十二指肠乳头旁憩室对原发性胆总管结石患者胆汁微生态的影响

Influence of juxtapapillary duodenal diverticula on bile microecology in patients with primary common bile duct stones

摘要

目的 探讨合并十二指肠乳头旁憩室（JPDD）的胆总管结石（CBD）及单纯胆总管结石患者的胆汁微生物特点。 方法 前瞻性纳入2024年1月—5月河北省人民医院消化内科收治的CBD患者30例，根据是否合并JPDD分为JPDD组（n=15）和CBD组（n=15）。在内镜逆行胆胰管造影术中收集胆汁，行16S rRNA微生物测序分析，比较两组微生物组成、多样性及代谢通路差异。符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验，非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料两组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验法。临床指标与微生物物种丰度间的相关性采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析。 结果 JPDD组结石最大直径［（10.87±3.42） mm vs （6.80±2.08） mm， t=3.94， P0.01）和胆总管直径［（14.73±3.95） mm vs （9.67±2.64） mm， t=4.13， P0.01）均大于CBD组。胆汁微生物分析发现，两组最常见的菌门均为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门，JPDD组中变形菌门占主导地位。在属和种水平，JPDD组大肠埃希氏-志贺氏菌属、肠球菌属、大肠杆菌相对丰度更高。两组Alpha多样性相似，Beta多样性差异明显（Adonis检验，P0.05）。LEfSe分析发现，两组存在25个差异菌种（LDA2），JPDD组肠杆菌属、肠球菌科、克雷伯菌属等7个菌群富集；消化球菌科、罗斯拜瑞氏菌属、别样杆菌属等18个菌群在CBD组中富集明显（P0.05）。相关性分析发现，JPDD组显著富集的肠球菌科、肠球菌属与胆总管直径及结石最大直径呈正相关（P值均0.01）；而表达下降的消化球菌科、不动杆菌属、别样杆菌属等与胆总管直径及结石最大直径呈负相关（P值均0.05）。胆汁微生物代谢富集通路发现，两组在细胞生长和死亡、运输和分解、神经系统，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，组氨酸代谢等10条代谢通路有统计学差异（P值均0.05）。 结论 JPDD的存在会导致胆汁微生物群发生改变（如肠球菌属升高、罗斯拜瑞氏菌属下降），特定菌群及其代谢可能促进CBD的形成。

Abstract

Objective To investigate the microbiological characteristics of bile in patients with common bile duct stones alone or comorbid with juxtapapillary duodenal diverticula （JPDD）. Methods A prospective study was conducted among 30 patients with common bile duct stones who were admitted to Department of Gastroenterology， Hebei General Hospital， from January to May 2024， and according to the presence or absence of JPDD， they were divided into JPDD group and simple common bile duct stones group （CBD group）， with 15 patients in each group. Bile samples were collected during endoscopic retrograde cholangiopancreatography， and 16S rRNA microbial sequencing was performed to compare the differences in microbial composition， diversity， and metabolic pathways between the two groups. The independent-samples t test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups， and the Mann-Whitney U rank sum test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups； the chi-square test or the Fisher’s exact test was used for comparison of categorical data between two groups. Pearson correlation analysis or Spearman correlation analysis was used to analyze the correlation between clinical indicators and microbial species abundance. Results Clinical data showed that compared with the CBD group， the JPDD group had significantly greater maximum diameter of stones （10.87±3.42 mm vs 6.80±2.08 mm， t=3.94， P0.01） and common bile duct diameter （14.73±3.95 mm vs 9.67±2.64 mm， t=4.13， P0.01）. The microbiological analysis of the bile showed that Proteobacteria， Bacteroidetes， Firmicutes， and Actinobacteria were the most common phyla in both groups， and Proteobacteria was the dominate phylum in the JPDD group. At the genus and species levels， the JPDD group had higher relative abundances of Escherichia-Shigella， Enterococcus， and Escherichia coli. Alpha diversity was similar between the two groups， and there was a significant difference in beta diversity between the two groups （Adonis test， P0.05）. The LEfSe analysis identified 25 differentially expressed species （LDA2） between the two groups， and the JPDD group had enrichment of 7 flora such as Enterobacter， Enterococcaceae， and Klebsiella， while the CBD group had significant enrichment of 18 flora such as Peptococcaceae， Roseburia， and Alistipes （P0.05）. The correlation analysis showed that Enterococcaceae and Enterococcus significantly enriched in the JPDD group were positively correlated with the diameter of the common bile duct and the maximum diameter of stones （P0.01）， whereas Peptococcaceae， Acinetobacter， and Alistipes with reductions in expression were negatively correlated with the diameter of the common bile duct and the maximum diameter of stones （P0.05）. The enrichment analysis of biliary microbial metabolic pathways showed that there were significant differences between the two groups in 10 metabolic pathways such as cell growth and death， transportation and decomposition， nervous system， biosynthesis of valine， leucine， and isoleucine， and histidine metabolism （P0.05）. Conclusion The presence of JPDD may lead to alterations in bile microbiota， such as an increase in Enterococcus and a reduction in Roseburia， and specific flora and metabolism can promote the formation of common bile duct stones.

Graphical abstract

关键词

十二指肠乳头旁憩室 / 胆总管结石病 / 微生物群 / 高通量核苷酸序列分析

Key words

Juxtapapillary Duodenal Diverticula / Choledocholithiasis / Microbiota / High-Throughput Nucleotide Sequencing

胆总管结石（common bile duct stone，CBD）是消化系统常见疾病，其中原发性CBD是指在胆管内形成的结石，其成分以胆红素为主^［1-2］，亚洲地区高发，确切病因及总体患病率尚不清楚。目前研究显示，CBD的形成可能与细菌感染、胆汁淤积密切相关，尤其是产β-葡萄糖醛酸酶的细菌。该酶可水解胆红素，生成不溶性游离胆红素，进而促进结石形成^［3-4］。

十二指肠乳头旁憩室（juxtapapillary duodenal diverticula，JPDD）是位于十二指肠乳头开口以及壶腹周围2～3 cm处的肠壁薄弱区域，随年龄的增长发病率增高^［5］。根据内镜下十二指肠乳头与憩室的位置分为Ⅰ型（乳头位于憩室内）、Ⅱ型（乳头位于憩室边缘）和Ⅲ型（乳头位于憩室外）^［6］。JPDD可能通过压迫胆总管、影响Oddi括约肌功能等导致胆汁排除不畅及细菌感染来促进CBD的形成。

在临床工作中，笔者发现许多高龄CBD患者合并JPDD。为探讨憩室与结石形成的相关性及其作用机制，本研究应用16S rRNA基因测序技术分析胆汁微生物特征，以阐明JPDD对原发性CBD形成的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究采用前瞻性研究方法，选取2024年1月—5月在河北省人民医院消化内科首次诊断为CBD的患者作为研究对象，拟行内镜逆行胆胰管造影（ERCP）治疗。

1.1.1 纳入标准及定义

通过临床症状，结合超声、CT、磁共振胰胆管成像等影像学检查及内镜检查确诊为原发性CBD。

目前原发性CBD尚缺乏明确定义。既往研究将其定义为：胆囊切除术后（未行胆总管探查）超过6个月在胆总管内新发的结石，且术前影像学检查未见胆囊结石。本研究参考前人研究方法，根据结石的颜色、质地、形态特征，结合影像学表现和临床经验综合判断是否为原发性CBD^［5］。插管成功：不超过3次尝试后成功插管，均无乳头预切开或进入胰管或植入胰管支架等。插管困难：超过3次尝试后才成功插管，有乳头预切开或进入胰管或植入胰管支架等。

1.1.2 排除标准

（1）经影像学确认明显胆总管非结石性狭窄、胆道肿瘤患者；（2）继发于胆囊结石（如结石形态、位置特征符合原发性形成）；（3）既往行内窥镜括约肌切开术的复发性CBD患者；（4）合并严重感染性休克，严重心、肺、脑血管疾病不能配合及耐受ERCP手术的患者；（5）合并其他恶性肿瘤患者。

1.2 研究内容

收集患者性别、年龄、BMI；既往病史，包括胆囊切除术、高血压、冠心病等慢性病史；术前化验，包括炎症指标、胆红素、转氨酶等。术前依据2018年东京急性胆管炎和胆囊炎管理指南^［7］评估患者胆管炎分级。ERCP过程中记录是否存在憩室，评估是否存在插管困难，并记录胆总管扩张直径、CBD最大直径。

1.3 标本收集及处理

应用十二指肠镜（奥林巴斯，TJF-290V，日本）收集患者的胆汁。十二指肠镜到达十二指肠部，应用20 mL无菌生理盐水冲洗镜头前端、活检孔、十二指肠乳头及周围，应用导丝成功插入胆管，在注入造影剂之前，用20 mL注射器抽取5 mL胆汁，迅速于无菌操作台置入冻存管内，-80 ℃冰箱冻存。

运用QIIME2软件对胆汁微生物菌群的Alpha多样性与Beta多样性进行全面分析，评估手段包括Chao1指数与Shannon指数，揭示样本间的群落结构与多样性特征。Chao1指数用于估计群落中实际的物种数量，Shannon指数反映物种丰度和分布均匀度水平，物种多样性越高，物种分布越均匀，Shannon指数也就越大。利用R语言计算binary_jaccard距离矩阵以量化多样性，结合主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）技术，对不同物种间的多样性差异进行综合评估。应用Adonis检验（binary_jaccard距离矩阵）来判定所观察到的多样性差异是否具有统计学差异。采用差异微生物分析（Linear discriminant analysis coupled with effect size measurement，LEfSe）方法分析两组样本间的差异微生物群。微生物KEGG通路富集分析应用PICRUSt 2软件预测已知微生物基因功能的构成。

1.4 统计学方法

应用SPSS 27.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，两组间比较采用成组t检验；非正态分布的计量资料以M（P₂₅～P₇₅）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料两组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验法。临床指标与微生物物种丰度之间的相关性采用Pearson相关分析（正态分布的数据）或Spearman秩相关分析（非正态分布的数据）。Wilcoxon检验比较两组间微生物差异。P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

最终共纳入30例原发性CBD患者，其中合并JPDD的患者15例（JPDD组），单纯CBD患者15例（CBD组）。30例患者中男女比例为7∶8。JPDD组的胆总管直径、结石最大直径、WBC、胆碱酯酶（ChE）显著高于CBD组（P值均0.05）（表1）。

2.2 胆汁微生物整体分布

共纳入30例样本，测序得到的原始数据Raw reads数据量分布在78 079～81 999，经过质控之后的Clean tags数据量在68 867～76 025，应用QIIME2软件去除嵌合体之后得到数据量分布在63 586～75 167，各个样本的扩增子序列变异个数分布在29～270。

2.2.1 两组患者胆汁微生物在门水平分布情况

JPDD组及CBD组常见的4种菌门相对丰度分别为：变形菌门（Proteobacteria），40.25% vs 31.83%；拟杆菌门（Bacteroidota），29.55% vs 38.21%；厚壁菌门（Firmicutes），25.12% vs 25.25%；放线菌门（Actinobacteriota），2.86% vs 2.69%。两组物种丰度在门水平分布相似，JPDD组以Proteobacteria占主导地位，CBD组以Bacteroidota占主导地位（图2）。

2.2.2 两组患者胆汁微生物在属水平分布情况

JPDD组中常见的4种菌属相对丰度分别为：大肠埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia shigella），31.17%；鼠杆状菌属（Muribaculaceae.sp），17.47%；拟杆菌属（Bacteroides.sp），6.27%；肠球菌属（Enterococcus.sp），4.57%。CBD组常见菌属相对丰度分别为：Muribaculaceae.sp，21.02%；Escherichia shigella，17.07%；Bacteroides.sp，9.88%；毛螺菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group），5.15%。与CBD组相比，JPDD组患者的Escherichia shigella、Enterococcus.sp相对丰度较高（图2）。

2.2.3 两组患者胆汁微生物在种水平分布情况

由于测序技术限制，检测种水平菌落有限，结果个体性显著。结果显示，JPDD组中的常见菌有：大肠杆菌（Escherichia_coli_g_Escherichia shigella，28.45%）、耐久肠球菌（Enteroc‑occus_durans_g_Enterococcus，3.61%）、阴道阿托波菌（Ato‑pobium_vaginae_g_Atopobium，1.80%）、克雷伯菌（Klebsiella_pneumoniae_g_Klebsiella，1.79%）等。CBD组中常见菌为Escherichia_coli_g_Escherichia shigella（12.48%）、海藻希瓦菌（Shewanella_algae_g_Shewanella，4.82%）、Atopobium_vaginae_g_Atopobium（2.18%）、普通拟杆菌（Bacteroides_vulgatus_g_Bacteroides，1.91%）等。本研究还发现，部分菌种如弗氏志贺菌（Shigella_flexneri_g_Escherichia shigella，1.42%）仅在JPDD组中出现，群落丰度占比差异明显可能与检测技术水平限制及样本量少有关。

2.3 胆汁微生物Alpha多样性分析

Alpha多样性分析反映物种的多样性程度。两组在Chao1指数、Shannon指数中没有明显差异（P值均0.05），说明两组在物种总数及物种均匀度方面相似（图3）。

2.4 胆汁微生物Beta多样性分析

应用PCoA分析说明样本间的差异程度，JPDD组患者的胆汁微生物群落PCoA分别在最大变异率4.74%、4.49%呈现不同区域聚集（binary_jaccard算法，Adonis检验，P0.05），说明两组间胆汁微生物群落组成有明显差异（图4）。

2.5 差异菌群分析

在本研究中应用LDA值分布展示LEfSe分析结果，发现25个差异菌群在两组间存在统计学差异。JPDD组中肠球菌科（Enterococcaceae）、Enterococcus.sp、克雷伯菌属（Klebsiella）、孪生球菌属（Gemella.sp）等7个菌群表达升高，消化球菌科（Peptococcaceae）、罗斯拜瑞氏菌属（Roseburia.sp）、别样杆菌属（Alistipes.sp）、不动杆菌属（Acinetobacter.sp）、链球菌属（Streptococcus.sp）等18个菌群相对丰度表达下降，结果表明JPDD组与CBD组胆汁中存在多种差异显著的菌群（P0.05）（图5）。

应用Wilcoxon检验分析两组在种分类水平上存在差异的微生物群。JPDD组中耐久肠球菌（Enterococcus_durans_g_Enterococcus）、粪肠球菌（Enterococcus_faecalis_g_Enterococcus）和粪便拟杆菌（Bacteroides_stercoris_g_Bacteroides）显著富集；而CBD组中土壤不动杆菌（Acineto‑bacter_soli_g_Acinetobacter）、盲肠螺杆菌（Helicobacter_typhlonius_g_Helicobacter）和涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia_sp._g_Nesterenkonia）显著富集（图6）。

2.6 JPDD组患者胆汁微生物与临床资料的相关性分析

应用Spearman相关系数，制作Heatmap图。结果显示，JPDD组明显富集的Enteroccaceae、Enterococcus.sp相对丰度与胆总管直径（P0.001）、结石最大直径（P0.01）呈正相关，与ChE水平呈负相关（P0.05），JPDD组表达明显下降的Peptococcaceae、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、Acinetobacter.sp、理化所菌科（Rikenellaceae）、Alistipes.sp、阿尔法变形菌纲（Alphaproteobacteria）与胆总管直径、结石最大直径呈负相关（P值均0.05）。链球菌科（Streptococcaceae）、Streptococcus.sp、Peptococcaceae等与WBC呈负相关，Alphapro‑teobacteria、Streptococcaceae、Streptococcus.sp与ChE呈正相关。说明JPDD组胆道微生物特征群落与CBD的形成及大小密切相关（图7）。

2.7 微生物KEGG通路富集分析

为了比较两组的代谢通路差异，采用PICRUSt 2对KEGG通路及丰度值进行了预测分析，结果显示，两组间存在10条显著差异的代谢通路（P值均0.05），说明JPDD组患者的肠道菌群代谢功能可能发生改变。这些通路包括，细胞生长和死亡、运输和分解、神经系统，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，组氨酸代谢等其他氨基酸的代谢和合成通路（图8）。

3 讨论

细菌微生物在维持人体内环境稳态中发挥着关键作用，可通过微生物易位、调节免疫、调节新陈代谢和酶降解等方式影响胃肠道癌症和慢性疾病的发生及进展^［8-9］。CBD患者常见的胆汁微生物群主要由Firmicutes、Bacteroidota、Actinobacteriota及Proteobacteria组成^{［5，10-11］}，微生物群失调与胆道疾病关系密切。本研究显示，JPDD组患者的胆汁以Proteobacteria（40.25%）、Bacteroidota（29.55%）、Firmicutes（25.12%）、Actinobacteriota（2.86%）为主，其中Proteobacteria占比在JPDD组较高，Escherichia shigella、Escherichia_coli_g_Escherichia-Shigella、Shigella_flexneri_g_Escherichia-Shigella等丰度也升高。在细菌分类中，Proteobacteria是最大的一门，包含大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等肠道常见微生物，也是胆汁培养的常见菌^［12-14］。肠道微生物的不平衡通常是由于Proteobacteria丰度的持续增加，笔者团队推测其在胆道中也可能扮演类似的角色。研究证实，CBD患者的胆汁和十二指肠液微生物组成高度相似，均以Proteobacteria为主，并且在复发的病例中从门到属水平均呈现一致分布^{［10，15-16］}。十二指肠微生物的逆行迁移可能导致胆汁微生物的改变。十二指肠微生物和胆汁微生物之间存在肠-胆反流，JPDD导致Oddi括约肌功能失调，微生物通过Oddi括约肌迁移进入胆道，改变胆道微环境，影响结石的形成。Oddi括约肌功能受损还会导致胆汁淤积、促进感染，导致结石的发展^［17-18］。因此，推测JPDD通过改变胆道微环境来影响CBD的形成。

在合并JPDD的患者中，胆汁微生物的组成和丰度表现出显著差异。JPDD组中致病菌Enterococcus.sp、Klebsiella等菌群丰度升高，提示这些微生物丰度变化可能与CBD的形成相关。目前细菌微生物在CBD形成中的作用机制主要包括β-葡萄糖醛酸酶、胆盐水解酶、黏蛋白等。Enterococcus.sp和Klebsiella是胆道感染的常见致病菌，能耐受较大范围的pH，产生β-葡萄糖醛酸酶，在胆道结构受损或梗阻时易水解胆红素葡萄糖醛酸形成胆色素钙晶体，促进色素性结石形成^{［3，19-21］}。胆汁微生物还可以通过改变胆汁成分调节CBD的形成。如Enterococcus.sp、Klebsiella、梭菌属等微生物具有胆盐水解酶活性，这些细菌可以在小肠内催化胆汁酸解离生成游离胆汁酸和氨基酸，影响胆汁酸及胆固醇代谢^［22］。胆汁中黏蛋白也在色素性结石的形成过程中发挥作用。胆囊和胆管的慢性炎症可以增加上皮细胞中黏蛋白的产生，例如MUC5AC的表达水平升高可通过以下途径促进色素结石的形成和发展：提供基质，促进沉淀，与慢性炎症和胆道感染细菌（如Klebsiella和Escherichia coli）相互作用^［23］。当肠黏膜屏障功能受损和存在肠-胆反流时，出现胆道微生态紊乱，血清中内毒素水平升高，胆管中的内毒素水平也升高，进一步增强胆管上皮细胞内β-葡萄糖醛酸酶和黏蛋白的内源性表达^［24］，类似细菌β-葡萄糖醛酸酶和糖萼在结石形成中的作用，加快结石进程。本研究还发现，肠球菌科、Enterococcus.sp丰度与胆总管直径及结石最大直径呈显著正相关，提示JPDD、胆汁微生物及CBD之间存在着密切联系，调节微生物群和代谢通路可以影响结石的形成。

同样，部分有益菌在胆汁中的低表达也不利于胆道健康，进而可能促进结石的形成和发展。本研究发现JPDD组中Roseburia.sp、Acinetobacter.sp、Alistipes.sp等微生物丰度明显下降。Roseburia.sp是定植于消化道的常见菌属，在很多疾病的进展中发挥保护作用，可通过加强肠道紧密连接来改善酒精相关性肝病^［25］，降低炎症性肠病患者遗传风险评分^［26-27］。Keren等^［28］还发现肠道中Roseburia.sp显著减少可以作为有症状胆结石形成的生物标志物。此外，产生短链脂肪酸的细菌丁酸梭菌能减少小鼠CBD形成并保护肠道微生物组平衡，降低胃肠道和胆道系统感染的危险^［29］。在本研究结果中，JPDD组中Acinetobacter.sp、Alistipes.sp、Rikenellaceae等能产生短链脂肪酸的微生物丰度均较CBD组减少，并且与胆总管直径及结石最大直径呈负相关。正常的胆管类似肠道一样存在定殖菌群，微生物平衡维持胆道环境稳定^［30］。十二指肠憩室的存在导致括约肌功能异常出现肠胆反流，进而导致胆管菌群平衡出现异常，这些“有益菌”减少是结石形成可能的原因之一，但目前有关菌群在胆道中的作用研究较少。值得注意的是，原发性CBD的形成及发展是微生物群之间相互作用、相互影响的复杂过程。

胆道和肠道微生物几乎参与了胆汁形成的所有环节，包括脂质和胆固醇的代谢、生物转化和肠肝循环等过程。JPDD的存在显著改变了胆汁代谢的平衡。JPDD组与CBD组在2-氧代羧酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等方面存在10条差异富集通路，这些生理过程涵盖了胆汁酸合成与代谢、肝脏中的能量转换机制、氧化应激反应以及炎症性响应。多项研究显示，肠道微生物可以通过影响胆汁酸代谢（如初级胆汁酸、牛磺酸代谢）调节机体健康，改善肝纤维化、减弱肝脏氧化应激和细胞凋亡^［31-32］。当微生物失调时，继发的胆汁酸、氨基酸等代谢失衡可能导致胆管结石、胆汁淤积、脂肪肝等疾病的发生。因此，笔者认为JPDD的存在可能通过调节代谢物成分、影响胆汁酸和脂质代谢，从而影响CBD的形成。要深入研究胆汁代谢和微生物特征之间的潜在关系，仍需开展代谢组学进一步研究。

JPDD与原发性CBD之间的关系复杂。笔者团队通过16S rRNA微生物测序对原发性CBD患者的胆汁微生物进行分析，探讨JPDD对结石形成的影响。胆汁微生物群丰度变化可能也参与了CBD的形成过程。当然，实验存在部分局限性：ERCP为侵入性检查，无法保证在收集标本时内镜通过十二指肠过程中存在微量的肠道污染可能。在未来研究中，将扩大样本量进一步探讨原发性胆总管结石形成的机制，为疾病的预防及治疗提供更好的指导。

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基金资助

河北省政府资助医学人才项目(ZF2023188)