线粒体翻译起始因子（MTIF2）基因甲基化的特征及其与肝细胞癌发生的相关性分析

Characteristics of mitochondrial translational initiation factor 2 gene methylation and its association with the development of hepatocellular carcinoma

摘要

目的 结合生物信息学分析方法对线粒体翻译起始因子（MTIF2）基因的甲基化特征进行分析，并探讨其与肝细胞癌发生发展的关系。方法 应用MethSurv、EWAS Data Hub软件对MTIF2甲基化样本进行标准化分析和聚类分析，内容包括生存曲线分析、甲基化特征分析、肿瘤信号通路相关性及泛癌数据库比对分析。计量资料两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。使用Cox比例风险模型基于患者CpG部位的甲基化水平执行单变量和多变量生存分析。通过Kaplan-Meier图标识较低和较高甲基化患者组之间的生存差异。Log-likelihood ratio法用于组间生存差异分析。结果 MTIF2甲基化整体聚类表明在种族、人种、BMI、年龄等特征间MTIF2基因甲基化水平没有明显差异。Kaplan-Meier生存曲线分析发现，MTIF2基因N-Shore高甲基化的患者预后明显好于低甲基化患者（HR=0.492,P<0.001），而CpG island和S-Shore甲基化的高低与生存率无明显差异（P值均>0.05）。基于不同年龄、性别、BMI、人种、种族、临床分期绘制MTIF2基因甲基化谱发现，随年龄增长会降低MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平，白种人的MTIF2基因N-Shore的甲基化水平明显低于亚洲人（P<0.05），临床分期Ⅳ期患者MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均<0.05）。临床验证试验表明，Ⅲ/Ⅳ期肝细胞癌患者MTIF2甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P<0.05），且低于健康人群（P<0.05）。结论 MTIF2基因N-Shore低甲基化是肝细胞癌发生发展的危险因素。

关键词

线粒体翻译起始因子 / 甲基化 / 癌,肝细胞 / 计算生物学

Key words

Mitochondrial Translation Initiation Factor / Methylation / Carcinoma， Hepatocellular / Computational Biology

肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率逐年升高。HCC的发生发展受一系列遗传因素和环境因素的共同作用，其致病机制复杂多样^［1］。目前手术切除仍然是HCC最有效的治疗方法，但术后的高复发率使得患者的预后并不理想^［2］。已知在HCC组织存在全基因组低DNA甲基化和高DNA甲基化区域，DNA甲基化介导的肿瘤抑制基因启动子失活是HCC发展的重要机制。但HCC中异常表达的长链非编码RNA的DNA甲基化研究仍处于初始阶段。研究发现关键基因DNA甲基化大量参与生命活动调节、细胞增殖、肿瘤发生等生物进程^［3］，并在HCC的发生与术后复发机制中扮演重要角色^［4］。研究表明线粒体翻译起始因子2（mitochondrial translation initiation factor 2，MTIF2）可能通过调节细胞增殖、迁移和凋亡、肝炎病毒激活等过程影响HCC的发生发展，并认为MTIF2在HCC诊疗过程中有充当生物标志物的潜质，然而其具体的参与机制并不明确^［5］。本课题组前期数据表明，MTIF2的蛋白质表达水平与肿瘤的复发具有显著相关性，同时发现HCC复发与MTIF2的甲基化水平同样具有相关性。为了进一步分析MTIF2甲基化与HCC的关系，本研究拟通过对已有的关于MTIF2的甲基化研究进行梳理，结合生物信息学分析方法对MTIF2进行分析，探讨其参与HCC发生发展的可能机制，以期为今后HCC发病机制的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据库收集

收集TCGA数据库癌症数据集25个（LAML、ACC、BCLA、LGG、BRCA、CESC、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUSD、LUSC、MESO、PAAD、READ、SARC、SKCM、STAD、UCS、UCEC、UVM）。应用MethSurv软件、EWAS Data Hub软件对MTIF2甲基化样本进行标准化分析和聚类分析^［6］。参考数据库包括GEO、ArrayExpress和Encode数据库。

1.2 MTIF2基因单个CpG聚类分析

以LIHC TCGA癌症数据集为基础，MTIF2为目标基因单个CpG进行聚类分析，将甲基化水平与可用的患者特征和基因亚区域相关联。绘制热图，甲基化水平显示为从蓝色到红色的连续变量。

1.3 MTIF2基因甲基化生存曲线分析

以LIHC TCGA数据集为基础数据集，分别查询基因N-Shore、island和S-Shore，CpG位点选用已知的11个探针（cg27478579、cg15024566、cg18482098、cg05986680、cg27235690、cg20497627、cg22645636、cg05319060、cg18752448、cg00704126、cg10455676）进行匹配^［7］。分割点为中线进行高低甲基化分组分析。

1.4 MTIF2基因甲基化特征分析

基于不同患者特征（年龄、性别、BMI、人种、种族、临床分期）分析MTIF2基因N-Shore甲基化谱。纳入数据库检索人群共377例，绘制小提琴图用于表示不同样本组间甲基化差异，用以查询MTIF2基因CpG位点的甲基化分布、中位数和四分位数范围与患者特征，包含年龄、性别、BMI、人种、种族、临床分期。甲基化水平按中值线（Median值）进行划分，高于该值为高甲基化，反之为低甲基化。

1.5 MTIF2基因甲基化的All Cancer数据库分析

应用MethSurv软件、EWAS Data Hub软件分析MTIF2基因CpG位点在其他癌型中的甲基化情况，对癌症类型、相关性、95%CI、P值进行分析。并以P值大小排序，剔除非显著性数据（P>0.01）。

1.6 MTIF2基因甲基化临床样本验证

选取西部战区总医院2024年5月—6月的HCC Ⅲ/Ⅳ期患者10例，Ⅰ/Ⅱ期患者10例，无合并其他肿瘤，无免疫系统疾病，无糖尿病、高血压；另选取正常健康者10例作为对照组。采集外周血用于甲基化水平检测，样本检测依托成都元极生物科技公司。

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据分析。计量资料采用 \overline{x}±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。使用Cox比例风险模型基于患者CpG部位的甲基化水平执行单变量和多变量生存分析，变量包含患者CpG部位的甲基化水平，死亡事件（使用Forward：LR法）。通过Kaplan-Meier图标识较低和较高甲基化患者之间的生存差异。Log-likelihood ratio法用于组间生存差异分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTIF2基因单个CpG聚类分析

LIHC TCGA癌症数据集为基础，设置目标基因为MTIF2，应用已知的11个探针对单个CpG进行聚类分析，将甲基化水平与患者特征和基因亚区域相关联。结果表明：在种族、人种、BMI、年龄等方面MTIF2基因甲基化水平没有明显差异（图1）。

2.2 MTIF2基因N-Shore甲基化生存曲线分析

依照MTIF2的甲基化密度图进行分组，中值线（Median=0.056）左侧为低甲基化（n=189），右侧为高甲基化（n=188）（图2a）。使用Cox比例风险模型基于患者CpG部位的N-Shore甲基化水平进行单变量和多变量生存分析。Kaplan-Meier生存分析曲线结果显示，高甲基化患者的预后明显好于低甲基化患者（HR=0.492，P<0.001）（图2b）。

2.3 MTIF2基因N-Shore甲基化不同特征间的差异

随着年龄增长，患者的甲基化水平逐渐降低（P<0.05）；白种人的甲基化水平低于亚洲人（P<0.05）；临床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均<0.05）。不同性别、BMI和种族人群的MTIF2基因N-Shore甲基化水平比较，差异无统计学意义（P值均>0.05）（图3）。

2.4 MTIF2基因CpG island甲基化生存曲线分析

依照MTIF2的甲基化密度图进行分组，中值线（Median=0.027）左侧为低甲基化（n=189），右侧为高甲基化（n=188）（图4a）。使用Cox比例风险模型基于患者CpG island甲基化水平进行单变量和多变量生存分析。通过Kaplan-Meier生存分析曲线可以看出，MTIF2基因CpG island甲基化的高低与生存率无直接关系（HR=1.016，P=0.93）（图4b）。

2.5 MTIF2基因CpG island甲基化不同特征间的差异

随着年龄增长，患者的甲基化水平降低（P<0.05）；黑人或非洲裔美国人的甲基化水平低于亚洲人和白种人（P值均<0.05）；临床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均<0.05）。不同性别、BMI和种族MTIF2基因CpG island甲基化水平不存在明显差异（P值均>0.05）（图5）。

2.6 MTIF2基因S-Shore甲基化生存曲线分析

依照MTIF2的甲基化密度图进行分组，中值线（Median=0.756）左侧为低甲基化（n=189），右侧为高甲基化（n=188）（图6a）。使用Cox比例风险模型基于患者S-Shore甲基化水平执行单变量和多变量生存分析。通过Kaplan-Meier生存分析曲线可以看出，MTIF2基因S-Shore甲基化的高低与生存率无直接关系（HR=0.906，P=0.57）（图6b）。

2.7 MTIF2基因S-Shore甲基化不同特征间的差异

BMI在21.7～24.3 kg/m²时甲基化水平较高；黑人或非洲裔美国人的甲基化水平低于亚洲人和白种人（P值均<0.05）。不同年龄、性别、种族和临床分期的MTIF2基因S-Shore甲基化水平不存在明显差异（P值均>0.05）（图7）。

2.8 MTIF2基因甲基化的All Cancer数据库分析

对MTIF2基因甲基化的所有探针进行All Cancer数据库分析，得到294个比对项，对结果进行筛选后得到20个符合项（表1）。其中4个数据子集与HCC具有相关性（P值均<0.05）。

2.9 MTIF2基因甲基化的验证分析

经MTIF2甲基化检测，应用单因素方差分析进行差异显著性分析，结果表明HCC Ⅲ / Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（32.66±3.38 vs 37.96±1.36，P=0.001），Ⅰ/Ⅱ期患者MTIF2甲基化水平明显低于正常人群（37.96±1.36 vs 41.75±2.41，P=0.010），HCC Ⅲ / Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明显低于正常人群（32.66±3.38 vs 41.75±2.41，P<0.05）。

3 讨论

研究发现MTIF2的甲基化与子宫颈癌的生存率显著相关，在宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌中，甲基化或羟甲基化水平与体细胞拷贝数变化之间没有任何相关性^［8-9］。本研究发现MTIF2的甲基化与HCC的生存率同样具有显著相关性。进一步分析发现，MTIF2基因N-Shore的低甲基化（β<0.056）会降低HCC的生存率。MTIF2基因CpG island和S-Shore甲基化没有表现出生存率的明显差异。

进一步分析不同患者年龄、性别、BMI、人种、种族、临床分期等特征绘制MTIF2基因甲基化谱发现，年龄因素是甲基化水平高低的重要因素，随年龄增长会降低MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平。并且临床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者。临床验证结果表明：HCC Ⅲ / Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者和正常人群，验证结果与前期统计分析结果一致。但受样本数量影响，未发现Ⅰ期与Ⅱ期之间、Ⅲ期与Ⅳ期患者之间是否存在差异，后期有待进一步探讨。

随着分子诊断方法的进步，DNA甲基化用于评估癌前病变到早期HCC转变的过程具有重要作用，并具有对肝硬化患者预后评估及预测的潜力^［10］。例如RASSF1A、GSTP1、p14、CDH1、APC等基因的DNA高甲基化研究的较为深入，且部分已作为临床检验项目开展，而有关低甲基化的相关研究较少。一项宫颈脱落细胞的表观遗传学研究发现，MTIF2基因的低甲基化会导致总体生存率显著降低（HR=0.48，P=0.048）^［11］。HCC中MTIF2的相关研究发现：（1）HCC组织中高表达的MTIF2来源于上皮细胞和肝细胞，MTIF2可能作用于超氧化物歧化酶2，调控活性氧通路，从而影响HCC的进展^［12］；（2）MTIF2可抑制HCC细胞中药物诱导的免疫原性细胞死亡，这些机制可能与MTIF2低甲基化影响HCC发生有关^［13］。泛癌数据对比分析表明，MTIF2甲基化与12种肿瘤存在关联，与HCC关系最为密切。

综上，MTIF2的低甲基化是HCC发生发展的危险因素。但值得注意的是，在人类癌症中，MTIF2在遗传或表观遗传水平上的作用尚不清楚，值得进一步地探索。

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