基于微阵列数据的circRNA-miRNA-mRNA竞争性内源RNA网络构建及其与自身免疫性肝炎小鼠模型肝损伤的相关性分析

Construction of a circRNA-miRNA-mRNA competitive endogenous RNA network based on microarray data and its correlation with liver injury in a mouse model of autoimmune hepatitis

摘要

目的 构建环状RNA(circRNA)-微小RNA(miRNA)-信使RNA(mRNA)竞争性内源RNA(ceRNA)网络，探讨其在刀豆蛋白A诱导的自身免疫性肝炎（AIH）小鼠模型中的潜在调控机制，并验证关键基因的表达与肝损伤的关系。方法 使用高通量数据筛选差异表达的circRNA、miRNA和mRNA，基于Pearson相关分析和Miranda程序预测miRNA与mRNA及circRNA的配对关系，构建ceRNA网络。对网络中的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。选取SPF级雄性C57BL/6小鼠12只，采用随机数字表法分为对照组和模型组，每组6只，模型组通过尾静脉注射刀豆蛋白A构建AIH小鼠模型，对照组注射生理盐水。通过qRT-PCR和Western Blot方法验证circ＿0001577、mi R-7055-3p和Akt3的表达。测定血清转氨酶（ALT、AST）和肝组织中丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）含量，并分析其与基因表达的相关性。计量资料两组间比较采用成组t检验。使用Spearman相关分析法分析基因表达与肝损伤指标之间的相关性。结果 构建了包含5 795个circ RNAmi RNA-m RNA配对的ce RNA网络，发现circ＿0001577为中心基因。与对照组小鼠比较，模型组中的circ＿0001577和Akt3表达上调，miR-7055-3p下调，差异均有统计学意义（P值均<0.05），且circ＿0001577与Akt3呈正相关（r=0.861,P<0.001）,miR-7055-3p与两者呈负相关（r值分别为-0.644、-0.855,P值均<0.05）。模型组小鼠肝脏Akt3蛋白表达显著高于对照组（1.04±0.10 vs 0.72±0.06,t=-6.49,P=0.001），并与circ＿0001577呈正相关（r=0.579,P=0.048），与mi R-7055-3p呈负相关（r=-0.891,P<0.001）。模型组小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA、NO含量较对照组均显著增加（P值均<0.05），上述肝损伤指标与circ＿0001577、Akt3呈正相关（r值分别为0.849、0.865、0.811、0.801;0.889、0.954、0.938、0.961,P值均<0.05），与miR-7055-3p呈负相关（r值分别为-0.687、-0.818、-0.833、-0.870,P值均<0.05），且与Akt蛋白表达呈正相关（r值分别为0.648、0.796、0.848、0.860,P值均<0.05）。结论 circ＿0001577通过竞争性吸附miR-7055-3p，导致Akt3抑制被解除，进而促进Akt3的表达，参与AIH的发生发展。circ＿0001577及其相关通路可能成为AIH的潜在治疗靶点。

关键词

肝炎,自身免疫性 / RNA,环状 / 微RNAs / RNA,信使 / 小鼠,近交C57BL

Key words

Hepatitis，Autoimmune / RNA，Circular / MicroRNAs / RNA，Messenger / Mice，Inbred C57BL

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种病因尚未完全阐明的慢性进展性肝脏疾病，其发病机制涉及多种因素的复杂相互作用，主要表现为IgG水平升高、自身抗体阳性、界面性肝炎等特征^［1］。遗传易感性与环境因素共同作用，破坏了机体的免疫耐受机制，导致针对肝脏自身抗原的免疫反应，最终引发肝细胞损伤、炎症或坏死^［2-4］。如果得不到有效控制，AIH可能进展为肝纤维化或肝硬化^［5-6］。

近年来，环状RNA（circular RNA，circRNA）作为一种新型的非编码RNA，因其在免疫反应及炎症调控中的重要作用，成为研究AIH等自身免疫性疾病的新兴领域。circRNA通过与微小RNA（microRNA，miRNA）的竞争性结合，作为内源性miRNA海绵调节基因表达；此外，circRNA还通过与RNA结合蛋白的相互作用，调控蛋白质功能^［7-9］。circRNA具有稳定性高、组织特异性强的优势^［10-11］，并且可以通过调控母本基因的表达、剪接过程等途径影响疾病进程^［12］。已有研究表明，circRNA在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等自身免疫性疾病中发挥关键作用，特别是在调控免疫反应和炎症反应方面^［13-14］，因此被认为是潜在的诊断标志物和治疗靶点。

前期研究中，课题组通过微阵列芯片技术筛选了刀豆蛋白A（ConA）诱导的AIH小鼠模型的circRNA表达谱，揭示了circRNA在AIH病程中的潜在作用^［7］。本研究利用前期获得的ConA诱导肝损伤小鼠模型的转录组学数据^［15-16］，构建circRNA-miRNA-mRNA竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）网络，并分析该网络的潜在生物学功能及其与AIH肝损伤过程的相关性，旨在进一步阐明AIH的发病机制，探索潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SPF级雄性C57BL/6小鼠（25～28 g），实验动物生产许可证编号：SCXK（京）2021-0006，使用许可证编号：SYXK（晋）2020-0006。ConA（北京索莱宝科技有限公司，货号：C8110），ALT、AST、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：C009-2-1、C010-2-1、S0021S和A003-1-2），UNLQ-10柱总RNA提取试剂盒、2X SYBR Abstart Master Mix（上海生工生物工程股份有限公司，货号：B511321、B110032），Total Protein Extraction Kit（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0146），Akt3多克隆抗体（Cell Signaling Technology，美国，货号：4685），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（武汉亚科因生物技术有限公司，货号：A21020），抗β-Actin鼠抗体（武汉亚科因生物技术有限公司，货号：A01010）。

1.2 circRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络的构建

本研究ceRNA网络构建所使用差异表达circRNA（differently expressed circRNA，DEC）、miRNA（differently expressed miRNA，DEMi）和mRNA（differently expressed mRNA，DEM）数据，来自本团队前期构建的ConA诱导小鼠肝损伤模型的转录组数据^［15-16］，包含27个DEC、49个DEMi和512个DEM。首先，采用Pearson相关分析（Pearson相关系数≥0.80，P≤0.05）和Miranda程序（Max Score≥140，Total Energy≤-2.0）预测miRNA-mRNA和miRNA-circRNA之间的相互作用。然后，基于ceRNA MuTATE方法和超几何分布算法计算ceRNA得分，并评估circRNA和mRNA共享miRNA的统计显著性^［17-19］。筛选出具有正相关性的mRNA-circRNA关系，并与ceRNA得分取交集，构建ceRNA网络。最后，使用Cytoscape 3.9.1软件可视化由前200对circRNA-miRNA-mRNA（按ceRNA得分降序排列）组成的简化ceRNA网络，以阐明这些差异表达基因的潜在调控功能。

1.3 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

为预测ceRNA网络中DEMs的生物学功能，采用R 4.3.1软件包，通过Fisher精确检验和超几何分布法进行GO和KEGG富集分析^［20-21］。GO分析包括分子功能（molecular functions，MF）、生物过程（biological processes，BP）和细胞组分（cellular components，CC）3个类别，计算每个GO条目的富集显著性^［22］。KEGG分析用于评估DEM与信号通路的相关性。以P≤0.05或错误发现率（false discovery rate，FDR）≤0.05为阈值，P值越低，富集显著性越高。

1.4 ceRNA网络中基因表达验证

为了验证ceRNA网络中注释基因的表达情况，本研究建立了ConA诱导的AIH小鼠模型。采用随机数字表法将12只小鼠分为对照组和模型组，每组6只。模型组通过尾静脉注射ConA构建AIH小鼠模型，对照组注射生理盐水。实验流程参照既往发表的文献^［16-17］。

为验证ceRNA网络的调控关系，使用qRT-PCR方法对circ_0001577、miR-7055-3p和Akt3的表达水平进行验证。使用UNIQ-10 Column Trizol提取肝组织中总RNA，采用SYBR Green法在Step One Plus系统中扩增目标基因。基因表达水平以内参基因U6或GAPDH归一化，用2^-ΔΔCt法计算相对表达量^［23］，并用倍数变化（fold change，FC）表示相对转录表达水平。基因特征及引物序列分别见表1、2。

1.5 Western Blot分析

使用Western Blot检测肝组织中Akt3蛋白表达水平。利用蛋白裂解液提取肝组织总蛋白，并通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h。随后用特异性Akt3抗体孵育PVDF膜，并采用化学发光法显色，拍照记录结果。最后以β-actin为内参照，通过图像分析软件计算Akt3蛋白的相对表达量。

1.6 血清转氨酶的测定

采集各组小鼠的血液样本，室温静置30 min后，1 000×g，离心15 min分离血清。使用SpectraMax Plus 384微孔板读数器通过微孔板法测量血清ALT和AST水平，按操作说明进行操作。

1.7 MDA和NO的测定

每只小鼠取100 mg肝组织匀浆，通过SpectraMax Plus 384微孔板读数器检测MDA和NO水平。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.8 统计学方法

使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以 \overline{x}±s表示，两组间比较采用成组t检验。使用Spearman相关分析法分析基因表达与肝损伤指标之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因共表达关系分析

根据设定的阈值（Pearson相关系数≥0.80、P≤0.05，以及Miranda程序Max Score≥140、Total Energy≤-2.0），本研究共获得了62 754个miRNA-mRNA对、28个miRNA-circRNA对和78 524个mRNA-circRNA共表达对（正相关）。

2.2 ceRNA网络的构建

在P≤0.05的条件下，获得了6 892个ceRNA对。进一步基于ceRNA得分与mRNA-circRNA共表达关系的交集，筛选出5 795个circRNA-miRNA-mRNA ceRNA对，表3列出了ceRNA得分前10位的ceRNA对。这些ceRNA对由11 178个DEM、49个DEMi和27个DEC共同构成，反映了潜在的ceRNA 调控网络。P值越低，mRNA或circRNA与其共享的miRNA相关性越显著。构建了包含前200对circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络（按ceRNA得分降序排列）。如图1a所示，circ_0001577被认为在AIH的发生中起关键作用，因为其作为中心基因位于ceRNA网络的中心。图1b展示了miR-101c、miR-1927、miR-7055-3p、miR-802-5p和miR-877-3p与circ_0001577的结合位点。

2.3 GO与KEGG富集分析

根据Fisher精确检验的结果，956个DEM富集到914个GO条目中，其中930个DEM涉及649个BP，932个DEM涉及86个CC，922个DEM涉及179个MF（P≤0.05）。在FDR≤0.05的阈值下，共获得330个显著的GO条目，包括239个BP、34个CC和57个MF。P值最低的前3个GO条目分别为免疫系统过程（GO：0002376）、炎症反应（GO：0006954）和先天免疫反应（GO：0045087）。在各个类别中，P值最低的GO条目分别为MF中的免疫系统过程（GO：0002376）、CC中的细胞质（GO：0005737）和MF中的蛋白结合（GO：0005515）。图2展示了所有GO条目中P值最低的前30个术语以及不同类别中P值最低的前10个术语（按P值升序排列）。

根据超几何分布法的计算结果，在956个DEM中，有466个基因富集到KEGG通路。其中，104个通路的P值≤0.05，而在校正后的结果中，有83个通路的FDR≤0.05。在所有显著富集的通路中，P值最低的前3个通路分别为NOD样受体信号通路（path：mmu04621）、TNF信号通路（path：mmu04668）和结核病（path：mmu05152），详见图3。

2.4 qRT-PCR验证

与对照组小鼠相比，模型组circ_0001577和Akt3在转录水平上的表达显著上调，而miR-7055-3p的表达显著下调（P值均<0.05）（图4a）。Spearman相关性分析表明，miR-7055-3p的表达与circ_0001577（r=-0.644，P<0.05）和Akt3（r=-0.855，P<0.05）的表达呈显著负相关（图4b、c），而circ_0001577的表达与Akt3的表达呈显著正相关（r=0.861，P<0.05）（图4d）。

2.5 Western Blot分析

模型组小鼠肝脏中Akt3蛋白的相对表达量显著高于对照组（1.04±0.10 vs 0.72±0.06，t=-6.49，P=0.001）（图5）。Akt3蛋白的表达与circ_0001577的转录水平表达呈正相关，而与miR-7055-3p的转录水平表达呈负相关（r值分别为0.579、-0.891，P值均<0.05）（图6）。

2.6 肝损伤指标的检测

与对照组相比，模型组小鼠的血清ALT、AST水平以及肝组织中MDA和NO的含量均显著增加（P值均<0.05）（图7）。

2.7 验证基因的表达与肝损伤指标的相关性

ALT、AST、MDA和NO与circ_0001577及Akt3的转录水平表达均呈正相关（r值分别为0.849、0.865、0.811、0.801；0.889、0.954、0.938、0.961，P值均<0.05），而与miR-7055-3p的转录水平表达呈负相关（r值分别为-0.687、-0.818、-0.833、-0.870，P值均<0.05）（图8～10）。此外，这些肝损伤指标与Akt蛋白的表达亦呈正相关（r值分别为0.648、0.796、0.848、0.860，P值均<0.05）（图11）。

3 讨论

circRNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA，其环状特征最早于1976年在植物类病毒中被发现^［24］。几乎所有物种中都存在circRNA，其比线性RNA更稳定，因circRNA的结构能够抵抗RNA酶降解。越来越多的研究集中探讨circRNA与miRNA的关系，并揭示了circRNA的生物功能^［25-26］。circRNA富含miRNA结合位点，可以竞争性地结合miRNA，从而减弱miRNA对靶基因的抑制作用，增加靶基因的表达^［27］。近年来，越来越多的研究表明，自身免疫性疾病的发病机制与miRNA海绵机制的紊乱密切相关^［28］。基于芯片实验的结果，本团队也发现至少有27个DEC可能参与了AIH的发生^［16］。然而，这些DEC在AIH病理过程中的具体机制尚未阐明。

自Salmena等^［29］于2011年提出ceRNA假说后，该假说已被众多证据支持，并成为转录调控研究领域的焦点。该假说强调RNA（即ceRNA）通过共同的miRNA结合位点发挥竞争性作用。ceRNA能够通过miRNA应答元件与目标miRNA竞争性结合，进而改变后者的转录表达和功能。如上所述，作为miRNA的海绵，circRNA可能通过ceRNA机制在自身免疫性疾病（包括AIH）的发生和进展中发挥重要作用。因此，为了深入探讨这些筛选出的DEC潜在生物学功能，笔者基于之前的研究数据构建了与circRNA相关的ceRNA网络^{［7，15-16］}。

通过筛选，本研究获得了5 795个circRNA-miRNA-mRNA ceRNA对，共由11 178个DEM、49个DEMi和27个DEC组成。研究结果显示，circ_0001577与AIH的发生密切相关，因其位于ceRNA网络的中心，可能通过调控miR-101c、miR-1927、miR-7055-3p、miR-802-5p和miR-877-3p的表达发挥其生物功能。circ_0001577与这些miRNA之间的潜在结合位点，形象展示了其作为miRNA海绵的生物特性。

此外，这些DEMi和DEM也在AIH发病机制中起重要作用。例如，miR-802的过表达可导致程序性细胞死亡蛋白1的表达上调和IFN-γ分泌的下调，从而抑制T淋巴细胞功能^［30-32］。同时，已有研究验证，miR‑101的过表达可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶1的表达并阻断核因子‑κB通路来减轻炎症反应^［33］。因此，miR-802-5p和miR-101表达的下降有利于自身免疫性疾病（包括AIH）的发生，这与本团队实验结果一致。作为3种同工型Akt中的一种，Akt3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，位于炎症相关信号通路的上游，影响各种促炎性细胞因子的表达和分泌，如TNF-α、IL-1β和IL-6^［34-35］。在本研究中，不仅检测了位于ceRNA网络中的一些DEC、DEMi和DEM的表达，还分析了这些基因的表达水平与肝损伤程度（如ALT、AST、MDA和NO等损伤指标）之间的相关性。结果显示，circ_0001577和Akt3的表达上调与这些肝损伤指标的活性或含量呈正相关，而miR-7055-3p的表达下调与这些指标呈负相关。因此，circ_0001577、miR-7055-3p和Akt3可能是AIH发生的重要靶点，其相互作用机制可能与ceRNA假说有关。

为了进一步揭示与此构建的ceRNA网络相关的潜在生物功能，本研究进行了GO富集分析和KEGG信号通路分析，发现ceRNA网络中富集的DEM最显著地参与了BP类别中的免疫系统过程。这不仅再次证明了免疫稳态失衡在AIH发生中的重要性，也表明了这些差异表达基因的相互作用与AIH的发展密切相关。蛋白结合是MF类别中最显著的GO条目，指的是选择性和非共价地与任何蛋白质或蛋白质复合物相互作用。众所周知，免疫反应通过受体-配体相互作用介导，当该平衡被打破时，便会触发自身免疫性疾病^［36-37］。提示ceRNA网络中富集的异常表达基因之间的相互调节可能干扰了受体与配体之间的正常结合，从而引发了肝脏中的自身免疫反应。GO富集分析有助于提供新的治疗靶点，并为T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病的治疗提供了新的视角。

KEGG信号通路分析显示，这些ceRNA富集在104个信号通路中，包括TNF受体信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K-Akt信号通路等。尽管已有报道指出这些信号通路与AIH中的肝损伤发生有关，但ceRNA网络将为从RNA-RNA相互作用来阐明这些通路相关的AIH发病机制提供新的线索。此外，ceRNA网络的构建能使研究者对AIH发病机制的理解集中于这些信号通路，从而有助于靶向药物或靶向干预方法的开发。

然而，本研究存在一定局限性。首先，研究结果主要基于ConA诱导的动物模型，其对人类AIH的适用性尚需进一步验证。其次，关键circRNA在不同人群样本中的表达特征和功能尚未得到广泛验证。此外，环境因素与遗传背景对circRNA表达的影响，以及circRNA在AIH病程动态变化中的作用，也需结合临床数据展开深入研究。

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基金资助

国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目（2024）

中西医结合防治风湿免疫病山西省科技创新人才重点团队(202204051002033)

山西省科学技术厅山西省重点国别科技合作项目(202104041101013)

山西省应用基础研究计划青年科学基金项目(202203021222272)

山西省中医药管理局科研项目(2024ZYYAD008)

山西中医药大学科技创新团队项目(2022TD2003)

中西医结合治疗风湿免疫疾病重点实验室(zyyyjs2024021)