抗线粒体抗体阴性原发性胆汁性胆管炎的无创诊断

Noninvasive diagnosis of anti-mitochondrial antibody-negative primary biliary cholangitis

摘要

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种自身免疫性疾病，主要特征是肝内胆管的胆汁淤积。抗线粒体抗体（AMA）是目前诊断PBC的关键血清标志物，但仍有5%～10%的PBC患者血清中无法检测出AMA，可能需要依赖肝脏活组织检查确诊。对于AMA阴性的PBC患者，无创性诊断仍是一个挑战。本文回顾除AMA外其他特异性血清标志物的研究进展，总结这些血清标志物诊断AMA阴性PBC的优缺点，并分析未来有望成为AMA阴性PBC患者无创性诊断的新生物标志物类型，以期为发现敏感性更高的血清标志物提供新思路。

Abstract

Primary biliary cholangitis （PBC） is an autoimmune disease characterized by cholestasis of the intrahepatic bile ducts. Anti-mitochondrial antibody （AMA） is currently the key serum marker for the diagnosis of PBC， and however， there are still 5%—10% of patients with PBC who have undetectable AMA in their serum and need liver biopsy to make a confirmed diagnosis. Noninvasive diagnosis remains a challenge in AMA-negative PBC patients. This article reviews the research advances in specific serum markers other than AMA， summarizes the advantages and disadvantages of these serum markers in the diagnosis of AMA-negative PBC， and analyzes the types of new biomarkers that may be used in the noninvasive diagnosis of patients with AMA-negative PBC， in order to provide new ideas for identifying serum markers with higher sensitivities.

Graphical abstract

关键词

原发性胆汁性胆管炎 / 自身抗体 / 诊断 / 生物标记

Key words

Primary Biliary Cirrhosis / Autoantibodies / Diagnosis / Biomarkers

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种慢性进行性胆汁淤积性肝病，因自身免疫系统攻击肝内小胆管导致胆汁淤积，最终可进展为肝硬化。与其他胆汁淤积性肝病的特征相似，PBC患者血清中的ALP或GGT水平通常异常升高。

抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）是诊断PBC的关键指标，主要识别线粒体酶复合体的3个靶点：丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit，PDC-E2）、支链2-酮酸脱氢酶复合体E2亚基（branched-chain 2-OADC E2 subunit，BCOADC-E2）和α-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚基（2-oxoglutaric acid dehydrogenase complex E2 subunit，OGDC-E2）^［1］。临床中通常采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IF）、免疫印迹法（immunoblotting，IB）等技术测定AMA水平。尽管已经开发了融合PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的重组蛋白，显著提高了AMA检测的敏感性，但仍有5%～10%的PBC患者血清中无法检测出AMA。这部分患者在ELISA检测中AMA滴度低于20，IF检测AMA滴度低于1∶40，且IB结果中仅显示阴性条带，需依赖其他特异性抗体检测或肝活组织检查明确PBC的诊断，此类患者被称为“AMA阴性PBC患者”^［2］。

为研究AMA阴性PBC的潜在机制，Wasik等^［3］对AMA阴性和阳性PBC患者血清中的微小RNA（microRNA）进行检测，发现AMA阴性PBC患者血清中miR-21的表达显著升高，并与AMA抗体滴度呈负相关。推测miR-21可能通过影响B细胞的分化和功能，以及调节免疫细胞的甲基化状态，间接导致AMA减少。AMA通过识别人胆管上皮细胞（biliary epithelial cell，BEC）凋亡小泡内的PDC-E2，诱发自身反应性CD4⁺和CD8⁺T细胞对BEC的损伤^［1］，但AMA阴性PBC患者BEC损伤的机制尚不明确。Deng等^［4］利用生信技术对AMA阴性和阳性PBC患者的血清抗原进行比较，发现AMA阴性组中参与B细胞活化、吞噬识别及补体激活的蛋白表达显著上调，而参与线粒体中电子传递和细胞代谢过程的蛋白显著下调，与AMA阳性组患者相反。因此，AMA阴性PBC患者可能存在不同机制介导的BEC损伤。

AMA阴性PBC患者的临床表现、实验室指标、组织学特征、治疗反应与AMA阳性患者大致相同，但存在细微差异。相较于AMA阳性PBC患者，AMA阴性PBC患者发病年龄可能更小，组织学上的炎症程度更严重，血清免疫球蛋白M水平更低^［5-6］。然而，两者在肝脏相关并发症、死亡率或肝移植需求方面无显著差异^［7-8］。由于诊断延误，AMA阴性PBC患者明确诊断时往往已处于疾病的晚期阶段^［6］，因此这类患者的早期诊断和治疗尤为重要。在缺乏明确肝组织病理学依据的背景下，掌握并利用新的血清生物标志物，有助于为AMA阴性PBC患者提供更明确的诊断依据，降低临床有创操作的必要性。本文详细阐述目前在AMA阴性PBC患者中可检测到的几种特异性生物标志物，并为未来探索新的诊断标志物提供研究方向。

1 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）作为无创性诊断指标的临床应用

在30%～50%的PBC患者中，可以检测出多种ANA。借助IF将ANA分为核包膜模式和多核点模式2种特定荧光类型。核包膜模式用于检测抗核包膜抗体，主要针对核孔复合体（nuclear pore complex，NPC）蛋白，如糖蛋白210（glycoprotein 210，gp210）、核孔蛋白p62（nucleoporins p62，NUP62）等自身抗体^［9］；多核点模式主要检测抗核点抗体，主要针对嗜酸性粒细胞白血病蛋白（promyelocytic leukaemia protein，PML）核体，如分子量100 kD的斑点状核蛋白（speckled nuclear protein of 100 kD，sp100）、sp140和PML等自身抗体。

1.1 抗gp210抗体

gp210是一种跨膜核孔蛋白，位于NPC的内核膜和外核膜之间，其主要功能是维持NPC结构的完整性，确保NPC在核质运输、基因表达调控及DNA修复等过程中正常发挥作用^［10］。抗gp210抗体主要识别gp210羧基末端15个氨基酸表位^［11］。核蛋白、线粒体PDC-E2和大肠埃希菌之间的分子模拟研究表明，gp210的188-201肽段可能作为CD4⁺T细胞表位，促进抗gp210抗体的产生^［12］。在基因层面，推测人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和肿瘤坏死因子受体相关因子1基因的多态性可能与抗gp210抗体的生成相关，但对抗gp210抗体阳性组和阴性组的GWAS（全基因组关联研究）队列进行分析，并未发现显著的SNP（单核苷酸多态性）位点^［13］。抗gp210抗体在诊断AMA阴性PBC中具有高特异度（75%～99%）、低敏感度（11%～55%）的特点^［14-17］。目前，临床常用ELISA测定抗gp210抗体水平。de Liso等^［17］研发了一种新型gp210抗原，将gp210肽与修饰的人血清白蛋白C端序列融合，有效解决了小肽抗原与聚苯乙烯结合力弱的问题，从而提高了抗体的结合效率，增强了ELISA检测的敏感性。

1.2 抗-NUP62抗体

NUP62位于NPC的中央通道内，富含甘氨酸重复序列，对NPC的物质运输功能具有重要作用^［10］。目前，关于NUP62抗体在PBC诊断中应用的研究较少，但已有研究表明，NUP62抗体的ELISA检测对AMA阴性PBC患者的敏感性和特异性分别达到36%和98%^{［16，18］}。此外，NUP62抗体在受损的胆管中浓度增加，可能与诱导胆管细胞的自噬和衰老有关^［9］。

1.3 抗sp100抗体

sp100是一种与PML核体相关的蛋白，其免疫荧光染色遍布整个细胞核但不涉及核仁。sp100同样与线粒体和大肠埃希菌存在PDC-E2的分子模拟现象。与抗gp210抗体不同，PBC患者的sp100自身抗体可识别多个表位，因此部分患者在疾病进展和熊去氧胆酸治疗过程中可能发生抗sp100表位变化，但整体抗sp100抗体状态保持不变^［19］。近期的GWAS发现，HLA-DRB1^*03∶01是与抗sp100抗体产生关联最强的等位基因，而PBC发病的主要风险等位基因（如HLA-DRB1^*08∶03和HLA-DRB1^*07∶01）与抗sp100抗体的关联较弱^［13］，表明疾病易感性与sp100抗体产生的遗传基础存在分离。不同研究中，抗sp100抗体诊断AMA阴性PBC的敏感性（16%～65%）和特异性（83%～99%）存在差异^［17］。抗sp100抗体水平在PBC的不同时期较为稳定，病理分期研究显示，其在早期PBC患者中的阳性率为16.7%，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中分别为15.3%和19.5%，这种稳定性有助于亚临床或早期PBC患者的诊断^［20］。

1.4 抗sp140抗体和抗PML抗体

sp140结构与sp100相似，其氨基酸末端部分与sp100的相应区域具有约50%的同源性，均为PML核体蛋白。PML作为PML核体骨架结构的主要成分^［21］，其核体主要定位于细胞核中，参与基因转录调控、蛋白质合成、细胞增殖和分化等生物学过程^［22］。抗sp140和抗PML抗体通常伴随抗sp100抗体出现，反之则不成立^［23］，因此单独针对抗sp140或抗PML抗体在PBC诊断中作用的研究相对较少。尽管PML抗原在PBC的肝脏组织中高表达，提示其可作为区分其他胆汁淤积性肝病的潜在组织学标志物^［24］，但在临床实践中，检测血清抗sp140或抗PML抗体水平的无创性辅助诊断方法尚未普及。

2 其他生物标志物

2.1 抗Kelch样蛋白12（kelch-like protein 12，KLHL12）和抗己糖激酶1（hexokinase 1，HK1）抗体

KLHL12位于细胞核内，包括BTB/POZ、Kelch和BACK共3个结构域，其中BTB/POZ结构域负责与Cullin 3蛋白结合；Kelch结构域用于识别和招募底物；BACK结构域则连接上述2个功能区^［25］。KLHL12主要负责胶原蛋白的运输及Dishevelled蛋白的泛素化调控^［26］。HK1位于线粒体外膜，作为三羧酸循环的关键酶，可催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。除参与细胞的能量代谢，HK1还能与线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道的氨基酸残基相互作用，抑制细胞色素c的释放，防止细胞凋亡^［23］。

Norman等^［27］利用高密度人类重组蛋白微阵列的蛋白组学技术，发现PBC患者中抗-KLHL12和抗-HK1抗体水平异常升高；在后续ELISA验证中，这2种抗体在AMA阴性PBC患者中的检出率分别为35%和22%。随后几年，Norman在欧洲和北美5个临床试验中心的PBC人群中开展抗-KLHL12和抗-HK1抗体的检测研究，结果显示，这2种抗体在AMA阴性PBC患者中的阳性率分别为10.3%～80.0%和11.8%～40.0%，数据结果存在较大波动，可能与各临床中心样本数量和种族人群异质性相关^［28］。联合检测结果显示，AMA阴性患者中至少对一种抗体呈阳性的比例为38.4%，因此联合检测抗-KLHL12和抗-HK1抗体可提高AMA阴性PBC患者的诊断覆盖率。我国最新研究报告显示，抗-KLHL12抗体诊断AMA阴性PBC的敏感性、特异性分别为12.5%、98%，抗-HK1抗体的敏感性、特异性分别为33.3%、98%，与以往研究结果一致^［29］；亚洲人群数据的补充，进一步验证了这2种抗体作为全球通用生物诊断标志物的可行性^［30］。此外，多数研究显示抗-HK1抗体水平高于抗-KLHL12抗体，这可能与两者的抗原定位差异相关（HK1位于细胞质中，而KLHL12位于细胞核内）。

2.2 自体脂肪酶（autotaxin，ATX）

ATX是一种由外核苷酸焦磷酸二酯酶基因编码的分泌型溶脂磷酶，通过催化溶血磷脂酰胆碱水解生成具有生物活性的溶血磷脂酸，参与胰岛素抵抗、细胞运动迁移、血管生成、血小板聚集、免疫炎症反应调节等多种生物途径^［31］。ATX与PBC发生的因果关系尚未明确，为了评估ATX在PBC患者中的诊断价值，Yang等^［32］应用竞争性抑制ELISA检测PBC患者和健康对照者的ATX水平，结果显示，PBC患者的ATX水平显著高于健康对照者（中位数：60.7 ng/mL vs 32.6 ng/mL，P<0.001），ATX的敏感性和特异性分别达到54.3%和93.1%。在AMA阴性PBC患者中，ATX的阳性率高达50%，这一比例高于抗gp210抗体（11.1%）和抗sp100抗体（16.7%），因此ATX可作为AMA阴性PBC患者诊断的潜在生物标志物。但此研究并未纳入其他肝病患者作为对照，且ATX水平被证实在特发性肺纤维化、慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝及类风湿性关节炎中均会升高，还可能与肝细胞的自噬、迁移和肝纤维化相关^［33］。未来诊断实验研究应纳入更多慢性肝病与其他自身免疫性疾病患者作为对照，以探究不同人群及不同PBC分期患者的血清ATX水平差异。AMA阴性PBC患者血清生物标志物的诊断效能评价见表1。

3 AMA阴性PBC传统血清标志物的临床挑战

虽然抗gp210抗体和抗sp100抗体已被纳入国内外指南的诊断标准，但在AMA阴性PBC患者中，仅部分患者表现为ANA阳性，存在漏诊风险。ANA产生机制的复杂性及检测方法的局限性是其低敏感性的主要原因。在产生机制方面，遗传和感染因素均可能影响ANA的生成；此外，ANA主要的抗原靶点位于细胞核内，与AMA所针对的细胞质线粒体存在显著差异。在检测方法方面，临床上用于检测ANA的主要方法包括IF、ELISA和IB，这些技术通常用于定性或半定量分析，且自动化水平有限。为了提升检测技术的准确性，一种基于多颗粒载体的检测技术逐渐成为研究热点，该技术构建的包被特异性抗原表位的不同微球载体可同时检测多种自身抗体，实现联合诊断。Wang等^［34］研究表明，使用多重微球流式荧光免疫技术（multiplex bead‐based flow fluorescent immunoassay，MBFFI）联合检测AMA-M2、抗gp210和抗sp100抗体，结果与传统IF方法一致，且能提高AMA阴性PBC患者诊断的敏感性^［35］。Villalta等^［36］研究建议将抗-KLHL12和抗-HK1抗体纳入联合检测体系，但该新型检测技术在临床实际应用中仍面临成本高昂、缺乏统一的临界值标准、数据解读复杂等诸多挑战。未来需通过多中心验证研究，建立标准化的检测流程。

sp140、PML与sp100均属于PML核体组分。研究显示抗sp140和抗PML抗体几乎仅出现在抗sp100阳性患者中，反之则不成立^［37］。这表明sp100可能是针对PML核体免疫反应的首要靶点，随后通过抗原表位扩散机制扩展至sp140和PML，因此抗sp100抗体更常作为临床诊断标准。

目前，针对抗-KLHL12抗体、抗-HK1抗体和ATX的研究多基于小样本，缺乏大规模队列验证，研究数据有限，临床证据不足，因此尚未广泛应用。未来可借助MBFFI等新型高通量检测技术进行多种抗体联合检测，实现AMA阴性PBC诊断从单一抗体依赖向多抗体谱分析的转变（图1）。

4 可溶性免疫检查点和抗细胞因子抗体的诊断潜力

目前，在AMA阴性PBC患者的血清标志物识别中，普遍存在高特异性、低敏感性的问题。尽管新发现的ATX在AMA阴性PBC患者中的敏感性高达50%，但为了验证其在临床应用中的可行性，仍需开展进一步的临床研究。因此，持续探寻对AMA阴性PBC患者具有高效识别能力的诊断生物标志物具有必要性。

免疫检查点是免疫细胞产生的一类调节自身免疫功能的蛋白分子，能够抑制或促进免疫活动^［38］。PBC是肝脏免疫系统异常激活并攻击胆管上皮细胞的结果，因此研究PBC患者免疫检查点的组织学表达有助于理解PBC的发病机制，而血清可溶性免疫检查点的检测可为AMA阴性PBC患者的无创性诊断提供新思路。最新研究发现，PBC患者中可溶性CD134、淋巴细胞活化基因3蛋白（lymphocyte activation gene 3 protein，LAG-3）、程序性死亡受体1（programmed cell death protein-1，PD-1）、程序性死亡-配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）及T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）的水平显著高于健康对照组，与疾病进展呈正相关^［39］。其中，可溶性PD-L1和CD134的受试者操作特征曲线下面积（AUC）分别为0.970 4和0.966 7，其诊断性能优于GGT（0.957 7）和ALP（0.959 1）。CD134作为一种刺激性免疫检查点分子，能够增强单核细胞抗原呈递能力，放大T细胞活化效应，并促进促炎性细胞因子生成；PD-L1作为一种维持免疫耐受的抑制性免疫检查点分子，在抑制T细胞活化和扩增的初始阶段和再次免疫应答中发挥重要的调节作用。然而，这2种可溶性免疫检查点与多种肝脏疾病相关。例如，可溶性CD134与非酒精性脂肪性肝病的进程相关，可溶性PD-L1受体在自身免疫性肝炎和炎症性肠病中呈升高趋势^［40］。因此，若将可溶性免疫检测点纳入AMA阴性PBC患者无创性辅助诊断工具，需进一步扩大研究样本数量和病种范围，以提高其诊断特异性。

抗细胞因子抗体（anti-cytokine autoantibody，ACAA）是体内可中和或改变细胞因子活性的小分子，可调控细胞因子信号通路或改变细胞因子在循环中的半衰期，具备致病或缓解疾病的潜力^［41］，因此可用于疾病的早期诊断。例如，IFN-1抗体可用于诊断婴儿的抗磷脂综合征，IL-12和IL-23抗体可用于监测胸腺恶性肿瘤，高水平的抗B细胞激活因子抗体可能预示系统性红斑狼疮进入缓解期^［42］。尽管ACAA的产生机制及其在自身免疫性疾病发病中的具体作用尚未明确，但通过检测这些抗体的存在及水平变化，可实现疾病的早期识别与监测。目前，关于PBC患者中ACAA的水平及其与疾病进程的关联尚无文献报道，未来可对其进行探索性检测。

5 小结与展望

血清生物标志物检测是诊断AMA阴性PBC患者的一种经济高效且无创的方法，尽管抗gp210、抗sp100、抗sp140、抗PML、抗-KLHL12和抗-HK1等抗体在诊断时展现出较高的特异性，但敏感性普遍较低，这可能与抗体产生机制、靶点定位和检测方法相关。因此，AMA阴性PBC患者的无创性诊断仍面临临床挑战。可溶性免疫检查点和ACAA可能为新生物标志物的发现提供方向，未来研究应聚焦于优化已知生物标志物的检测手段，致力于发现具有更高敏感性的新生物标志物，以提高诊断效率和准确性。

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基金资助

国家自然科学基金(U24A20654)

国家自然科学基金(82170602)

吉林省自然科学基金自由探索重点项目(YDZJ202401427ZYTS)

吉林省肝脏代谢重点实验室(YDZJ202502CXJD002)

国家重点研发计划(2024YFE0213800)