的有序介孔结构，在骨组织再生和药物释放系统中显示出潜在的应用^［9］。然而MBG的抗菌性能不足，如果能够通过引入特定的抗菌性离子或生物分子，将MBG固有的生物活性和药物递送特性等与抗菌特性相结合^［10］，有助于解决临床骨缺损治疗面临的问题。骨科植入物相关感染的治疗在医学上一直是个难题，目前主要是通过全身抗生素来治疗。然而抗生素的大量使用对人体会产生不利的影响，并会催生出耐药性的“超级细菌”。在这种情况下，使用金属离子作为抗菌剂引起了广泛的关注^［11］。铜作为人体内第三丰富的微量元素，对人骨骼生长和骨量维持有非常重要的作用 ^［12-14］。此外，大量研究表明，铜对诸如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种细菌均表现出了良好的抗菌性能^［15-17］。因此，向MBG中引入铜是一种增加MBG生物功能性的潜在策略。

本工作通过微乳液辅助溶胶凝胶法制备了掺铜的径向结构介孔生物活性玻璃复合微球，并研究了复合微球的物理化学性能、抗菌性能和生物活性。

1 实验材料与方法

1.1 介孔生物活性玻璃复合微球的合成

实验中所用的主要试剂包括：原硅酸四乙酯（TEOS）、磷酸三乙酯（TEP）、四水硝酸钙（CN）、硝酸铜溶液、无水乙醇和氨溶液，购自Casmart中国；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 和环己烷购自广州东巨实验仪器有限公司。所有试剂均为分析纯。

本工作复合微球的制备方法参考了之前制备介孔生物活性玻璃微球^［18-19］的方法并在此基础上加以改进，以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为结构导向剂，通过微乳液辅助溶胶凝胶法合成掺杂铜的介孔生物活性玻璃复合微球。基础玻璃组分为80% SiO₂-15% CaO-5% P₂O₅ （摩尔分数，下同），并以0%、1%、3%和5% 铜取代基础玻璃组分中的钙，分别命名为MBG、1Cu-MBG、3Cu-MBG、5Cu-MBG。具体合成过程如下：40 ℃下将9 g CTAB添加到187.5 mL去离子水和112.5 mL乙醇的混合物中以形成CTAB胶束。将6.75 mL TEOS溶解到90 mL环己烷当中，随后将环己烷溶液加入CTAB溶液中。将混合溶液搅拌均匀并超声后，向溶液中加入10 mL氨水，促进TEOS水解。然后将混合物搅拌20 min后，向混合物中添加0.515 mL TEP，30 min后再加入适量的硝酸铜溶液和硝酸钙溶液。搅拌5~6 h后停止，抽滤收集沉淀，并用去离子水、乙醇冲洗。将抽滤得到的产品，在60 ℃烘干箱内干燥3~4 d。在马弗炉内于650 ℃煅烧3 h去除有机物和硝酸盐。最后使用玛瑙研钵研磨成细粉。

1.2 结构表征

使用综合热分析仪（Mettler Toledo TGA/DSC3+）对CTAB、硝酸钙和MBG干凝胶进行热重分析（TGA）以确定合适的热处理温度，测试在空气环境中进行，温度范围为50~800 ℃，升温速率为10 ℃/min。通过X射线衍射仪（XRD，UltimaIV）测量了复合微球的化学成分，使用Cu，Kα1射线，扫描步长0.02°，2θ范围为10°~80°。采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR，Nicolet IS50）测量了复合微球的官能团结构，测试在KBr颗粒模式下进行，波长范围2400~400 cm^-1。使用场发射扫描电子显微镜 （FE-SEM，Philips 525M）、能量色散X射线光谱（EDS，Philips Edax 9100）、透射电子显微镜（TEM，JEM 2100F）和X射线光电子能谱（XPS，Thermo Scientific™ K-Alpha™）研究了复合微球的微观形态和元素分布。采用NOVA 2000e多点氮吸附仪测试了复合微球的比表面积、孔径以及孔体积。

1.3 离子释放测试

为了测定Cu离子的释放性能，将30 mg复合微球放入装有30 mL 模拟体液（SBF，pH=7.4）的容器中，置于恒温摇床（IKA KS 4000）中培养不同时间，每组样品设置3个平行样，温度控制在37 ℃，振荡转速为150 r/min。在每个时间点（1、3、7 d），将悬浮液离心并收集1 mL上清液，使用ICP-MS电感耦合质谱仪（ICP）测量每个时间段的离子释放量。

1.4 体外生物活性评估

为了研究复合微球的体外生物活性，将复合微球浸泡在装SBF的聚乙烯瓶中，在37 ℃下分别浸泡1、3 d和7 d，去离子水冲洗后干燥。复合微球与SBF溶液的比例为1 mg/mL。通过XRD、SEM、TEM和EDS研究了复合微球上羟基磷灰石的形成。

1.5 抗菌性能测试

选择具有代表性的革兰氏阴性菌株（大肠杆菌）进行复合微球体外抗菌效果的测试。细菌在 Luria-Bertani （LB） 培养基中于摇床上（37 ℃，220 r/min）培养10~12 h后，将细胞悬浮液稀释至1×10⁷ CFU/mL，以1 mg/mL的比例将适当的样品加入细菌溶液中，并建立空白对照组。在24 ℃和150 r/min下孵育24 h后，取30 μL培养液于琼脂平板上置于生化培养箱中培养12 h，并使用平板计数法计算样品的抗菌效力。抗菌率的计算公式为：R=\frac{N_{\mathrm{0}}-N_{\mathrm{t}}}{N_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。式中，R为抗菌率；N₀和N_t分别为对照和实验组样品的平均活菌数。

2 结果与分析

2.1 复合微球的物理化学性质

依据TGA结果，合成复合微球的热处理温度确定为650 ℃。从图1（a）中TGA曲线可以看出，CTAB在400 ℃后质量未发现明显变化，表明CTAB在400 ℃时已经分解完毕；温度超过650 ℃后，硝酸盐也已完全分解；并且MBG的曲线在650 ℃后没有明显的质量损失；这些结果表明，经过650 ℃热处理后，MBG中有机物、硝酸盐已完全挥发或分解。合成的复合微球如图1（b）所示，掺铜后的复合微球呈现淡蓝色，而且随着掺入铜的含量的增加，复合微球颜色逐渐加深。这是典型的Cu掺入的特征。造成这种现象的原因是MBG 中的Cu会在800 nm处产生光学吸收带^［20］，从而产生蓝色。

图2（a-1）~（d-1）是场发射扫描电镜（FE-SEM）观察到的复合微球的微观形态，从图中可以看出，所有样品呈分散良好的球形颗粒。微球粒径分布统计结果如图2（a-2）~（d-2）所示，微球平均粒径约为250~310 nm。上述结果表明，铜的引入对MBG的微观形态和颗粒尺寸并没有显著影响。

随后使用透射电子显微镜来观察复合微球的内部结构，结果如图3（a-1）~（d-1）所示。所有样品内部均呈现清晰的径向介孔结构。对复合微球进行EDS分析，以进一步验证其含有铜。样品MBG、1Cu-MBG、3Cu-MBG和5Cu-MBG的EDS结果如图3（a-2）~（d-2）。所有样品中均显示出硅、钙和磷的峰，这是任何硅酸盐生物活性玻璃的典型特征。EDS分析表明所有掺铜样品中都存在铜的峰，而且，随着玻璃中铜含量的增加，其强度增加。

从图4（a）XRD图谱中观察到，所有样品在2θ= 23°处均出现了宽的馒头峰，这是生物活性玻璃特征峰，证明样品属于典型的无定型结构。同时所有样品XRD图谱中没有观察到氧化铜的衍射峰，表明掺入的铜未形成氧化物晶体。样品的FT-IR光谱如图4（b）所示，对于所有样品，1042 cm^-1处的吸收峰对应于Si—O—Si 的非对称伸缩振动，789 cm^-1处的吸收峰对应Si—O的对称伸缩振动，而位于439 cm^-1处的吸收峰则对应于Si—O—Si的对称弯曲振动。

为了进一步探究复合微球的介孔结构，对制备的MBG、3Cu-MBG和5Cu-MBG样品进行了氮气吸脱附实验。样品的氮气吸脱附等温曲线绘制在图5（a）中，根据IUPAC分类^［21］，属于典型的Ⅳ型等温线。在所有样品中都可以观察到该等温线的特征迟滞回线，其中解吸分支在相对较高的相对压力（P/P₀）值下不遵循与吸附分支相同的路径，形成 H4 型磁滞环。这些结果清楚地表明样品具有狭缝型介孔结构，同透射电镜照片中所显示的结构相吻合。从样品等温线的解吸分支获得孔径分布，绘制在图5（b）中，样品MBG、3Cu-MBG和5Cu-MBG的平均孔径（D_p）分别为11.14、13.42 nm和16.65 nm，符合介孔的特征。所有样品都具有较高的比表面积（S_BET）和孔体积（V_p），比表面积分别高达336.5、226.5 m²/g和149.1 m²/g，孔体积分别为0.57、0.63 cm³/g和0.59 cm³/g。复合微球介孔结构的所有数据列于表1中。

2.2 铜离子的释放

图6显示了从所有样品释放到SBF溶液中铜离子浓度随时间变化的曲线。可以看出，所有掺铜样品在浸泡的7 d的时间里，有铜离子的连续释放，而在浸泡的第1 d里，铜离子得到快速释放，随后铜离子的释放速度变得缓慢。而且，随着样品中铜掺入量的增加，释放到SBF溶液中的铜离子量明显增多。

2.3 复合微球的体外生物活性

生物活性材料的一个常见特征就是在SBF溶液中浸泡一定时间后，表面会形成羟基磷灰石（HAP）。因此，羟基磷灰石的形成有助于评估复合微球的生物活性。本工作所制备的复合微球在SBF溶液中浸泡后表现出优异的羟基磷灰石矿化能力。通过XRD、TEM、EDS监测了复合微球表面羟基磷灰石的形成。XRD结果显示，在SBF溶液中浸泡3 d后（图7（b）），所有样品均检测到明显的羟基磷灰石衍射峰。随着浸泡时间延长（浸泡7 d后）（图7（c）），羟基磷灰石的衍射峰进一步增强。5Cu-MBG样品在SBF溶液中浸泡7 d后，TEM（图7（d））观察到菜花状的羟基磷灰石层，EDS分析（图7（e））检测到Ca/P摩尔比为1.63，接近羟基磷灰石理论摩尔比1.67。

尽管制备的复合微球显示出优异的生物活性，但是图7（a）XRD结果也显示，在SBF溶液中浸泡1 d后，MBG和1Cu-MBG样品出现羟基磷灰石衍射峰，而3Cu-MBG以及5Cu-MBG样品未检测到羟基衍射峰，这表明MBG和1Cu-MBG样品在矿化初期具有更快的磷灰石形成速度，铜的引入对羟基磷灰石的形成具有一定的阻碍作用。Wang等^［22］的研究解释了铜对羟基磷灰石形成的阻碍，认为铜离子以八面体配位形式结合到玻璃结构中，玻璃结构的稳定性随着铜离子的量增加而增强，从而导致离子交换过程变得更困难。Hoppe等^［23］同样认为铜离子主要在玻璃基质中的结合是八面体配位，两个非桥氧将铜离子包围以实现电中性。除此之外，铜的掺入会导致MBG的比表面积下降，离子交换面积减少。这些原因都阻碍羟基磷灰石的生成。

2.4 复合微球的抗菌性能

为了探究复合微球的抗菌性能，选取常见的革兰氏阴性菌株大肠杆菌作为细菌模型，将MBG、3Cu-MBG和5Cu-MBG样品与大肠杆菌共培养24 h，利用平板计数法测定样品的抗菌性能。抗菌率结果如图8所示，从图中可以看出，虽然MBG粉末本身具有一定的抗菌作用，但抗菌性并不佳。而铜的掺入可以明显提升MBG的抗菌性能。样品与细菌共培养24 h的琼脂板菌落数结果如图9所示，可以看出，空白对照组的菌落最多，MBG组的菌落数有所减少，5Cu-MBG的菌落数最少。这表明铜的掺入有效提升了MBG对大肠杆菌的抗菌性能，并且抗菌性和铜含量呈正相关。

铜作为金属抗菌剂有着非常广泛的应用，在诸如自来水体系、空调系统、临床应用等领域都有铜的身影，铜对常见的多种细菌病毒诸如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、流感病毒等均具有良好的抗菌性^［24］。铜的抗菌活性与释放的游离铜离子直接相关^［25］。细菌的细胞膜是铜离子抗菌作用的主要靶点，带正电的铜离子与细菌细胞膜上的电负性基团（如硫醇或羧基）接触时，会产生库仑引力，导致负电荷在细胞膜上分布不均、细胞变形甚至物理破裂^［26-27］。细胞内的一些必需物质同样是铜离子抗菌作用的重要靶点，铜离子可以与细胞中DNA和蛋白质结合，破坏细胞的正常生理结构，影响相关生化反应，抑制细胞正常生长，甚至导致细胞死亡^［28-29］。铜离子通过硫自由基中间体等引发形成活性氧（ROS）的趋势进一步损伤细胞蛋白质和脂质，最终破坏所有遗传物质，导致细胞死亡^［30-31］。从本工作抗菌性实验中观察到，铜的添加显著提高了介孔生物活性玻璃微球的抗菌活性，而且抗菌活性的提高与释放的铜离子浓度正相关。这项有关抗菌性的实验中获得的结果进一步证实了铜离子的释放对抗菌性能的重要作用。

近年来，随着骨植入手术的巨大发展，与受污染的植入医疗器械相关的细菌感染已成为严重的并发症。临床上抗生素的滥用也导致了与具有抗生素耐药的细菌有关的感染病例日益增加。迫切需要开发能够再生骨组织并抑制病原微生物的新型生物材料。因此，对介孔生物活性玻璃进行改性研究，通过添加治疗性无机离子或有机分子，为生物活性玻璃引入额外的性能（如抗菌活性等），从而提供一种用于生物医学应用的新型生物活性玻璃复合材料，具有重要的意义。

3 结论

（1）成功合成了具有径向结构的掺铜生物活性玻璃复合微球，复合微球孔径为10~20 nm，粒径250~310 nm。铜的引入并不会显著影响生物活性玻璃的介孔结构和球状形态。

（2）合成的生物活性玻璃成功诱导羟基磷灰石的形成，表现出良好的生物活性。随着引入的铜含量的增加，生物活性玻璃比表面积下降，对羟基磷灰石的生成产生一定的阻碍。

（3）铜的引入显著提高了生物活性玻璃对大肠杆菌的抗菌作用，抗菌性能和铜的含量呈正相关。5Cu-MBG和大肠杆菌共培养24 h后的抗菌率达80%以上。

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基金资助

广东省自然科学基金项目(2022A1515011261)

广东省自然科学基金项目(2022A1515220040)

广东省自然科学基金项目(2023A1515220021)

广东省自然科学基金项目(2023A1515220085)

广东省自然科学基金项目(2024A1515011159)