乙型肝炎病毒基因整合对功能性治愈的影响

Effect of hepatitis B virus integration on functional cure

摘要

功能性治愈是目前国内外慢性乙型肝炎防治指南推荐的理想治疗目标，被定义为完成有限疗程治疗后，血清HBsAg和HBV DNA持续检测不到、HBeAg阴转、伴或不伴HBsAg血清学转换、肝脏炎症缓解和组织病理学改善、终末期肝病发生率显著降低。HBV可以整合到宿主基因组中持续表达HBsAg，且可发生在慢性HBV感染的早期阶段，因此除了肝组织内难以清除的共价闭合环状DNA外，独立于病毒复制的HBV整合来源的HBsAg可能是慢性乙型肝炎患者在抗病毒治疗后难以实现功能性治愈的重要因素。本文围绕近年来HBV整合方面的研究进展，着重探讨其对功能性治愈的影响。

关键词

乙型肝炎病毒 / 基因 / 功能性治愈 / 抗病毒治疗

Key words

Hepatitis B Virus / Genes / Functional Cure / Antiviral Therapy

HBV感染是一个重要的公共卫生问题，可以导致肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等相关疾病。慢性乙型肝炎（CHB）的治疗目标是延缓或较少终末期肝病的发生，从而提高患者的生活质量并延长生存时间。因HBsAg阴转可显著改善CHB患者发生肝癌、失代偿肝硬化等不良结局的发生风险，以血清HBsAg消失为基本要素的乙型肝炎功能性治愈是目前国内外公认的抗病毒治疗的理想终点。功能性治愈是指完成有限疗程治疗后，血清HBsAg和HBV DNA持续检测不到、HBeAg阴转、伴或不伴HBsAg血清学转换、残留cccDNA可持续存在，肝脏炎症缓解和组织病理学改善、终末期肝病发生率显著降低^［1］。当前批准用于治疗CHB的药物包括α-干扰素和核苷（酸）类似物［nucleos（t）ide analogues，NAs］，尽管可以有效抑制病毒复制，但在长期抗病毒治疗下，只有极少数CHB患者能实现功能性治愈^［2］，这除了与肝内难以清除的以微染色体形式存在的共价闭合环状DNA（cccDNA）有关外，还与HBV整合有关。整合到宿主基因组中的HBV片段可以独立于病毒的复制过程持续表达HBsAg，因此成为功能性治愈的重要障碍。本文将对近年来HBV整合方面的研究进展及其对功能性治愈的影响进行综述。

1 HBV整合的机制及编码产生的病毒蛋白

HBV复制有着独特的逆转录过程，而整合则是病毒复制过程中的副产品，并非生命周期所必须。HBV逆转录过程中若引物模板转位失败，在原位启动正链合成就会导致病毒负链和新合成的正链形成双链线性DNA （double-strand linear DNA， dslDNA）， dslDNA为整合提供了带有两个游离末端的HBV DNA片段^［3］，而肝脏炎症引起的氧化损伤等造成的宿主基因组DNA双链断裂则为病毒整合提供了所需的断点。dslDNA入核后可通过非同源末端连接或微同源介导的末端连接插入宿主细胞染色体中^［4］。早期研究通过体外模型发现，1165A/DR1-13突变株质粒的正链引物易位有缺陷，导致线性与环状DNA的比例从1∶1升高至10∶1，在细胞中转染含有该突变的表达质粒可导致整合率的上升^［5］。外源性HBV片段在人类基因组中的整合可能会影响下游宿主基因的表达及功能，此外，整合的不断积累还会引发宿主DNA的错配修复反应，诱导基因组重排，导致细胞恶性转化过程中染色体稳定性的改变^［6-7］，因此HBV整合可能还具有促进肝癌发生发展的作用。

HBV dslDNA往往通过基因组上的DR1区域与宿主基因组融合，但在整合过程中可能会发生截断，所以整合可能从1 820 nt或更下游开始^［8］。目前大部分研究认为HBV整合在宿主染色体中呈现随机分布的趋势^［9］，但也有观点认为基因组上转录活跃的区域因解旋失去了核小体的保护而更容易损伤断裂，病毒整合可能更倾向于发生在基因富集的区域，包括CpG岛、基因编码区及启动子区^［10］，而并非真正意义上的“随机”。此外，由于HBV整合优先发生在细胞基因组双链断裂处，而DNA的损伤修复通常发生在细胞G0/G1期，因此，细胞所处的周期可能也一定程度上影响HBV整合的频率。

HBV基因组上的多个顺式作用元件，包括启动子SP1、SP2和XP及增强子EN‍Ⅰ和ENⅡ在整合的前体dslDNA上均被完整保留，因而整合的HBV序列可以支持大/中/小（L/M/S）包膜蛋白及C端截短的HBx蛋白的表达，还可延伸至宿主的多聚腺苷酸信号（PAS）处终止转录进而产生具有反式激活作用的病毒-宿主嵌合蛋白^［11］。HBV整合产生的病毒蛋白可能与cccDNA来源的蛋白在功能上有所不同。HBV整合产生的截短HBx则缺乏具有促细胞凋亡特性的C端结构域，其过度表达可以抑制细胞凋亡^［12］。整合产生的截短的HBsAg不能正确分泌，积累在内质网膜中引起内质网应激和细胞氧化应激，增加DNA损伤和双链断裂，一定程度上也增加dslDNA在宿主基因组中整合的可能^［4］。鲁凤民教授团队最近的研究发现，整合HBV DNA表达的HBsAg分泌效率显著低于cccDNA，通过构建p-dslDNA体外模型，发现由整合DNA整合转录的2.4 kb RNA占比以及随之而来的L-HBsAg蛋白占比均高于cccDNA，这可能是导致HBsAg分泌效率下降和肝细胞内潴留的主要原因^［13］。

从理论上而言，dslDNA上CP/BCP与编码区分离，由于缺少核心启动子序列，整合HBV DNA与cccDNA不同，存在复制缺陷，不能产生具有感染性的病毒颗粒，不能转录出前基因组RNA（pre-genomic RNA， pgRNA），也不能表达病毒聚合酶、HBeAg和HBcAg^［14］。但近期有研究通过第三代测序技术发现了一条长度大于3.2 kb的整合HBV序列^［15］，这颠覆了以往认为整合来源的HBV DNA不能产生pgRNA的认知。同时，研究者还在整合序列中发现了多种spliced RNA，预示着同一HBV整合事件具有产生多种不同形式转录本的潜能。这些不同的观点和研究结果也强调了今后在更多临床队列中解析HBV整合分子特征的必要性。

肝癌细胞系PLC/PRF/5的基因组中存在HBV DNA整合片段，能稳定产生HBsAg^［16］，是研究整合HBV DNA的有效体外细胞模型，鲁凤民教授团队利用多组学技术全面解析了PLC/PRF/5细胞系HBV整合的特征、转录水平及转录调控机制，为靶向清除和静默整合来源HBsAg提供了重要思路^［17］。

2 HBV整合是阻碍CHB功能性治愈的重要因素

慢性HBV感染自然史复杂，疾病进展不同阶段病毒的复制和转录水平及宿主的免疫应答状态都存在显著差异，HBV的整合频率也可能有所不同。HBeAg血清学转换和向HBeAg阴性慢性感染转变是CHB自然史中的一个关键事件，标志着免疫介导的肝损伤的结束，并与HBV DNA水平显著下降相关。研究表明，相较于HBeAg阳性CHB患者，HBeAg阴性患者肝组织内cccDNA水平显著更低，同时血清HBsAg水平和肝内cccDNA水平开始缺乏显著相关性^［18］。ARC-520是一款RNA干扰药物，特异性靶向cccDNA来源的转录本，临床研究结果显示其无法有效抑制HBeAg阴性患者HBsAg的产生和分泌^［19］，也意味着携带HBV整合事件的肝细胞克隆性扩增形成的细胞集落可能是HBeAg阴性患者HBsAg表达的主要来源^［19-20］，这使得独立于HBV复制过程的整合成为阻碍慢性HBV感染功能性治愈的主要障碍。

HBV整合不仅可以发生在高HBV DNA水平的患者中，在低病毒载量的HBeAg阴性患者中也有较高的发生率^［21］。最近一项研究通过RNA-seq在HBeAg阴性、低病毒载量的CHB患者肝组织中检测到了转录活跃的HBV整合事件，并发现低载量的cccDNA作为模板不足以支持肝内广泛的HBV RNA及HBsAg的表达，由此推测肝组织中普遍存在的HBV整合可能是HBsAg表达的主要来源^［22］。随着长期抗病毒治疗阻断cccDNA池的补充，HBV整合转录本的读数与HBsAg阳性肝细胞比率及血清HBsAg水平出现正相关，也提示整合来源的HBsAg开始占据主要地位^［23］。笔者前期研究在已获得功能性治愈的患者肝组织中也观察到了转录活跃的HBV整合，表明HBV整合现象可能比预先认为的更为普遍^［24］，那些通过长期抗病毒治疗病毒复制得到抑制但始终无法实现HBsAg阴转的患者肝组织内可能存在广泛的HBV整合事件。

3 HBV整合检测技术的发展及相关无创标志物

HBV DNA整合现象在1980年首次被报道，在之后40余年的研究进程中，检测方法不断发展。Southern Blot是当年第一个用于揭示患者肿瘤组织和HCC细胞系中存在HBV整合的技术^［25-27］，但该方法无法提供整合位点的相关信息。Alu-PCR被广泛用于检测HBV相关HCC^［28］及慢性HBV感染患者^［29］的病毒DNA整合，但只有当整合位点位于人类基因组Alu元件附近时才可被该方法检出。通过反向PCR（Inverse PCR）鉴定HBV整合事件的灵敏度较高，但上下游缺乏限制性内切酶消化位点的整合序列也无法通过该方法检出^［30］。随着二代测序技术的快速发展，现阶段研究多通过转录组测序（RNA-seq）^［22］、全基因组测序^［31］、全外显子测序^［21］等方法结合生物信息学分析鉴定宿主基因组中的HBV整合事件，这些技术能灵敏地捕捉到整合序列的断点信息，但相对较短的读长难以揭示整合序列的全貌。第三代测序具有对单分子进行长片段测序的技术优势，能在全基因组范围内检测HBV整合序列的特征及染色体易位、基因融合等结构变异^{［15， 32］}，是目前研究宿主基因组中HBV整合全貌的有利工具。在应用上述检测方法鉴定HBV整合序列时，核酸在提取过程中不可避免地丢失了原本在肝组织中的位置信息，如需探明慢性HBV感染者肝组织中有多少受感染的细胞携带病毒整合事件及其分布特征，则需要寻找一种非传统的研究手段。近年来迅速发展的空间转录组测序技术可以还原序列在组织中的定位，弥补了传统高通量测序的缺陷^［33］，笔者团队在之前的研究中首次应用该技术揭示了转录活跃的HBV整合事件在慢性HBV感染不同阶段肝组织中广泛分布^［24］，与免疫组化、原位杂交等技术联用或许可以帮助还原更多HBV整合在肝组织原位的相关信息。

如上所述，转录活跃的HBV整合可以导致CHB患者，尤其是HBeAg阴性CHB患者的HBsAg表达独立于cccDNA和HBV复制，因此绝大多数患者在抗病毒治疗后HBsAg的清除率较低，而HBsAg清除恰好是临床功能性治愈的标准之一。在临床实践中，如何寻找合适的生物标志物来替代HBsAg，以更好地监测抗病毒治疗后肝内病毒复制能力和转录活性仍是一项重大的挑战。近期，HBV RNA被发现可作为一种新的病毒学无创标志物来反映肝内cccDNA的转录活性，也可以用于预测疗效。根据HBV RNA序列3'末端加尾信号的碱基差异，可以辨别整合来源或cccDNA复制来源的HBV转录本^{［15，19］}，HBV整合来源的转录本往往在HBV基因组上的隐性PAS处终止转录进而产生缺乏传统的多聚腺苷酸信号的截短HBV RNA，而病毒复制则会产生具有保守3'末端的多聚腺苷酸化的HBV RNA。因此，通过设计特定的引物序列量化外周血中由cccDNA转录而来的HBV RNA^［34］，可以很好地反映肝内cccDNA的转录活性^［35］。

既往研究在HBV相关HCC患者外周血中抽提细胞游离DNA（cfDNA），通过富集后测序检测到整合来源的HBV-宿主嵌合序列^［36-37］，提示循环HBV-宿主嵌合DNA作为HBV相关HCC肿瘤标志物的可行性。对慢性HBV感染者外周血中的RNA进行测序也可观察到HBV-宿主嵌合序列，但检出阳性率较低^［38］，仅占外周血HBV RNA的极少数^［39］，因此，是否能将CHB患者循环血中检出的HBV整合序列作为反映肝组织内病毒整合情况的标志物还需要更多研究来证实。

4 现有抗病毒治疗对HBV整合的影响

慢性HBV感染的早期阶段即可检测到HBV整合事件的发生^［40］，在体外细胞感染模型中也证实HBV整合发生在病毒感染后的几天内 ^［41］，且不依赖HBV的从头复制^［42］，由此引发了临床实践中对治疗干预时机的思考。若要避免HBV整合带来的诸如促进HBV相关肝癌发生等威胁，应当尽早进行抗病毒治疗。研究发现，在治疗基线肝组织内没有检测到HBV S基因整合的患者在接受抗病毒治疗2～4年后HBsAg水平持续下降，而检测到HBV S基因整合的患者治疗2～4年后HBsAg水平基本不下降^［43］。另有研究表明，基线HBV整合水平与血清HBV DNA和HBsAg水平相关，且可以很好地预测患者停药5年内的HBsAg消失，也提示在临床需要考虑到HBV整合水平对CHB患者抗病毒治疗临床结局的影响^［44］。

在体外细胞感染模型中发现HBV整合可以被钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）抑制剂Bulevirtide阻断，但不能被替诺福韦、干扰素等抗病毒药物及核衣壳装配抑制剂GLS4阻断^［41］，在土拨鼠模型中也发现HBV感染后所有肝细胞都含有cccDNA和整合的DNA序列，在治疗过程中cccDNA水平可能会出现下降，但整合的DNA序列数没有发生明显减少^［45］，表明抗病毒治疗对HBV整合并不是直接的抑制作用。然而，有临床队列研究结果显示抗病毒治疗能够有效减少患者肝组织内HBV整合事件的数量。一项临床研究对患者基线和富马酸替诺福韦酯（TDF）治疗3年后的配对肝活检组织进行RNA-seq，结果显示，抗病毒治疗通过抑制病毒复制减少了转录活跃的HBV整合事件的数量^［46］。另一项研究在患者的配对肝活检组织中也发现，在抗病毒治疗78周及260周后，HBV整合事件的水平出现显著下降^［33］。更有研究结果表明，即使在接受10年的抗病毒治疗后，所有患者的肝组织中仍能检测到病毒的整合，但接受长期NAs治疗能减少HBV整合事件和肝细胞克隆的数量^［47］。笔者团队的前期研究也发现，有既往抗病毒治疗史的患者HBV整合序列数显著较少，转录活跃的HBV整合事件在肝组织中的分布程度也显著较低^［29］。由此看来，抗病毒治疗可能是通过有效地抑制病毒复制，减少包括dslDNA在内各种形式HBV DNA复制中间体的产生，从而阻止新一轮的HBV感染及HBV的从头整合；同时，未感染的肝细胞克隆扩增，而含有HBV整合的肝细胞可能在肝脏的自我更新过程中丢失并被未感染的细胞取代，也在一定程度上稀释了含有HBV整合的肝细胞数量，意味着尽早抗病毒治疗可以最大限度地减少含有HBV整合的肝细胞的选择性扩增。此外，抗病毒治疗也可以通过抑制病毒复制来缓解肝组织局部炎症反应，减少基因组DNA的氧化损伤，进而在一定程度上降低HBV整合至宿主基因组中的概率。

众多研究表明，HBsAg的清除能显著降低HCC的发生风险，CHB患者越早实现功能性治愈，其远期获益越大。而携带HBV DNA整合片段且能表达整合来源HBsAg的克隆性扩增肝细胞的数量随着年龄增长呈增长趋势，机体的HBV表面抗体特异性T淋巴细胞数量却随着年龄增长呈现降低的趋势^［40］。考虑到HBV整合和肝细胞克隆性扩增与HCC风险增加的相关性，应该将抗病毒治疗关口前移，使患者更大程度受益。

5 HBV整合对治疗策略的影响

尽管降低HBsAg水平是目前评价抗HBV新药和新策略的关键指标，但整合来源的HBsAg表达并不意味着病毒在肝内的活跃复制，这对于定义功能性治愈和考虑HBsAg阳性患者是否能安全停药是一个重要问题。而为了实现以HBsAg消失为重要指标的功能性治愈，在通过抗病毒治疗达到cccDNA的转录沉默或完全清除的基础上，还需要清除具有转录活性的整合HBV DNA^［48］。由于整合来源的HBsAg完全独立于病毒的复制，导致目前临床上最为广泛应用的NAs对整合DNA转录和HBsAg的持续表达缺乏有效作用，不能提供理想的功能性治愈率。在当前缺乏能够完全清除HBV的有效药物的情况下，需要研发新的抗病毒药物来清除或抑制病毒，降低抗原表达，或是联合免疫治疗策略，才能进一步提高HBsAg的清除率。

小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）在内的RNA干扰药物可以通过以碱基互补的方式与HBV目标基因转录本结合，虽然不能直接靶向cccDNA与整合HBV DNA片段，但能阻碍两者转录的mRNA，进一步阻止病毒蛋白的表达，但这种短时间内的血清病毒蛋白水平下降并不一定能使耗竭的细胞免疫功能恢复，cccDNA及整合来源的HBsAg的阴转往往需要免疫调节的加持。通过提高宿主免疫应答，特别是恢复或增强功能耗损的HBsAg特异性T淋巴细胞活性，不仅能够清除含有cccDNA的肝细胞，也能够清除有整合片段表达HBsAg的肝细胞，更有助于实现以血清HBsAg清除为标志的功能性治愈。基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑疗法为多种遗传病和感染性疾病提供了一种治疗手段^［49］，根据cccDNA和HBV整合序列的特征，可以特定靶向病毒序列，进而可能进一步改善CHB人群的功能性治愈率。

6 小结

综上所述，独立于病毒复制的HBV整合来源的HBsAg可能是阻止CHB患者抗病毒治疗后实现功能性治愈的重要因素。虽然现阶段对HBV整合的相关机制、慢性HBV感染者中的病毒整合情况及其影响因素以及HBV整合在HCC发生中的作用等都有一定认识，但仍然存在许多尚未解决的问题，特别是HBV整合对功能性治愈的影响值得进一步深入研究。只有找到有效消除HBV整合来源HBsAg的方法，或通过尽早抗病毒治疗减少预存的HBV整合，才有可能让更多CHB患者实现功能性治愈。

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