层粘连蛋白α3亚基（LAMA3）对胰腺癌上皮间质转化、侵袭和转移能力的影响

Effect of laminin subunit α3 on epithelial-mesenchymal transition， invasion， and metastasis abilities of pancreatic cancer

摘要

目的 探索层粘连蛋白α3亚基（LAMA3）对胰腺癌（PC）上皮间质转化（EMT）、侵袭和转移能力的影响。方法 综合分析肿瘤和EMT相关数据库，筛选出与PC相关的EMT基因LAMA3。通过qRT-PCR和Western Blot检测LAMA3在PC组织和细胞系中的表达水平，免疫荧光确定LAMA3在PANC-1细胞中的定位，Transwell实验评估LAMA3对PC细胞侵袭和迁移能力的影响。计量资料组间比较采用t检验。结果 利用TCGA数据库筛选出3个EMT相关PC致癌因子LAMA3、AREG和SDC1。LASSO-Cox回归模型显示，LAMA3对PC预后影响最为显著（风险评分=0.256 1×LAMA3+0.043 1×SDC1+0.071 4×AREG）。Cox回归模型和列线图显示，LAMA3的高表达是PC不良预后的独立危险因素（HR=1.32,95%CI:1.07～1.62,P<0.01）。实验结果显示，相对于正常胰腺组织，LAMA3在PC组织中的表达显著上调。相对于HPDE细胞株，LAMA3在PC细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990中的表达均有不同程度的升高，其中在PANC-1细胞中的表达最高。富集分析表明，LAMA3与EMT、胶原代谢、细胞外基质降解、TGF-β通路和PI3K通路等生物过程和信号通路相关。敲低LAMA3后，N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达水平下降，而E-Cadherin的表达水平上升。Transwell实验结果显示，LAMA3敲低后，PANC-1细胞的侵袭和迁移能力明显减弱。结论 LAMA3在PC中高表达，促进PC细胞EMT、侵袭和迁移，可能是PC的新型诊断标志物和基因治疗靶点。

关键词

胰腺肿瘤 / 层粘连蛋白 / 上皮-间质转化 / 肿瘤浸润 / 肿瘤转移

Key words

Pancreatic Neoplasms / Laminin / Epithelial-Mesenchymal Transition / Neoplasm Invasiveness / Neoplasm Metastasis

胰腺癌（pancreatic cancer， PC）是一种具有高度侵袭性和致死率的恶性肿瘤，常在晚期才被诊断出来且治疗难度大，患者生存率极低^［1］。PC细胞的强侵袭性和高度转移能力是治疗失败的主要原因之一。在PC扩散和转移过程中，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）起着至关重要的作用^［2］。EMT使上皮细胞转变为间质细胞，使其脱离原有组织结构，获得更强的运动和侵袭能力，从而显著加速癌细胞的扩散与转移^［3］。

层粘连蛋白是一种由α、β和γ链组成的异三聚体蛋白^［4］，广泛存在于基底膜中，通过与细胞表面受体结合，在细胞外基质和细胞之间形成桥梁，帮助肿瘤细胞在体内扩散，在细胞黏附、迁移和信号传导等过程中发挥重要作用。层粘连蛋白α3亚基（laminin subunit alpha 3， LAMA3）是层粘连蛋白-332复合物的一部分，在组织结构支架的形成以及多种细胞功能中起着重要作用^［5］，其突变或表达异常与多种疾病相关。例如，LAMA3基因缺陷与交界性表皮松解型大疱症有关，这种遗传性皮肤病表现为皮肤和黏膜脆弱、易损伤^［6］。此外，LAMA3可以与整合素等多种细胞表面受体结合调节癌细胞活性，在肿瘤细胞侵袭和迁移中起着关键作用^［7-8］。然而，LAMA3在PC中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨LAMA3在调节PC细胞EMT、侵袭和迁移中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞

PC细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990及正常人胰腺导管上皮细胞HPDE购买于中国科学院细胞库。通过细胞STR鉴定，无细菌、支原体污染。

1.2 药品与试剂

DMEM、RPMI-1640培养基、青/链霉素均购自Gibco公司（美国）；10%胎牛血清购自Gemini公司（美国）。0.25%胰蛋白酶购自上海奕杉生物科技有限公司（中国）。cDNA逆转录试剂盒、SYBR^®Premix ExTaq™购自TaKaRa公司（日本）。LAMA3、α-Tubulin引物及LAMA3小干扰RNA由上海生工生物工程有限公司（中国）设计并合成。RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶试剂盒、EDTA抗原修复液、牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司（中国）。ECL化学发光试剂购自Millipore公司（美国）。Lipofectamine 3000试剂盒购自Invitrogen公司（美国）。DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司（中国）。LAMA3、α- Tubulin、E-Cadherin、N-Cadherin、Snail和Vimentin抗体购自武汉三鹰生物工程公司（中国）。

1.3 仪器

NanoDrop微量紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher公司；倒置荧光显微镜及照相系统购自日本Nikon公司；化学发光成像系统和实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4 筛选EMT相关PC基因

首先，从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas， TCGA）数据库^［9］中获取并整理TCGA-PAAD项目的RNAseq数据及相应的临床资料。利用R软件（版本4.2.1）中的“DESeq2”包对原始Counts矩阵进行差异表达分析。根据LAMA3表达量进行分组，定义标准为：表达量在0～50%为低表达组，表达量在51%～100%为高表达组，使用“survival”包进行批量拟合Cox回归分析。整理并获取298个PC基因在PC中高表达，并引起较差的总生存期（overall survival， OS）、疾病特异性生存期（disease-specific survival， DSS）和无进展生存期（progression-free interval， PFI））。在基因富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）数据库^［10］中下载并整理了200个EMT相关基因。将298个PC基因与200个EMT相关基因取交集。

1.5 利用LASSO回归构建PC预后模型

基于TCGA-PAAD数据库的信息，将LAMA3、AREG和SDC1的表达数据纳入LASSO回归模型中进行特征选择。使用“glmnet”包的算法，应用10倍交叉验证来确定最优正则化参数（λ），以确保模型的稀疏性。选定的特征通过LASSO回归得到后，进一步利用“survival”包构建多因素Cox回归分析模型。使用“step”函数进行逐步回归，以选择最有意义的变量，进而确定最终的预后模型。利用Log-rank检验和单变量Cox回归分析评估该模型的预测性能。绘制Kaplan-Meier生存曲线，并计算风险比（HR）及95%CI。利用“timeROC”包生成不同时间点的受试者操作特征曲线（ROC曲线），以评估模型在1年、3年和5年的预测准确性。

1.6 利用列线图构建PC预后模型

基于TCGA数据库进行单变量Cox回归分析，以评估每个参数在总生存率中的影响。将显著变量纳入多变量Cox回归模型。利用“forestplot”包，将上述Cox回归分析结果在森林图中进行可视化。应用“rms”包构建列线图模型，预测患者总生存率。

1.7 探究LAMA3表达与PC患者临床预后的关系

从TCGA数据库和基因型-组织表达（genotype-tissue expression， GTEx）数据库^［11］中获取179个PC组织样本和171个癌旁组织样本的LAMA3基因表达数据，以及这些患者的临床信息。从基因表达汇编（gene expression omnibus， GEO）数据库^［12］中获取了四个微阵列表达数据集：GSE62452、GSE16515、GSE28735和GSE15471。使用“ggplot2”包分析LAMA3在PC中的表达情况及其与临床病理参数的关系。使用“survival”包进行比例风险假设检验和生存回归模型拟合，并利用“ggplot2”和“survminer”包对结果进行可视化处理。此外，从人类蛋白质图谱（human protein atlas， HPA）数据库^［13］中获取PC和癌旁组织切片样本中LAMA3基因的蛋白表达情况和亚细胞定位信息。使用单因素Cox回归模型评估每个变量对生存时间的影响。使用多因素Cox回归模型，在控制其他变量的影响后，评估每个变量的独立作用，计算HR、95%CI和P值。

1.8 组织样本收集和免疫组织化学染色（IHC）

在贵州医科大学附属医院收集了10例PC患者的PC组织和癌旁组织。所有患者术前均未接受过放化疗、靶向或免疫治疗。收集的组织样本固定超过24 h后，进行梯度脱水、包埋、制备组织切片。切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡及水化处理，然后进行抗原修复。5%牛血清白蛋白封闭后，添加一抗孵育过夜。二抗孵育完成后，DAB显色、苏木素核染。最后进行脱水、透明处理和封片。IHC评分由两位病理学家根据染色强度和阳性细胞比例评估得出。染色强度按4分制评估（0分：阴性，1分：弱阳性，2分：阳性，3分：强阳性）。阳性细胞的占比按5分制评估：<1%记0分，1%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。染色强度分数×阳性细胞比例分数=最终评分。

1.9 细胞培养

HPDE、PANC-1、MIA PaCa-2细胞株培养于DMEM培养基，AsPC-1、BxPC-3、SW1990细胞株培养于RPMI 1640培养基。培养基中均添加10%FBS和1%青/链霉素。所有细胞均放置在37 ℃ 5%CO₂+95%空气的恒温培养箱中培养。

1.10 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

提取总RNA后，将其逆转录获得cDNA，然后进行qRT-PCR实验。利用实时荧光定量PCR仪进行检测。设置参数：95 ℃ 30 s，预变性；95℃ 5 s变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 20 s延伸，40个循环。反应得到的各个孔的CT值，以α-Tubulin为内参，检测各组细胞中LAMA3扩增效率，使用2^-ΔΔCt方法计算细胞LAMA3的相对表达量。

1.11 蛋白质印迹检测（Western Blot）

提取总蛋白后，将等量的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离、转移到PVDF膜上。封闭完成后置于一抗中，4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后，利用化学发光成像系统显影蛋白并保存图像。

1.12 细胞转染与分组

按照使用说明将siRNA使用无酶水溶解，配置成工作液。选用LAMA3内源性表达相对高的PANC-1细胞作为实验对象，当细胞密度生长至60%～70%时，利用相应的siRNA和lipofectamine 3000进行转染。将PANC-1细胞分为4个组：si-Control组、si-LAMA3#1组、si-LAMA3#2组、si-LAMA3#3组。使用qRT-PCR、Western Blot验证转染效率。

1.13 Transwell侵袭和迁移实验

Transwell迁移实验：根据分组将细胞悬液加入Transwell上室，同时加入DMEM培养基至Transwell小室的下室，然后将Transwell小室置于37 ℃ 5%CO₂+95%空气的恒温培养箱中培养。24～48 h后取出小室，无菌棉签小心擦除上室内的细胞，0.3%结晶紫室温下染色10～15 min，PBS清洗后，将小室放入烘箱，烘干小室。在倒置显微镜下进行拍照和计数。在Transwell侵袭实验中，提前在小室内铺设基质胶（Matrigel胶∶无血清DMEM=1∶8）。上下振动以确保胶体铺匀，其余操作方法同Transwell迁移实验。

1.14 细胞免疫荧光实验

细胞爬片后，PBS清洗、甲醛溶液固定爬片30 min，PBST液浸洗爬片3次，加入适量0.5% TritonX-100室温破膜20 min。封闭后，加入LAMA3抗体置于4 ℃环境下孵育过夜。第二天加入同种属的荧光二抗室温避光孵育2 h。DAPI室温避光孵育10 min。荧光显微镜下观察，拍照记录荧光染色情况。

1.15 统计学方法

采用R软件（版本4.2.1）、GraphPad Prism 8.0或SPSS 25.0统计软件对数据进行分析。计量资料采用 \overline{x}±s表示，2组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选EMT相关PC基因

为了筛选出与EMT相关的PC基因，首先利用TCGA-PAAD的数据，鉴定出在PC中过表达并导致患者预后不良的基因。结果显示，共有298个潜在的PC相关基因（图1a）。随后，将GSEA数据库中与EMT相关的200个基因与上述298个潜在的PC基因取交集。结果显示，LAMA3、AREG和SDC1可能是与EMT相关的PC基因（图1b）。

2.2 利用LASSO回归构建PC预后模型

为了研究上述3个基因对PC患者预后的影响，将LAMA3、AREG和SDC1纳入LASSO-Cox回归模型以筛选出最佳候选基因。结果显示，LAMA3、AREG和SDC1在LASSO-Cox模型中的对数λ值均达到最佳区域（图2a、b）。将这3个基因作为特征构建基于OS的预测模型。风险评分=0.256 1×LAMA3+0.043 1×SDC1+0.071 4×AREG。根据该模型绘制了风险评分分布图和Kaplan-Meier生存曲线图（图2c、d）。结果显示，患者的生存情况根据其风险评分显著分层。根据风险评分的高低，分为高风险评分组和低风险评分组。高风险评分组患者的OS显著降低，低风险评分组患者的OS显著增加（Log-rank检验：P<0.05，高风险组HR=2.195，95%CI：1.431～3.367）。时间相关的ROC曲线分析显示，该模型在1年、3年和5年时间点的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.719、0.692和0.824（图2e），表明模型在这些时间点上具有较高的预测准确性。以上结果表明，以LAMA3、AREG和SDC1构建的预后模型可以有效评估PC患者的预后风险，其中LAMA3的权重最高，对PC预后影响最为显著。

2.3 利用列线图构建PC预后模型

单因素Cox回归分析显示，AREG、LAMA3、SDC1的高表达和临床病理分级均与PC患者较差的预后相关（P值均<0.05），对应的HR分别为1.272 15、1.457 19、1.297 06和1.453 34（图3a）。进一步多因素Cox回归分析显示，LAMA3基因的高表达是PC的独立预后因素（HR=1.32，95%CI：1.07～1.62，P<0.01）（图3b）。C指数为0.644（P<0.05），表明该模型具有较好的预后预测能力（图3c）。通过对患者1年和3年生存率预测发现，列线图模型预测生存率与实际观察到的生存率高度一致（图3d）。综上所述，LAMA3基因在预后预测中表现出明确且独立的预测作用，这进一步强化了LAMA3作为潜在预后标志物的价值。

2.4 LAMA3与PC临床病理和预后之间的关系

进一步分析显示，LAMA3在PC中的表达水平显著升高（图4a～f）。此外，LAMA3表达水平越高，PC的T分期（P<0.05）（图4g）、N分期（图4h）和M分期（图4i）均显示出晚期趋势。同时，Ⅱ期PC患者LAMA3表达水平显著高于Ⅰ期（P<0.05）（图4j），Ⅳ期PC患者LAMA3表达水平高于Ⅲ期（图4k）。LAMA3表达水平与PC患者的病理分级程度也呈正相关（P<0.05）（图4l）。然而，由于PC病例数量有限，N1/N0、M1/M0以及Stage Ⅳ/Stage Ⅲ之间未显示出显著的统计学差异。LAMA3基因高表达与患者的不良OS（图4m）、DSS（图4n）和PFI（图4o）相关（P值均<0.05）。同时，单因素Cox回归分析示，临床分期、病理分级和LAMA3的表达水平与PC患者较差的OS相关（P值均<0.05）；多因素Cox回归分析示，LAMA3的高表达和临床N分期与PC患者较差的OS相关（P<0.05）（表1）。综上所述，LAMA3的高表达与PC患者的临床分期、病理分级及预后密切相关，LAMA3可能是PC中有潜在研究价值的致癌因子。

2.5 LAMA3在PC组织和细胞系中高表达

收集10例PC组织及配对的癌旁胰腺组织进行IHC实验发现，LAMA3在PC组织中的表达水平高于配对的癌旁组织（图5a、b），这与HPA数据库中的信息一致（图5c）。此外，与HPDE细胞相比，LAMA3在几种PC细胞系中的表达均显著增加，其中，PANC-1细胞的LAMA3表达水平最高（图5d、e）。因此，后续选择PANC-1细胞进行实验。

2.6 LAMA3的亚细胞定位情况

在PANC-1细胞中进行免疫荧光实验以了解LAMA3基因的亚细胞定位情况。结果显示，在PANC-1细胞中，LAMA3主要定位于细胞质（图6a）。这一观察与HPA数据库中A-431细胞LAMA3的亚细胞定位数据一致（图6b～g）。红、蓝、绿三色通道合并后的结果显示，LAMA3在细胞内的定位主要集中在内质网区域。既往研究显示，LAMA3在细胞外基质中发挥重要作用，包括参与细胞与细胞外基质的黏附、信号传导和细胞迁移等过程^［14］。上述结果表明，LAMA3可能主要在内质网中完成自身的合成、折叠和组装，随后被分泌到细胞外基质中，发挥其功能。

2.7 LAMA3调节PC细胞EMT、侵袭和迁移能力

首先，利用TCGA数据库中的信息，通过ssGSEA算法，计算每条通路上LAMA3的富集分数，得到LAMA3和EMT相关通路之间的联系（图7a～f）。结果表明，LAMA3与EMT、胶原代谢、细胞外基质降解等相关。TGF-β通路、PI3K通路在EMT过程中扮演关键的调控角色，LAMA3基因与这些通路存在明显的正相关性。这些结果初步提示LAMA3可能参与PC细胞的EMT、侵袭和迁移。其次，设计3条小干扰RNA并转染至PANC-1细胞中，以研究LAMA3对PC细胞的调控作用。结果表明，si-LAMA3#3的沉默效果最好（图7g、h）。LAMA3敲低后，N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达水平下降，E-Cadherin的表达水平升高（图7i），PANC-1的侵袭和迁移能力减弱（图7j、k）。综上所述，LAMA3可能通过调控EMT从而影响PC细胞的侵袭和迁移能力。

3 讨论

早期PC通常缺乏明显症状，患者往往在诊断时已处于晚期，导致治疗变得更加复杂和困难^［15］。传统治疗方式在晚期PC中的效果有限^［16］。为了有效应对这一重大挑战，探索可靠的PC生物标志物和治疗靶点，并深入揭示其疾病机制不仅有助于早期诊断，还为个性化治疗提供了新的方向。

EMT是肿瘤转移过程中的一个关键生物学过程。在EMT过程中，上皮细胞失去极性和紧密连接，获得了间质细胞的迁移和侵袭特性^［17］，这种转变使肿瘤细胞能够突破基底膜，侵入周围组织和血流，进而在身体其他部位形成转移灶。此外，EMT还与肿瘤细胞的干细胞特性和耐药性密切相关^［18］。这些特性不仅提高了肿瘤细胞的恶性度，还使其在应对化疗和靶向治疗时更具抵抗力。因此，EMT在肿瘤的多阶段进程中起到了不可或缺的推动作用。在PC的发展过程中，EMT被认为是其高度侵袭性和早期转移能力的重要机制^［19-20］。EMT过程中的关键调控因子，如Twist1^［21］，能够促进EMT过程，加速癌细胞迁移和侵袭。其他EMT相关因子如Snail1^［22］和Vimentin^［23］在PC中也表达上调，与患者的不良预后显著相关。这表明在PC进展中EMT显著影响其生物学行为和临床结局。因此，探索EMT在PC中的调控机制变得尤为重要。

基于TCGA数据库的研究结果显示，LAMA3、AREG和SDC1可能是PC中调控EMT过程的关键靶点。相比之下，EMT相关基因LAMA3可能是PC预后中最关键的靶点。层粘连蛋白是一个庞大的异源三聚糖蛋白家族，由5条α链（LAMA1～5）、3条β链（LAMB1～3）和3条γ链（LAMC1～3）的不同组合组装成交叉样结构^［24］。例如，层粘连蛋白-332由α3、β3和γ2链组成，与整合素α6β1结合后，可导致p190 RhoGAP的酪氨酸磷酸化，从而刺激侵袭所需的突起形成和对细胞外基质的降解^［25］。大量证据表明，层粘连蛋白的异常表达与多种癌症的生物学特征和临床预后相关。Ning等^［26］发现，LAMA3与METTL3互作，促进口腔鳞状细胞癌的恶性进展。沉默LAMA3可以抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和EMT过程^［27］。此外，LAMA3的表达水平和碱基突变可以改变层粘连蛋白的水平，从而对卵巢癌的发病和预后产生影响^［28］。然而，LAMA3在PC中的作用尚不清楚。通过实验表明，LAMA3在PC组织和细胞系中高表达，在细胞内的定位主要集中在内质网区域，这表明LAMA3可能主要在内质网中完成自身的合成、折叠和组装，随后被分泌到细胞外基质中，参与细胞与细胞外基质的黏附、信号传导和细胞迁移等过程。进一步的ssGSEA分析显示，LAMA3与EMT相关通路存在显著正相关。通过Western Blot实验发现，敲低LAMA3使EMT间质标志物的表达增加，而上皮标志物的表达减少，抑制了PC细胞的侵袭和迁移能力。因此，LAMA3可能通过影响EMT过程，调控PC细胞的侵袭和迁移能力，是一个潜在的基因治疗靶点。

虽然本研究揭示了LAMA3在PC中的重要性，但依然仍存在一些局限性。首先，本研究主要依赖于生物信息学分析。此外，虽然在临床样本中测量了LAMA3的表达水平，但缺乏其与患者预后的深入关联研究。最后，LAMA3如何具体影响PC的EMT过程仍需进一步探讨。

综上所述，本研究利用生物信息学手段筛选了EMT相关PC基因LAMA3。LAMA3在PC中表达上调，可能通过调控EMT过程进而影响PC细胞的侵袭和迁移能力。因此，LAMA3有望成为一种新的诊断标志物和基因治疗靶点。

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