丹葛解酲汤对酒精性肝病大鼠模型的改善作用及其机制分析

The mechanism of Dange Jiecheng decoction improving alcoholic liver disease in a rat model

摘要

目的 探讨丹葛解酲汤对酒精性肝病（ALD）大鼠的改善作用，并基于肿瘤蛋白P53/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）信号通路分析其机制。 方法 36只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组，每组9只。采用梯度灌胃56%酒精建立模型，同时灌胃给药，持续12周。实验结束收集大鼠血清和肝组织，检测大鼠血清中ALT、AST和TG水平，肝组织中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）和Fe²⁺水平；HE染色观察病理组织变化；油红O染色和普鲁士蓝染色分别观察肝组织脂肪及铁沉积情况；采用RT-qPCR和Western Blot法检测肝组织中P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1 mRNA和蛋白表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与正常组相比，模型组肝细胞排列紊乱，结构不完整，有炎症细胞浸润和大量脂肪空泡；血清中AST、ALT、TG和肝组织MDA、ROS、Fe²⁺水平均升高（P值均<0.01），P53、NOX1、PTGS2 mRNA及蛋白表达均增加（P值均<0.01），血清GSH水平及肝组织GPX4、FTH1 mRNA及蛋白表达均降低（P值均<0.01）。与模型组相比，丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组中大鼠肝细胞炎症减少，排列整齐，血清中AST、ALT、TG和肝组织MDA、ROS、Fe²⁺水平及P53、NOX1、PTGS2 mRNA及蛋白表达减少（P值均<0.05），GSH水平及肝组织GPX4、FTH1 mRNA和蛋白表达水平增加（P值均<0.05），肝组织脂肪变性改善和铁沉积减少（P值均<0.01）。 结论 丹葛解酲汤可有效改善ALD大鼠疾病进展，其机制可能与控调P53/GPX4通路抑制铁死亡有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of Dange Jiecheng decoction in improving alcoholic liver disease （ALD） in rats， as well as its mechanism of action based on the tumor protein P53/glutathione peroxidase 4 （GPX4） signaling pathway. Methods A total of 36 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group， model group， Dange Jiecheng decoction group， and compound Yiganling tablets group， with 9 rats in each group. The rats were given gradient intragastric administration of 56% alcohol to establish a model of ALD， and meanwhile， the corresponding drug was given by gavage for 12 consecutive weeks. After the experiment ended， serum and liver tissue samples were collected to measure the serum levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， and triglyceride （TG） and the levels of malondialdehyde （MDA）， reactive oxygen species （ROS）， glutathione （GSH）， and Fe²⁺； HE staining was used to observe histopathological changes， and oil red O staining and Prussian blue staining were used to observe fat and iron deposition in liver tissue， respectively； RT-qPCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of P53， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， NADPH oxidase 1 （NOX1）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， and ferritin heavy chain 1 （FTH1） in liver tissue. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the normal group， the model group had disordered arrangement and incomplete structure of hepatocytes with inflammatory cell infiltration and a large number of fat vacuoles， significant increases in the serum levels of AST， ALT， TG and the levels or activities of MDA， ROS， and Fe²⁺ in liver tissue （all P<0.01）， significant increases in the mRNA and protein expression levels of P53， NOX1， and PTGS2 （all P<0.01）， and significant reductions in the content of GSH in serum and the mRNA and protein expression levels of GPX4 and FTH1 in liver tissue （all P<0.01）. Compared with the model group， the Dange Jiecheng decoction group and the compound Yiganling tablets group had ordered arrangement of hepatocytes with a reduction in inflammation， significant reductions in the serum levels of AST， ALT， and TG， the levels of MDA， ROS， and Fe²⁺ in liver tissue， and the mRNA and protein expression levels of P53， NOX1， and PTGS2 in liver tissue （all P<0.05）， and significant increases in the content of GSH in serum and the mRNA and protein expression levels of GPX4 and FTH1 in liver tissue （all P<0.05）， as well as an improvement in hepatic steatosis and a reduction in iron deposition （all P<0.01）. Conclusion Dange Jiecheng decoction can effectively improve disease progression in rats with ALD， possibly by regulating the P53/GPX4 pathway and inhibiting ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

肝疾病，酒精性 / 丹葛解酲汤 / 铁死亡 / P53/GPX4 / 大鼠，Sprague-Dawley

Key words

Liver Diseases， Alcoholic / Dan Ge Jie Cheng Decoction / Ferroptosis / P53/GPX4 / Rats， Sprague-Dawley

酒精性肝病（ALD）的发生与长期大量饮酒密切相关，酒精在肝脏内代谢过程中产生的毒性物质对肝细胞造成损伤，进而引发炎症、脂肪变性、纤维化及肝硬化等病理改变，不仅严重影响患者的生活质量，还可能导致肝衰竭、肝癌等严重并发症^［1-2］。流行病学报告显示，全球每年因肝病死亡的人数约有200万，占死亡人数的4%，我国ALD的死亡率亦呈逐年增长趋势^［3-4］。因此，全面深入探究ALD的发病机制，寻找理想的治疗药物与靶标，已成为临床上的迫切需求。

铁死亡是一种非典型的程序性细胞死亡方式，主要通过铁依赖的脂质过氧化反应导致细胞死亡^［5］。大量研究表明，铁死亡是ALD发生发展过程中的关键因素^［6］。酒精代谢过程中会产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使肝脏处于氧化应激状态，进而引起脂质过氧化反应破坏细胞膜的完整性，导致肝细胞发生铁死亡^［7］。肿瘤蛋白P53是一种肿瘤抑制基因，直接调控多个与铁死亡相关的基因，影响ROS生成和铁死亡的过程^［8］。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是铁死亡的关键抑制因子，通过清除脂质过氧化物，降低细胞内氧化应激水平，影响细胞对铁死亡的敏感性^［9］。有研究证实，P53通过下调GPX4会促进肿瘤细胞发生铁死亡^［10］及加剧糖尿病脑缺血再灌注铁死亡^［11］。因此，P53/GPX4通路是调控铁死亡的重要机制。

丹葛解酲汤是由李东垣《脾胃论》中葛花解酲汤加减而来，有健脾化湿，活血调肝的功效。课题组前期通过网络药理学证实丹葛解酲汤能通过P53、细胞周期蛋白D1、Fos原癌基因等多靶点治疗ALD^［12］，并通过动物模型证明其可通过调控Kelch样ECH相关蛋白1/核转录因子红系2相关因子2信号通路，减轻氧化应激反应^［13］，但是否通过调节铁死亡途径尚未可知。故本研究以铁死亡为视角，基于P53/GPX4信号通路，探讨丹葛解酲汤改善ALD的作用机制，以此为中医药防治ALD提供更全面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

36只雄性SD大鼠，体质量180～200 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供［实验动物生产许可证号：SCXK（宁）2020-0001，实验动物使用许可证号：SCXK（宁）2025-0001］。饲养于宁夏医科大学实验动物中心，自由饮水进食。

1.1.2 药物与试剂

丹葛解酲汤中所用药物均购自宁夏医科大学附属中医医院^［13］。常规制备，浓缩至含生药2.8 g/mL，冷藏储存备用。复方益肝灵片（吉林紫鑫药业股份有限公司，批号：Z22025133）；56 ℃酒精（北京红星股份有限公司，批号：SC11511160310087）；AST试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：C010-2-1）；ALT试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：C009-2-1）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A003-1-2）；甘油三酯试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A110-1-1）；ROS试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：E004-1-1）；普鲁士蓝染色试剂盒（北京索来宝公司，批号：G1422）；P53抗体（美国Affinity公司，批号：AF0879）；GPX4抗体（美国Affinity公司，批号：DF6701）；前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）抗体（美国Affinity公司，批号：AF7003）；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）抗体（美国Affinity公司，批号：DF8684）；铁蛋白重链1（ferritin heavy chain1，FTH1）抗体（美国Affinity公司，批号：DF6278）；RNA提取液（武汉赛维尔科技有限公司，批号：G3013）；SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Remover）（武汉赛维尔科技有限公司，批号：G3337）；2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（武汉赛维尔科技有限公司，批号：G3326）。

1.1.3 仪器

Leica RM2255型石蜡切片机（上海徕卡显微系统有限公司）；Aperio LV1型切片扫描仪（德国Leica公司）；Amersham Imager 680RGB型超灵敏多功能成像仪（美国GE公司）；Stepone Plus型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司）；JXFSTPRP-CL型冷冻研磨机（上海净信）；Neofuge 13R低温高速离心机（德国Eppendorf）；LF-600T型Western Blot电泳及转膜系统（北京龙方科技有限公司）；ETC811型PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组

36只SD大鼠适应性喂养1周后，采用简单随机分组法分为正常组、模型组、丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组，每组9只。上午正常组给予等剂量的蒸馏水灌胃，其余各组给予56%酒精灌胃（第1～3天4 mL·kg^-1·d^-1；第4～7天6 mL·kg^-1·d^-1；第7天后10 mL·kg^-1·d^-1）^［14］，造模的同时灌胃给药（间隔８ｈ），丹葛解酲汤组每天按大鼠体质量12 g/kg灌胃丹葛解酲汤溶液，复方益肝灵片组碾碎稀释后每天按大鼠体质量21 mg/kg灌胃，正常组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水作为对照，持续12周（所有剂量均根据《实验动物学》剂量进行等效剂量换算，参照60 kg成人剂量）。

1.2.2 标本采集

给药结束后，所有大鼠禁食不禁水，3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射，腹主动脉取血，离心收集血清，于-80 ℃冰箱保存；同时快速打开腹腔，取肝组织于液氮中保存，另取适宜大小的肝组织分别用4%多聚甲醛固定。每组选取6只进行后续检测和分析。

1.2.3 血清肝功能和血脂水平检测

微板法检测大鼠血清中AST和ALT；GPO-PAP酶法检测TG含量。

1.2.4 肝组织铁死亡相关指标检测

采用免疫荧光法检测各组肝组织内ROS水平；TBA法检测MDA含量；微量酶标法检测肝组织中谷胱甘肽（GSH）含量；比色法检测Fe²⁺含量。

1.2.5 油红O染色

将肝组织冰冻切片，固定洗涤处理后浸入油红O染液中染色，蒸馏水浸洗切片，随后用苏木素染液复染，洗涤后封片，于显微镜观察大鼠肝脏的脂质沉积情况。使用Image J软件分析油红Ｏ染色面积比。

1.2.6 普鲁士蓝染色

将组织切片脱蜡复水，放入普鲁士蓝染液中浸染，蒸馏水冲洗，然后进行核复染，再次蒸馏水冲洗，脱水透明后使用中性树胶封片，显微镜下观察肝组织铁离子沉积情况。

1.2.7 RT-qPCR法检测肝组织中P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1 mRNA表达水平

从肝组织中提取总RNA，然后使用逆转录酶将mRNA转录成cDNA，接着在qPCR仪上进行扩增反应，设计并合成引物（武汉赛维尔科技有限公司），序列见表1。以GAPDH作为内参基因，通过RT-qPCR仪检测P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1基因及内参基因CT值，计算目的基因mRNA相对表达量。实验重复3次。

1.2.8 Western Blot检测肝组织中P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1蛋白表达水平

取大鼠肝组织，加入裂解液提取总蛋白，研磨、离心、取上清并测蛋白浓度，于100 ℃中变性。进行凝胶电泳、转膜、封闭，孵育一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，ECL显影，并用Image J软件进行分析。实验重复3次。

1.3 统计学方法

通过SPSS 21.0软件进行处理，计量资料以\overline{x}±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹葛解酲汤对ALD大鼠肝组织病理形态学的影响

与正常组相比，模型组肝细胞排列紊乱，结构不完整，有炎症细胞浸润和大量脂肪空泡；与模型组相比，丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组的肝细胞排列整齐，呈索状排列，结构完整，少量炎症细胞的浸润和少量脂肪空泡（图1）。

2.2 丹葛解酲汤对ALD大鼠血脂和肝功能的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中TG、ALT和AST水平均明显升高（P值均<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中TG、ALT和AST水平均明显下降（P值均<0.01）（表2）。

2.3 丹葛解酲汤对ALD大鼠铁死亡相关指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织GSH水平明显降低（P<0.01），Fe²⁺水平、MDA水平和ROS平均荧光表达强度均显著升高（P值均<0.01）；与模型组比较，丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组大鼠肝组织GSH水平均明显升高（P值均<0.05），Fe²⁺水平、MDA水平和ROS平均荧光表达强度均显著降低（P值均<0.01）（表3、图2）。

2.4 丹葛解酲汤对ALD大鼠肝组织脂质蓄积的影响

与正常组相比，模型组大鼠肝细胞内脂滴增多（P<0.01）；与模型组相比，丹葛解酲汤和复方益肝灵片干预后大鼠肝细胞内脂滴明显减少（P值均<0.01）（表4、图3）。

2.5 丹葛解酲汤对ALD大鼠肝组织铁离子沉积的影响

与正常组相比，模型组大鼠肝组织内可见明显蓝色颗粒，表明铁离子沉积面积增加（P<0.01）；与模型组相比，各给药组大鼠肝组织铁离子沉积面积明显减少（P值均<0.01）（表5、图4）。

2.6 丹葛解酲汤对ALD大鼠肝组织P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织P53、NOX1、PTGS2 mRNA相对表达量均明显增加（P值均<0.01），GPX4和FTH1 mRNA相对表达量均明显减少（P值均<0.01）；与模型组比较，丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组大鼠肝组织P53、NOX1、PTGS2 mRNA相对表达量均明显降低（P值均<0.05），GPX4和FTH1 mRNA相对表达量均明显升高（P值均<0.05）（表6）。

2.7 丹葛解酲汤对ALD大鼠肝组织P53、GPX4、NOX1、PTGS2、FTH1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织P53、NOX1、PTGS2蛋白表达增加（P值均<0.01），GPX4和FTH1蛋白表达减少（P值均<0.01）；与模型组比较，丹葛解酲汤组和复方益肝灵片组大鼠肝组织P53、NOX1、PTGS2蛋白表达均明显降低（P值均<0.05），GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显升高（P值均<0.05）（表7、图5）。

3 讨论

中医学中ALD属于“酒疸”“酒癖”“酒臌”等范畴。课题组结合多年临床经验，认为ALD是因长期嗜酒导致酒毒湿热之邪蕴结体内，损肝伤脾，肝失疏泄则气机不畅，脾湿健运则痰湿内生。同时酒毒损伤肝络，则瘀血内结。基于此提出ALD的治疗原则为分消酒湿，理气健脾，活血调肝，组方丹葛解酲汤。丹葛解酲汤在葛花解酲汤“理气健脾、分消酒湿”的基础上加以丹参、当归、川芎、山楂活血化瘀，黄芩清热解毒，柴胡、枳实疏肝消痞；当归、白芍、枸杞养血柔肝。全方肝脾同调，活血化瘀，与ALD病机相吻合。本研究采用梯度灌酒法建立ALD模型，结果显示大鼠血清中AST、ALT、TG含量均升高，油红O染色显示肝组织出现明显的脂肪变性，提示给予梯度灌酒大鼠的肝功能、血脂和肝脏脂质含量均升高，表明ALD模型成功建立。经丹葛解酲汤治疗后，肝组织脂肪变性明显改善，AST、ALT、TG含量显著降低，提示丹葛解酲汤对ALD具有一定的改善作用。

铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化产物积累引发的细胞死亡，其核心机制涉及铁代谢异常、ROS过度积累及脂质过氧化失衡^［15-16］。长期大量饮酒会损伤肝细胞，使得肝细胞内的铁释放到细胞外，在酒精等信号刺激下铁蛋白被送入溶酶体中将Fe³⁺还原为Fe²⁺，释放到细胞质中，导致细胞内Fe²⁺增多^［17］。大量的Fe²⁺通过芬顿反应催化脂质过氧化物转化为高毒性羟基自由基，加剧了ROS的生成，ROS积累会攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，生成MDA等产物^［18］，发生氧化应激反应。正常情况下，GSH在GPX4的作用下，可以中和脂质过氧化物，维持细胞内氧化还原平衡，但酒精代谢产物乙醛会与GSH结合，使其消耗增加，促进脂质过氧化的反应^［17］。因此，当饮酒导致GSH耗竭时，则无法有效清除脂质过氧化物，从而诱发铁死亡^［19］。FTH1参与铁代谢，可储存铁离子，当FTH1功能异常时，会导致细胞内游离二价铁离子增多^［20］。国外研究也通过实验证实了FTH1是星形角质细胞铁死亡的关键枢纽^［21］。本研究结果与此一致，与正常组相比，模型组大鼠的GSH活性降低，FTH1蛋白表达下降，Fe²⁺、ROS、MDA水平均显著升高，普鲁士蓝肝组织铁沉积增加，而经过丹葛解酲汤的干预后，GSH活性升高，FTH1蛋白表达增加，Fe²⁺、ROS、MDA水平均显著降低，普鲁士蓝肝组织铁沉积减少，说明丹葛解酲汤通过上调FTH1表达水平，减少大鼠肝细胞中Fe²⁺，抑制芬顿反应，减少ROS、MDA产生，抑制脂质过氧化反应，减少GSH的耗竭，从而抑制肝细胞发生铁死亡。

近些年来，越来越多的研究证实P53为调控铁死亡的关键因子^［22］。GPX4与铁死亡在神经系统疾病、心血管系统疾病等多种疾病的发生发展中扮演关键角色^［23］。作为调节铁死亡的P53经典路径，GPX4起到至关重要的作用。P53蛋白通过直接结合GPX4基因启动子P53响应元件（P53-RE），抑制其转录，导致GSH消耗，从而促进铁死亡的发生^［9］。有研究发现子宫内膜异位症大鼠模型中，加味少腹逐瘀汤通过上调P53、下调GPX4表达，诱导异位子宫内膜组织发生铁死亡，减轻炎性反应，从而对子宫内膜异位症起到治疗作用^［24］；鼠双微体基因2通过下调P53和上调GPX4抑制结肠癌细胞发生铁死亡^［25］。NOX1和PTGS2作为铁死亡的关键标志物，均可以生成ROS，引起脂质过氧化反应，诱导铁死亡^［26］。有研究表明，血管平滑肌细胞的分化与NOX1过表达引起铁死亡有关^［27］；此外，PTGS2作为中枢基因，与冠状动脉粥样硬化的铁死亡呈正相关^［28］。而本实验结果表明，与模型组相比，丹葛解酲汤组大鼠P53、PTGS2和NOX1表达水平降低，GPX4表达增高，说明丹葛解酲汤通过下调P53蛋白，促进GPX4的表达，恢复GPX4的抗氧化能力，且同时下调铁死亡标志物PTGS2和NOX1，减少 ROS，来抑制脂质过氧化和铁死亡，表明P53/GPX4信号通路可能是该方改善ALD的潜在作用靶点，为临床防治ALD及药物研发提供一定的思路。

综上所述，丹葛解酲汤可通过减轻肝脂肪变性，抑制脂质过氧化和铁死亡来改善ALD，其机制可能与下调P53表达，促进GPX4蛋白表达有关。本研究为中医药防治ALD提供了新的视角，但是ALD的发病机制复杂，丹葛解酲汤改善ALD的具体作用机制后续还需要结合体内外实验进一步阐明。

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