五倍子酸对肝癌HepG2细胞索拉非尼化疗增敏作用

Effect of gallic acid in increasing the chemosensitivity of hepatocellular carcinoma HepG2 cells to sorafenib

摘要

目的 观察五倍子酸（GA）联合索拉非尼（Sora）对HepG2细胞的化疗增敏作用，并探讨其作用机制。方法 将肝癌HepG2细胞分为对照组、GA组、Sora组和GA+Sora组。CCK8法检测细胞活力，CompuSyn软件分析联合用药指数（CI值）；平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；流式细胞术检测细胞凋亡；细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力；Western Blot法检测基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP-9和凋亡相关蛋白表达。肝癌HepG2细胞接种于裸鼠背部右下方，植瘤6 d后分为4组：对照组（Control）、GA组、Sora组和GA+Sora组，每周测量1次肿瘤大小和质量，药物干预21 d，处死裸鼠，取肿瘤称重。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 GA和Sora作用HepG2细胞48 h的IC₅₀值分别为（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L,Sora与70μmol/L GA（IC30）联用后，IC₅₀降至（2.06±0.35）μmol/L，不同浓度Sora与70μmol/L GA联合用药CI值均<1；各组细胞克隆形成数分别为234.0±20.4、147.0±12.1、129.3±13.3、73.0±7.6,GA+Sora组细胞克隆数明显低于对照组、GA组和Sora组（P值均<0.05）；处理48 h后，各组细胞凋亡率分别为（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%,GA+Sora组细胞凋亡率明显高于对照组、GA组和Sora组（P值均<0.05）；处理24 h后，各组细胞迁移率分别为（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%,GA+Sora组细胞迁移率明显低于对照组、GA组和Sora组（P值均<0.05）；处理48 h后，各组穿膜细胞数分别为223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7,GA+Sora组穿膜细胞数低于对照组、GA组和Sora组（P值均<0.05）；与对照组比较，GA组、Sora组和GA+Sora组细胞中MMP-2、MMP-9、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）蛋白表达水平均明显降低（P值均<0.05）,Bcl-2关联X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）蛋白表达水平均明显升高（P值均<0.05）。GA组、Sora组和GA+Sora肿瘤体积和瘤重均比对照组减小（P值均<0.05）；与Sora组比较，GA+Sora组裸鼠肿瘤的体积和质量均明显减少（P值均<0.05）。结论 GA对Sora化疗有增敏作用，其机制可能与GA和Sora联用后促进HepG2细胞凋亡及抑制细胞迁移、侵袭有关。

关键词

癌,肝细胞 / 索拉非尼 / 五倍子酸

Key words

Carcinoma， Hepatocellular / Sorafenib / Gallic Acid

原发性肝癌是源于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，75%～85%以上的原发性肝癌的病理类型为肝细胞癌（以下简称肝癌）^［1-2］。2023年我国肝癌新发病例38.9万，位列恶性肿瘤第四位，年死亡病例33.6万，位居恶性肿瘤第二位^［3］。根治性手术切除是肝癌治疗的主要手段，由于肝癌发病隐匿，70%的患者在确诊时已是中晚期，丧失根治性手术切除机会^［4］。对于肿瘤体积较大、肝内多发、已发生血管、淋巴结或远处转移的晚期肝癌患者，分子靶向药物治疗是标准治疗策略^［5］。索拉非尼（Sorafenib， Sora）是治疗晚期肝癌的一线分子靶向药物^［6］，研究表明Sora可有效延长肝癌患者的总体生存时间，改善生存质量^［7］，但耐药的发生限制了Sora的临床疗效。从药用植物中寻找具有抗肿瘤活性的化合物，将其与抗肿瘤药物联合应用，是抗肿瘤治疗研究的热点^［8］。五倍子酸（gallic acid， GA）是一种存在于山茱萸、五倍子、牡丹皮、掌叶大黄等植物中的天然多酚酸，许多研究表明GA对多种癌细胞具有抗癌活性，包括直肠癌^［9］、肺癌^［10］、乳腺癌^［11］、子宫内膜癌^［12］等。本课题组前期研究显示，GA能显著抑制肝癌细胞生长、迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡和周期阻滞^［13］。本研究拟通过体外实验观察GA与Sora联合应用对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，体内构建裸鼠肝癌模型，探究GA和Sora联合使用是否具有协同增效作用，为提高Sora治疗肝癌的效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人肝癌HepG2细胞株购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Sora、GA购于美国MCE公司，高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，兔抗人B淋巴细胞瘤2原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗体、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗体、小鼠抗人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗体、兔抗人MMP-9抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司，CCK8试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell细胞培养板、基质胶购自美国Corning公司。CO₂细胞培养箱购自美国Thermo公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，酶标仪和SDS-PAGE蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌HepG2细胞置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基中，放于恒温培养箱（5% CO₂，37 ℃）中常规传代培养，维持细胞处于对数生长期。

1.2.2 CCK8法检测细胞活力

5×10³个/孔HepG2细胞接种于96孔板，培养24 h更换100 μL含有不同药物的培养基。GA组以0、25、50、100、150、200、300 μmol/L的浓度梯度干预，Sora组以0、1、2、5、10、20、40 μmol/L的浓度梯度干预，联合应用组以70 μmol/L GA （IC₃₀）^［14］+ Sora（1、2、5、10、20、40 μmol/L）联合使用，设置等量不含药物和细胞的培养基作为空白对照组，每组设5个复孔，药物干预48 h后酶标仪450 nm处检测吸光度值（OD），计算细胞增殖抑制率。CompuSyn软件计算联合指数（combination index， CI）。

1.2.3 克隆形成实验检测细胞增殖能力

1×10³个/孔HepG2细胞接种于6孔板，分为4组：对照组（Control）、GA组（70 μmol/L GA）、Sora组（2 μmol/L Sora）、GA+Sora组（70 μmol/L GA+2 μmol/L Sora）。置于CO₂培养箱培养14 d，4%多聚甲醛溶液固定，PBS缓冲液洗涤3次，结晶紫染色，镜下计数>10个细胞的集落数。实验重复3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

细胞分组方法同1.2.3节。2×10⁵个/孔HepG2细胞接种于6孔板，不同药物干预48 h后收集细胞，严格按照试剂盒染色说明书对细胞染色，流式细胞仪检测并计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%。实验重复3次。

1.2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

细胞分组方法同1.2.3节。1×10⁶个/孔HepG2细胞接种于6孔板，培养24 h后200 μL无菌枪头垂直6孔板底部划痕并加药处理，加药0 h和24 h后倒置显微镜下观察、拍照。Image J软件对划痕距离进行分析，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕间距－24 h划痕间距）/0 h划痕间距×100%。实验重复3次。

1.2.6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力

细胞分组方法同1.2.3节。取不同药物干预48 h的HepG2细胞接种于上室，下室加入含20%胎牛血清的完全培养基600 μL，24 h取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色液染色5 min，棉签擦去上室细胞，待小室干燥后镜下观察，计数穿膜细胞数。

1.2.7 Western Blot法检测HepG2细胞凋亡相关蛋白、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

细胞分组方法同1.2.3节。药物干预48 h后收集细胞，根据细胞沉淀数量分别加入一定体积的RIPA裂解液（含1% PMSF），冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，BCA蛋白定量检测试剂盒法检测蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜，5% BSA封闭4 h，按照抗体说明书配置一抗4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次加入1∶1 000稀释二抗，室温孵育2 h，洗膜3次化学发光试剂显影并拍照。Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.2.8 裸鼠异种移植瘤模型

SPF级雄性裸鼠30只（6周龄，体质量18～22 g）购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（吉）2020-0002，实验动物使用许可证编号：SYXK（吉）2021-0020。收集HepG2细胞，磷酸缓冲盐溶液制备成细胞悬液，皮下注射0.2 mL（含5×10⁶ HepG2细胞）细胞悬液到裸鼠背部右下方。植瘤6 d后按照肿瘤大小顺序蛇形均衡分为4组：对照组（Control）、GA组、Sora组和GA+Sora组，每组7只。GA和Sora的体内给药剂量和方式参考文献［15］和［16］，按照GA组（80 mg/kg GA）、Sora组（20 mg/kg Sora）、GA+Sora组（80 mg/kg GA+20 mg/kg Sora）的浓度给药。按照上述药物浓度隔天给药1次（灌胃体积按照0.1 mL/10 g标准计算），对照组给予生理盐水。监测裸鼠活动及一般状态，每周测量1次肿瘤大小和质量，根据公式肿瘤体积=长径×短径²/2，估算肿瘤体积。药物干预21 d，处死裸鼠，取肿瘤称重。

1.3 统计学方法

Graphpad Prism 7.0软件计算药物30%细胞生长抑制浓度（30% inhibition concentration， IC₃₀）和半数抑制浓度（50% inhibition concentration， IC₅₀）。采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以 \overline{x}±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GA与Sora联用对HepG2细胞增殖抑制作用

不同浓度GA、Sora，以及两药联合对HepG2细胞增殖均有抑制作用，且具有浓度依赖性。GA和Sora作用HepG2细胞48 h的IC₅₀值分别为（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L，Sora与70 μmol/L GA（IC₃₀）联用后，IC₅₀降至（2.06±0.35）μmol/L。利用CompuSyn软件计算CI值，不同浓度Sora与70 μmol/L GA联合用药CI值均<1，说明GA与Sora联合使用具有协同作用（表1）。根据药物联用选择原则^［17］（CI>1拮抗，CI=1叠加，0.6<CI<1协同，CI<0.6强协同）确定70 μmol/L GA与2 μmol/L Sora为后续实验联合用药组药物浓度，作用时间48 h。

2.2 GA与Sora联用对HepG2细胞增殖能力的影响

加药处理后各组细胞培养14 d，GA+Sora组细胞克隆数（73.0±7.6）明显低于对照组（234.0±20.4）、GA组（147.0±12.1）和Sora组（129.3±13.3）（P值均<0.05）（图1）。

2.3 GA与Sora联用对HepG2细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染实验结果（图2）显示，对照组、GA组、Sora组和GA+Sora组细胞凋亡率分别为（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%。与对照组比较，GA组、Sora组、GA+Sora组细胞凋亡率均明显升高（P值均<0.05）；与GA组、Sora组比较，GA+Sora组细胞凋亡率显著升高（P值均<0.05）。

2.4 GA和Sora联用对HepG2细胞迁移能力的影响

加药处理24 h后，对照组、GA组、Sora组和GA+Sora组细胞迁移率分别为（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%。与对照组比较，GA组、Sora组和GA+Sora组细胞迁移率均降低（P值均<0.05）；GA组与Sora组细胞迁移率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与GA组、Sora组比较，GA+Sora组细胞迁移率降低（P值均<0.05）（图3）。

2.5 GA与Sora联用对HepG2细胞侵袭能力的影响

Transwell实验24 h后，对照组、GA组、Sora组和GA+Sora组HepG2细胞穿膜细胞数分别为223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7，与对照组比较，GA组、Sora组和GA+Sora组穿膜细胞数均降低（P值均<0.05）；与GA组、Sora组比较，GA+Sora组穿膜细胞数明显降低（P值均<0.05）（图4）。

2.6 GA与Sora联用对HepG2细胞MMP-2、MMP-9和凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较，GA组、Sora组和GA+Sora组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平均降低（P值均<0.05），凋亡相关蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达均增加（P值均<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P值均<0.05）；与GA组和Sora组比较，GA+Sora组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平均明显降低（P值均<0.05），凋亡相关蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达均增加（P值均<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P值均<0.05）（图5，表2）。

2.7 GA与Sora联用对裸鼠肿瘤生长的影响

4组裸鼠在喂养过程中，精神、饮食及排便均比较正常，体质量在喂养过程中增加，其中GA组和GA+Sora组体质量增加较多，其次为Sora组，Sora组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，GA组、Sora组及GA+Sora组均显著抑制裸鼠肿瘤的生长和肿瘤大小（P值均<0.05）；与Sora组比较，GA+Sora组裸鼠肿瘤的体积和质量明显减少（P值均<0.05）（图6）。

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性实体肿瘤^［18］。Sora是治疗晚期肝癌的一线靶向药物，具有抑制肿瘤细胞增殖及阻断肿瘤血管生成的双重抗肿瘤作用^［19］。多项国际性临床试验结果表明Sora可延长晚期肝癌患者生存期、提高生存质量，但耐药性和毒副作用限制了其临床应用。据报道，许多从中草药提取的小分子与化疗药物联合使用时表现出了增强的临床疗效^［20-21］。GA具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病等多种药理活性。张仲卫等^［22］研究结果表明，GA联合顺铂在体内外均具有协同抗食管癌的作用。杨勤龙^［23］使用含有GA成分的中药大黄蛰虫丸治疗食管癌患者，患者病情逐渐好转。本研究前期结果显示，GA对肝癌细胞的生长、迁移和侵袭均具有显著的抑制作用，并通过线粒体途径促进肝癌细胞凋亡^［13］。这些结果提示，GA可与其他化疗药物联合应用于肿瘤治疗。本实验首先观察GA联合Sora抑制HepG2细胞增殖的协同抑制作用，结果显示，GA与Sora对肝癌HepG2细胞增殖均具有抑制作用，两药联合对HepG2细胞抑制作用更明显。Sora作用HepG2细胞48 h的IC₅₀值为（9.87±0.98）μmol/L，与70 μmol/L GA（IC₃₀）联合用药后，IC₅₀降至（2.06±0.35）μmol/L，且不同浓度Sora与70 μmol/L GA联合用药CI值均<1。为进一步证实GA与Sora联合体内协同抗肝癌作用，本研究在裸鼠肝癌移植瘤模型中测定了GA单药组（80 mg/kg）、Sora单药（20 mg/kg）组及GA（80 mg/kg）和Sora（20 mg/kg）联用组的肿瘤生长情况，结果显示，与对照组、GA或Sora单药组相比，联用组则肿瘤体积明显减少，GA与Sora联合应用抗肿瘤效果最佳。体外、体内实验结果均提示GA联合Sora有协同抗肝癌作用，可降低Sora剂量，减少不良反应，这对于临床用药有重要的指导意义。

Sora是一种多靶点抗肿瘤药，其药理机制之一是通过抑制Raf/Mek/Erk信号转导通路抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡。本研究从细胞凋亡角度观察GA化疗增敏作用及可能机制，结果显示，GA与Sora联用可显著增加HepG2细胞凋亡比例。Bcl-2蛋白家族是线粒体途径凋亡的主要调控因子，家族中的Bcl-2是一个主要的抑凋亡蛋白，通过阻止线粒体细胞色素C的释放发挥抗凋亡作用，Bax是主要的促凋亡蛋白，通过增加线粒体膜通透性，释放细胞色素C而引起凋亡发生^［24］。Bax蛋白的高表达、Bcl-2蛋白的低表达作用于线粒体，导致线粒体膜通透性转运孔开放，细胞色素C、Smac等凋亡相关因子释放入胞浆，进而激活Caspase-3，引起细胞凋亡^［25］。本研究发现GA对Sora化疗增敏的作用机制与升高促凋亡蛋白Bax表达、降低抑凋亡蛋白Bcl-2表达，增加凋亡蛋白Caspase-3的活化有关。

肿瘤细胞转移是癌症死亡的主要原因，肝癌的高死亡率与肝癌细胞的高转移和高侵袭力密切相关^［26］。本研究划痕抑制和Transwell侵袭实验结果显示，GA和Sora单药对HepG2细胞迁移和侵袭能力的抑制作用较弱，联用后可显著降低HepG2细胞凋亡迁移和侵袭能力。细胞外基质降解和穿透基底膜是肿瘤发生侵袭和转移的关键步骤，MMP能够降解基底膜和细胞外基质中的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和弹性蛋白等成分，从而促进癌细胞对邻近和远端组织的迁移和侵袭^［26］。研究显示MMP-2和MMP-9与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关^［27］。Western Blot分析结果显示联合用药组MMP-2和MMP-9表达水平显著降低，GA与Sora联用可通过降低MMP-2和MMP-9蛋白的表达，抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，本研究发现GA与Sora在体内、体外抗肝癌作用上均发挥协同作用，这种协同作用可能与促进肝癌细胞凋亡、抑制迁移和侵袭有关。这些结果提示将GA与Sora联合使用可能是一个有前景的肝癌临床治疗策略。课题组后续将从细胞迁移、侵袭信号通路及动物实验等角度进一步深入探索GA对Sora化疗增敏的作用机制，以期为临床提高肝癌治疗效果提供实验依据。

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