非酒精性脂肪性肝病合并幽门螺杆菌感染患者肠道菌群特征分析

Features of intestinal flora in patients with nonalcoholic fatty liver disease and Helicobacter pylori infection

摘要

目的 通过比较健康人群、幽门螺杆菌（HP）感染患者、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者以及HP感染合并NAFLD患者的肠道菌群变化特点，探讨NAFLD合并HP患者肠道菌群特征及作用机制。方法 选取河南科技大学第二附属医院2023年3月1日—2024年4月30日收治的NAFLD患者19例（NAFLD组）、HP感染患者19例（HP组）、NAFLD合并HP感染患者19例（NAFLD合并HP组），另选取健康体检者20例作为对照。留取粪便标本，提取标本的总DNA，进行PCR扩增，通过16S rDNA测序，分析4组人群肠道菌群特征及差异性。计量资料多组间比较采用方差分析，计数资料多组间比较采用χ2检验。菌群物种之间差异性分析采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。结果 NAFLD合并HP组与其他3组相比，肠道菌群丰富度有降低趋势。NAFLD合并HP组与NAFLD组相比、NAFLD组与健康对照组相比，菌群分布具有明显差异性（P值均<0.05）。在门水平上，NAFLD合并HP组占前3位的物种分别为厚壁菌门（59.94%）、变形菌门（17.00%）、放线菌门（14.75%），相比于其他3组，变形菌门占比增加，放线菌门占比减少。在属水平上，NAFLD合并HP组的前5位优势菌属分别为Bifidobacterium、Streptococcus、Escherichia-Shigella、Agathobacter、Ruminococcus gnavus＿group。与NAFLD组相比，NAFLD合并HP组Streptococcus、Veillonella、Rothia的丰度升高，Dialister、Ruminococcus toraues＿group的丰度降低。与HP组相比，NAFLD合并HP组Collinsella、Subdoligranulum、Catenibacterium、Porphyromonas的丰度降低，而Citrobacter、Olsenella的丰度升高，物种差异性分析均具有统计学意义（P值均<0.05）。结论 NAFLD合并HP感染患者的肠道菌群发生相应变化，这些菌群可能是HP感染促进NAFLD发生、发展的肠道微生态因素。

关键词

非酒精性脂肪性肝病 / 幽门螺杆菌 / 胃肠道微生物组

Key words

Non-alcoholic Fatty Liver Disease / Helicobacter Pylori / Gastrointestinal Microbiome

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明确的致损肝因素后，肝细胞内脂肪过度沉积进而引起一系列症状的临床病理综合征，目前是全球发病率最高的慢性肝病。NAFLD可由简单的脂肪变性发展到脂肪性肝炎、肝硬化，甚至是肝细胞癌，严重影响人类健康。近年来研究表明，肠道菌群在NAFLD的发生、发展中起重要作用，当肠道菌群结构或分布出现异常时，宿主的能量吸收及储存脂肪的平衡被打破，加重机体代谢紊乱程度^［1］。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一种常见的寄居在胃黏膜的革兰阴性螺杆菌，有研究表明，HP感染与代谢综合征、NAFLD等关系密切，HP感染患者的NAFLD发生率明显升高，HP感染可能是NAFLD的独立危险因素^［2-4］。故本研究从肠道微生物的角度入手，结合16S rDNA高通量测序技术研究NAFLD合并HP感染患者的肠道菌群变化，寻求NAFLD合并HP感染患者的风险因素和新型生物标志物，以及HP感染增加NAFLD患者发生、发展的肠道菌群因素，以期为NAFLD的综合治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取本院2023年3月1日—2024年4月30日消化内科门诊、住院部的NAFLD合并/不合并HP感染患者、单纯HP感染患者，另选取同期健康体检人群作为对照。纳入标准：（1）年龄18～60岁；（2）NAFLD诊断符合《代谢相关（非酒精性）脂肪性肝病防治指南（2024年版）》^［5］。排除标准：（1）合并其他类型肝病；（2）有胃肠道及肝胆手术史；（3）近3个月内服用抑酸剂、抗生素、胃黏膜保护剂、微生态制剂、中药等；（4）有严重心、肝、肺疾病或其他恶性疾病；（5）精神障碍；（6）肝硬化。

1.2 标本采集

留取所有纳入研究对象的粪便样品，收集后冻存于中心实验室-80 ℃冰箱中备用。

1.3 实验方法

取出粪便样品，采用OMEGA Stool DNA Kit试剂盒提取总DNA，测定其浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量，检测合格的DNA用于后续实验。根据16S rDNA序列中的保守区域设计相应引物，以提取好的微生物总DNA为模板，使用Phusion酶进行PCR，扩增35个循环，通过PCR在目标区域扩增产物上添加测序通用接头和样本特异性Barcode序列。PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收。对纯化后的PCR产物使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent，美国）和 Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒进行评估，合格的文库浓度应在2 nmol/L以上。将合格的上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按照相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250 bp的双端测序，相应试剂为NovaSeq 6000 SP Reagent Kit （500 cycles）。

1.4 生物信息学分析

测序得到原始的下机数据，进行拼接、质控、嵌合体过滤，获得高质量的clean data。DADA2（divisive amplicon denoising algorithm）通过“去重复”（dereplication，相当于以100%相似度聚类）等步骤，进而获得单碱基精度的代表序列。过滤和去噪后获得ASV（amplicon sequence variant）特征序列和ASV丰度表格，进行α多样性分析和β多样性分析。根据ASV序列文件采用SILVA和NT-16S数据库进行物种注释，并通过ASV丰度表对各层级物种在各样本中的丰度进行统计。使用KEGG通路数据库（https://www.kegg.jp/）分析预测肠道菌群生物代谢通路。

1.5 统计学方法

应用R 4.1.3软件进行统计学分析，主要涉及Venn Diagram、ggplot2等程序包。计量资料多组间比较采用方差分析。计数资料多组间比较采用χ ²检验。基于得到的物种丰度统计信息，进行各组之间的差异分析，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。在分类水平上，4组通过线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）>3.0且P<0.05，得到最终的差异物种。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

共入组77例研究对象，其中NAFLD组19例，NAFLD合并HP组19例，HP组19例，健康对照组20例。4组一般资料比较，ALT、BMI差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表1）。

2.2 物种丰度

图1为测序后16S rDNA序列长度分布，均为400～500 bp。图2为物种等级曲线图，每条线代表一个样本，不同的颜色代表不同的分组，可以从4组样本中获得足够的测序信息。

2.3 各组肠道菌群组成

按照97%的相似性，将4组的77个样本获得有效序列聚类成可操作的物种分类单元（operational taxonomic units，OTUs），共得到4 927个OTUs。绘制Venn图，结果显示，健康对照组独有OTUs数目最多，HP组次之，NAFLD合并HP组最少；475个OTUs为4组共有，611个OTUs为NAFLD合并HP组特有（图3）。

2.4 α多样性分析

在α多样性方面，Chao1指数结果显示，组间差异无统计学意义（P>0.05），但NAFLD合并HP组的肠道菌群丰富度与其他3组相比有下降趋势（图4）。

2.5 β多样性分析

通过主成分分析进行肠道菌群β多样性分析，结果显示，NAFLD合并HP组与NAFLD组相比（图5）、NAFLD组与健康对照组相比（图6），菌群分布均具有明显差异性（P值均<0.05）。

2.6 相似性分析

通过杰卡德相似性分析检验组间差异是否显著大于组内差异，结果如图7所示，差异有统计学意义（P=0.001），表明分组有意义。

2.7 物种组成分析

根据物种丰度表和物种注释表，选取丰度前30（有明确分类信息的丰度最高的前30个）物种分类，将每个分组的相对丰度进行不同形式的展示。如图8所示，在门水平上，4组样本最大丰度均处于前5位的物种分布为Firmicutes、Actinobacteriota、Proteobacteria、Bacteroidota、Verrucomicrobiota，其中以厚壁菌门、放线菌门、变形菌门为主。在门水平上，NAFLD合并HP组占前3位的物种分别为厚壁菌门（59.94%）、变形菌门（17.00%）和放线菌门（14.75%），其余3组占前3位的物种顺序依次均为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门。如图9所示，在属水平上，4组样本占前10位的优势菌群分别为Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Faecalibacterium、Agathobacter、Collinsella、Ruminococcus gnavus_group、Klebsiella、Bacteroides、Subdoligranulum。其中，NAFLD合并HP组前5位优势菌属分别为Bifidobacterium（11.94%）、Streptococcus（9.68%）、Escherichia-Shigella（9.44%）、Agathobacter（6.57%）、Ruminococcus gnavus_group（6.21%）；NAFLD组前5位优势菌属分别为Bifidobacterium（21.46%）、Faecalibacterium（8.36%）、Klebsiella（5.37%）、Escherichia-Shigella（5.31%）、Agathobacter（4.40%）；HP组前5位优势菌属分别为Bifidobacterium（14.42%）、Streptococcus（9.08%）、Faecalibacterium（8.55%）、Escherichia-Shigella（6.87%）、Agathobacter（6.29%）；健康对照组前5位优势菌属分别为Bifidobacterium（22.50%）、Escherichia-Shigella（9.16%）、Streptococcus（7.76%）、Faecalibacterium（5.65%）、Collinsella（5.49%）。

2.8 物种差异分析

2.8.1 显著性差异分析

在门水平上，选取4组样本中具有显著性差异（P<0.05）的物种丰度前5位以柱状图展示。4组相比，在Actinobacteriota菌门中，健康对照组该菌的丰度明显大于其余3组，NAFLD合并HP组的丰度最小；在Desulfobacterota菌门中，HP组的丰度最小（图10）。HP组与健康对照组相比，具有显著性差异前5位的物种分别为Desulfobacterota、Synergistota、Campylobacterota、Acidobacteriota、Deferribacterota，除Campylobacterota外，HP组其他4种微生物丰度均小于健康对照组（图11）。NAFLD合并HP组Desulfobacterota、Deferribacterota的丰度均大于HP组（图12）。NAFLD合并HP组Campylobacterota的丰度明显小于NAFLD组（图13）。NAFLD组与健康对照组相比，除Patescibacteria，其余3种微生物丰度均明显小于健康对照组（图14）。

在属水平上，选取4组样本中具有显著性差异（P<0.05）的物种丰度前10位以柱状图展示。4组相比，NAFLD组Streptococcus丰度最低，余3组基本相当；与健康对照组相比，NAFLD组、HP组和NAFLD合并HP组Agathobacter的丰度较高；NAFLD合并HP组Collinsella和Ruminococcus的丰度明显低于其他3组，Veillonella、Citrobacter和Rothia的丰度均高于其他3组；4组样本之间Romboutsia、Porphyromonas、Catenibacterium的丰度亦有不同，详见图15。HP组Agathobacter、Prevotella_9、Catenibacterium、Enterococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group及Peptoclostridium的丰度明显高于健康对照组，Romboutsia、UCG-005、Raoultella和Eubacterium_nodatum_group的丰度低于健康对照组（图16）。NAFLD合并HP组部分菌群丰度明显低于HP组，例如Collinsella、Subdoligranulum、Catenibacterium、Porphyromonas等，部分菌群丰度高于HP组，例如Citrobacter、Olsenella等（图17）。NAFLD合并HP组与NAFLD组相比，菌群丰度亦有明显改变，例如Streptococcus、Veillonella、Rothia等丰度升高，Dialister、Ruminococcus等丰度降低（图18）。NAFLD组部分菌群低于健康对照组，例如Streptococcus、Trichococcus等，部分菌群丰度高于健康对照组，例如Olsenella、Lachnospira、Desulfovibrio等（图19）。

2.8.2 4组间在丰度上有显著性差异的物种分析

在分类水平上，从门到种，4组分别筛选出具有显著差异的5个物种（LDA>3.0且P<0.05）。健康对照组：p_ Actinobacteriota、f_Porphyromonadaceae、g_Porphyromonas、s_uncultured_Porphyromonas_sp、s_Streptococcus_equinus；HP组：c_Bacilli、g_Agathobacter、s_Agathobacter_unclassified、f_Streptococcaceae、g_Streptococcus；NAFLD合并HP组：g_Citrobacter、s_Streptococcus_constellatus、s_Streptococcus_australis；NAFLD组：g_Romboutsia、s_Romboutsia_unclassified、g_Ruminococcus、s_Ruminococcus_unclassified、g_UCG-005（图20、21）。

2.9 肠道微生物的代谢通路相关分析

KEGG通路数据库分析生物代谢通路，预测了显著不同的肠道菌群的通路和代谢过程。结果显示，4组样本主要富集途径为肽酶代谢通路、磷脂酰肌醇信号通路、胰岛素信号传导通路和谷氨酸能突触信号通路，其中NAFLD合并HP组肽酶代谢通路、磷脂酰肌醇信号通路和谷氨酸能突触信号通路信号系统减弱，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A（PPKA）、磺基乙醛乙酰转移酶（Xsc）、磺基丙二醇3-脱氢酶、锰转运系统结合蛋白（MntC）、K09126蛋白表达明显。详见图22、23。

3 讨论

近年来，NAFLD发病率明显升高，NAFLD的肠道菌群变化成为学术研究热点。一项横断面研究表明，肠道微生物组成的变化与NAFLD严重程度的临床表现存在联系^［6］。Zhang等^［7］的荟萃分析表明，HP感染患者的NAFLD发病率更高，NAFLD患者的HP阳性率更高。Mantovani等^［8］也发现，HP感染与代谢障碍相关性脂肪性肝病发病的风险轻度增加有关。人类胃肠道存在多样化和动态的共生微生物群落，主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门组成^［9］。胃肠道微生物在疾病条件下的相对改变主要可分为致病性富集、共生耗竭或多样性减少^［10］。

本研究结果表明，在门水平上，NAFLD组占前3位的物种顺序依次为厚壁菌门、放线菌门和变形菌门。属水平上，NAFLD组Bifidobacterium、Faecalibacterium、Klebsiella、Escherichia-Shigella、Agathobacter为优势菌属，Streptococcus丰度最低。这与Boursier等^［11］的研究结果相似，NAFLD患者的肠道微生物在门水平上变形菌门和厚壁菌门的数量增加，拟杆菌门的存在减少。本研究发现，NAFLD合并HP组与其他3组肠道菌群相比，菌群丰富度有下降趋势；NAFLD合并HP组与NAFLD组相比、NAFLD组与健康对照组相比，菌群分布均具有明显差异性。HP感染可以改变胃肠道内的细菌多样性和丰度^［12］，这与本研究结果一致。在门水平上，NAFLD合并HP组占前3位的物种分别为厚壁菌门（59.94%）、变形菌门（17.00%）、放线菌门（14.75%），与其他3组相比，变形菌门占比明显增加，Actinobacteriota的丰度最小。Gao等^［13］报道了HP感染可引起粪便微生物群的改变，主要是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门的比例变化。HP感染患者肠道菌群在门水平上，厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和酸杆菌门升高，而拟杆菌门减少^［14］。综上所述，HP感染时变形菌门增加，这可能与NAFLD的发生有关。

本研究发现，在属水平上，NAFLD合并HP组Bifidobacterium、Collinsella丰度相比健康对照组减少，Streptococcus、Ruminococcus gnavus_group增加。与健康对照组相比，NAFLD组与HP组肠道的Bifidobacterium丰度亦有下降，但NAFLD合并HP组的下降比例最大。从中可以看出，HP感染是引起NAFLD或健康人群中肠道Bifidobacterium明显减少的主要因素。既往有研究表明，在HP根除治疗后，Enterococcus的数量减少，而Bifidobacterium和Bacteroides属的数量增加，这可能与HP竞争性地抑制某些特定的微生物群（如乳酸杆菌和双歧杆菌）有关^［15-17］。一项随机、双盲、安慰剂对照研究发现，益生菌Bifidobacterium的增加可改善肠道功能，并有效改善NAFLD，其作用机制可归因于产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）的能力，而SCFA可抑制肝脏胆固醇和脂肪生成，同时激活肝脏脂质氧化^［18-19］。SCFA是肠道厌氧微生物群发酵膳食纤维的主要代谢产物，包括乙酸盐、丙酸盐及丁酸盐等，其已被证明对人类的能量代谢产生有益影响。肠道中微生物群产生的SCFA可在肝、门静脉和外周血中找到，这些SCFA影响各种组织中的脂质、葡萄糖和胆固醇代谢^［20-21］。结合本研究结果，笔者推测NAFLD合并HP患者Bifidobacterium降低致使SCFA生成减少，进而引起肝脏胆固醇与脂肪堆积来促进NAFLD的进一步发展。本研究结果显示，与NAFLD组相比，NAFLD合并HP组Bifidobacterium、Faecalibacterium明显减少，Escherichia-Shigella、Streptococcus、Ruminococcus gnavus_group明显增加。以上菌属的增加或减少，表明NAFLD合并HP患者肠道菌群比例失调更为明显。有研究发现，在NAFLD患者肠道中Streptococcus有所增加^［22］，但是本研究中NAFLD组该菌丰度降低，可能是样本量的局限性所致，未来需大样本量进一步研究明确。本研究发现NAFLD合并HP组Escherichia-Shigella和Streptococcus丰度较高，提示肠道Escherichia-Shigella、Streptococcus与NAFLD和HP两种疾病关系密切，这两种菌属可能通过产生肠道炎症因子参与NAFLD的代谢。Ruminococcus gnavus_group是肠道的严格厌氧菌，其在NAFLD合并HP组中亦明显增加。Crost等^［23］研究发现Ruminococcus gnavus_group增加与NAFLD发展呈正相关，在肠-肝轴中起重要作用。综上，本研究发现，HP感染合并NAFLD患者肠道菌群发生相应改变，这些改变可能是HP感染促进NAFLD严重肝病事件发生的肠道微生态因素。另外，肠道微生物群的预测功能特征显示，NAFLD合并HP组肽酶代谢通路、磷脂酰肌醇信号通路和谷氨酸能突触信号通路信号系统减弱，可能与MntC、PPKA、Xsc、K09126等蛋白表达增多有关。菌群与以上信号传导通路及蛋白之间的调控仍需进一步探索。

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基金资助

洛阳市科技计划项目(2022063Y)