扶正化瘀胶囊对代谢相关脂肪性肝病肝纤维化小鼠模型疤痕相关巨噬细胞的调控作用及机制分析

Regulatory role and mechanism of Fuzheng Huayu Capsule on scar-associated macrophages in a mouse model of liver fibrosis in metabolic associated fatty liver disease

摘要

目的 从调控疤痕相关巨噬细胞（SAM）角度探讨扶正化瘀胶囊改善代谢相关脂肪性肝病肝纤维化的分子机制。 方法 24只C57小鼠随机分为对照组（Con组）、模型组（Model组）和扶正化瘀胶囊组（FZHY组）。采用高脂饮食（HFD）联合CCl₄腹腔注射6周构建代谢相关脂肪性肝病肝纤维化小鼠模型。自造模第2周起，连续灌胃5周，FZHY组小鼠给予扶正化瘀胶囊灌胃，Con组和Model组以等量生理盐水灌胃。检测血清肝酶、肝脏甘油三酯（TG）及羟脯氨酸（Hyp）含量。观察肝组织HE及天狼星红染色情况。取Model组和FZHY组肝组织样本各3例，进行转录组测序探究扶正化瘀胶囊改善代谢相关脂肪性肝病肝纤维化的分子机制。Western Blot和RT-qPCR检测肝组织中SAM 标志物白细胞分化抗原9（CD9）和髓系细胞触发受体2（TREM2）、SAM促纤维化功能基因包括转化生长因子-β1（TGF-β1）、血小板源性生长因子β（PDGFβ）、TNF超家族成员12（TNFSF12）及上游调控分子转录激活因子3（ATF3）的蛋白/基因表达。采用扶正化瘀胶囊含药血清干预脂多糖（LPS）联合TGF-β1诱导的促炎骨髓来源巨噬细胞（BMDM），免疫荧光、Western Blot和RT-qPCR检测TREM2和ATF3的表达。计量资料两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 FZHY组小鼠肝脏肝酶、肝组织TG和Hyp含量、NAS评分以及天狼星红染色阳性面积较Model组显著降低（P值均<0.01）。RNA-seq分析显示差异基因主要富集于趋化因子信号通路，扶正化瘀胶囊能够显著下调C-C基元趋化因子配体2、CX3C趋化因子配体1及其受体CX3C趋化因子受体1的表达（P值均<0.01）。扶正化瘀胶囊显著降低小鼠肝组织CD9和TREM2，以及ATF3的蛋白及基因表达水平（P值均<0.05）。扶正化瘀胶囊体外显著降低小鼠肝组织TGFβ1、PDFGB和TNFSF12 mRNA表达（P值均<0.01）。扶正化瘀胶囊减弱促炎BMDM细胞中TREM2荧光强度，并显著降低促炎BMDM中 ATF3的mRNA和蛋白表达（P值均<0.05）。 结论 扶正化瘀胶囊具有较好的改善小鼠代谢相关脂肪性肝病肝纤维化的作用，其作用机制可能与下调ATF3表达抑制SAM相关。

Abstract

Objective To investigate the molecular mechanism of Fuzheng Huayu Capsule in improving liver fibrosis in metabolic associated fatty liver disease by regulating scar-associated macrophages （SAMs）. Methods A total of 24 C57 mice were randomly divided into control group （Con group）， Model group， and Fuzheng Huayu Capsule group （FZHY group）. Mice were given a high-fat diet and intraperitoneal injection of CCl₄ for six weeks to establish a model of liver fibrosis in metabolic associated fatty liver disease. The drug was given by gavage for 5 consecutive weeks since week 2 of modeling. FZHY group was administered Fuzheng Huayu Capsule via oral gavage， while the Con and Model groups received an equal volume of saline solution via oral gavage. The serum levels of liver enzymes were measured， as well as the levels of triglyceride （TG） and hydroxyproline （Hyp） in the liver. HE staining and picrosirius red staining were used to observe liver tissue. Three liver tissue samples were collected from the Model group and the FZHY group， and transcriptome sequencing was performed to investigate the molecular mechanism of Fuzheng Huayu Capsule in improving liver fibrosis in metabolic associated fatty liver disease. Western blot and RT-qPCR were used to measure the protein and/or mRNA expression levels of SAM markers （CD9 and triggering receptor expressed on myeloid cells 2 ［TREM2］）， profibrogenic genes （transforming growth factor-β1 ［TGFβ1］， platelet-derived growth factor subunit beta ［PDGFβ］， and TNF superfamily member 12 ［TNFSF12］）， and the upstream regulator activating transcription factor 3 （ATF3） in liver tissue. The serum containing Fuzheng Huayu Capsule was used for the intervention of pro-inflammatory bone marrow-derived macrophages （BMDMs） induced by lipopolysaccharide and TGF-β1， and immunofluorescence assay， Western blot， and RT-qPCR were used to measure the expression levels of TREM2 and ATF3. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups， and a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， while the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the Model group， the FZHY group had significant reductions in the levels of liver enzymes， the levels of TG and Hyp in the liver， NAS score， and Sirius Red staining-positive area （all P<0.01）. The RNA-seq analysis showed that differentially expressed genes were mainly enriched in chemokine signaling pathways， and Fuzheng Huayu Capsule significantly downregulated the expression of CCL2， CX3CL1， and CX3CR1（all P<0.01）. Fuzheng Huayu Capsule significantly reduced the protein and mRNA expression levels of CD9， TREM2， and ATF3 in liver tissue （all P<0.05）. In vitro， Fuzheng Huayu Capsule significantly reduced the mRNA expression levels of TGFβ1， PDGFβ， and TNFSF12 in liver tissue （all P<0.01）. Fuzheng Huayu Capsule also attenuated TREM2 fluorescence intensity in pro-inflammatory BMDMs and significantly reduced the mRNA and protein expression levels of ATF3 （all P<0.05）. Conclusion Fuzheng Huayu Capsule has a marked therapeutic effect on mice with liver fibrosis in metabolic associated fatty liver disease， possibly by downregulating the expression of ATF3 and inhibiting SAMs.

Graphical abstract

关键词

代谢相关脂肪性肝病 / 肝纤维化 / 扶正化瘀胶囊 / 巨噬细胞 / 转录激活因子3 / 小鼠， 近交C57BL

Key words

Metabolic Associated Fatty Liver Disease / Liver Fibrosis / Fuzheng Huayu Capsules / Macrophages / Activating Transcription Factor 3 / Mice， Inbred C57BL

代谢相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD）是一种与代谢综合征密切相关的慢性肝损伤疾病，涵盖了从代谢相关脂肪肝、脂肪性肝炎，到肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌的广泛疾病谱^［1-2］。在这一疾病进程中，肝纤维化是导致MAFLD不良结局的关键危险因素^［2-3］，因此，阻断肝纤维化进程对于防止疾病进一步恶化具有至关重要的意义。脂肪性肝纤维化的发病机制复杂，巨噬细胞在其中发挥重要作用。在肝损伤时，大量单核/巨噬细胞被募集到肝脏，参与炎症反应，并刺激肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）活化，进而产生胶原^［4-5］。随着研究深入，近年来发现了一类新的巨噬细胞亚群——疤痕相关巨噬细胞（scar-associated macrophages，SAM），这类细胞由单核/巨噬细胞分化而来，以白细胞分化抗原9（cluster of differentiation 9，CD9）和髓系细胞触发受体2 （triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）为标志物，具有活化HSC的作用^［6-7］。研究发现，SAM在正常肝组织中表达水平较低，而在代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）患者肝脏中，SAM在纤维化区域周边显著高表达，并且与纤维化标志基因的表达呈正相关^［8-9］。这表明SAM在肝纤维化进程中可能发挥关键作用。扶正化瘀胶囊已获批应用于临床抗纤维化的治疗且疗效确切^［10］，但其能否通过抑制SAM起效尚未阐明。本研究拟整合体内外模型，阐明该复方经SAM抗纤维化的机制与前景。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只4~5周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，购于上海南方模式生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0002，动物使用许可证号： SYXK（沪）2020-0009。实验动物于上海中医药大学实验动物中心饲养。

1.2 药物及主要试剂

扶正化瘀胶囊浸膏粉（组成：丹参4 g、桃仁2 g、绞股蓝6 g、松花粉2 g、虫草菌丝8 g、五味子2 g；批号180206）由上海黄海制药提供。60%能量供给来源于高脂饲料（货号：D12492i），购自美国Research diets公司。ALT检测试剂盒（货号：C009-2-1）、AST检测试剂盒（货号：C010-2-1）和羟脯氨酸（Hyp）检测试剂盒（货号：A030-2-1）购自南京建成生物科技有限公司。甘油三酯（TG）检测试剂盒（货号：A0-10017）购自浙江东瓯诊断产品有限公司。天狼星红染色试剂盒（货号：A606358） 购自生工生物工程科技有限公司。CD9（货号：20597-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；TREM2（货号：A10482）、转录激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）（货号：A13469）和GAPDH（货号：A19056）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司； DMEM培养基（货号：10-013-CV）和胎牛血清（货号：10099-141）购自美国Corning公司；青链霉素混合液（货号：CB010）购自雅酶生物医药科技有限公司；转化生长因子-β1（TGF-β1）（货号：100-21C-1MG）购自美国PeproTech公司；脂多糖（LPS） （货号：L4005）购自美国Sigma公司。

1.3 动物实验

1.3.1 分组、造模及给药

小鼠适应性喂养1周后，按体重随机区组分为对照组（Con组）8只、模型组（Model组）8只和扶正化瘀胶囊组（FZHY组）8只，Model组和FZHY组小鼠给予高脂饮食（HFD）联合10 % CCl₄橄榄油溶液（2 mL/kg）腹腔注射，每周3次，持续6周。Con组小鼠给予基础饲料联合等量橄榄油腹腔注射。实验第2周开始给药，FZHY组小鼠给予4.8 g/kg扶正化瘀胶囊灌胃，Con组和Model组以等量生理盐水灌胃，共5周。实验结束后麻醉小鼠取血清及肝组织样本。

1.3.2 生化法检测小鼠外周血ALT、AST和肝脏TG、Hyp水平

按试剂盒说明书检测血清ALT和AST活性。称取50 mg肝组织，加入丙酮和无水乙醇，酶法检测肝组织中TG含量。称取80 mg肝组织，采用碱水解法测定肝脏Hyp含量。重复检测3次。

1.3.3 HE染色及天狼星红染色观察肝组织病理变化

肝组织固定脱水后以4 μm厚度制作石蜡切片。使用HE试剂盒和天狼星红染色试剂盒进行染色，镜下观察拍照，进行NAS评分，Image J计算天狼星红阳性面积。

1.3.4 免疫组化观察肝组织中CD9和TREM2表达

石蜡切片经抗原修复后进行内源性过氧化物酶活性阻断并封闭，一抗（CD9稀释比为1∶2 000，TREM2稀释比为1∶2 000）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育后DAB显色，细胞核以苏木精着色，镜下观察拍照。

1.3.5 RNA-seq检测扶正化瘀胶囊干预后差异基因

选取Model组和FZHY组各3只小鼠肝组织以Trizol法提取总RNA，检测合格后，进行文库构建，使用Illumina HiSeq 4000进行测序。质控后以P<0.05且基因表达差异倍数对数值的绝对值（|log₂FC|>1）为标准确定差异基因集，进行GO富集分析、KEGG富集分析等。

1.4 细胞实验

1.4.1 骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）分离培养

参考Bailey、Watanabe等^［11-12］方法分离得到BMDM，并分为对照组（Con组）、模型组（Model组）和扶正化瘀含药血清组（FZHY组）。Model组于空白血清完全培养基（10%空白血清+90%DMEM+1%青霉素/链霉素）中加入50 ng/mL LPS和5 ng/mL TGF-β1^［13］，培养24 h诱导活化；FZHY组在相同刺激条件下以等量扶正化瘀含药血清替代空白血清；Con组仅用空白血清完全培养基处理。

1.4.2 免疫荧光染色观察BMDM中TREM2表达情况

细胞分组同前，细胞固定、透化、封闭，加入TREM2抗体（稀释比例1∶200）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入二抗孵育。DAPI染色后镜下观察拍照，TREM2阳性细胞质呈现绿色，核呈蓝色。绿色越强，表示蛋白表达程度越高。

1.5 Western Blot检测肝组织及BMDM细胞中CD9、TREM2和ATF3蛋白表达情况

小鼠肝组织蛋白以每孔30 μg上样检测CD9、TREM2和ATF3蛋白表达 （一抗稀释比例分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000），GAPDH为参照，利用lmage J分析灰度值。

1.6 RT-qPCR检测CD9、TREM2、TGF-β1、血小板源性生长因子β（PDGFβ）、TNF超家族成员12（TNFSF12）和ATF3 mRNA表达水平

以Trizol法提取总RNA，逆转录后采用三步法PCR程序进行PCR扩增。以GAPDH为参照计算相对表达量。引物序列如表1所示。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0和GraphPad prism 9.0统计软件进行统计学分析。所有计量资料均检验正态性和方差齐性，符合正态分布时以\overline{x}\pm s表示， 两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠血清ALT、AST水平和肝脏TG、Hyp含量的影响

Model组小鼠血清ALT、AST水平较Con组显著升高（P值均<0.01）；与Model组相比，FZHY组小鼠血清ALT、AST含量显著降低（P值均<0.01）。Model组小鼠肝脏TG和Hyp含量较Con组显著升高（P值均<0.01）；与Model组相比，FZHY组小鼠肝脏TG和Hyp含量显著降低（P值均<0.01）（表2）。

2.2 扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠肝脏病理变化的影响

HE染色结果显示，Con组肝细胞排列规则、中央静脉清晰；Model组见假小叶、脂滴空泡、坏死及炎症浸润；FZHY组脂滴数量较Model组减少，炎症浸润程度较低。天狼星红染色结果表明，Con组无胶原沉积；Model组汇管区及中央静脉周围大量胶原纤维并形成纤维间隔；与Model组相比，FZHY组胶原沉积显著减少，FZHY组NAS评分及天狼星红阳性面积显著降低（P值均<0.01）（图1）。

2.3 小鼠肝组织RNA-seq分析

GO富集示扶正化瘀胶囊干预代谢相关脂肪性肝纤维化主要涉及胶原激活信号通路、淋巴细胞趋化及胶原分解等生物过程与趋化因子激活等分子功能（图2）；KEGG分析提示其作用机制与趋化因子信号通路相关（图3）。其中，调控单核/巨噬细胞募集的关键趋化因子CCL2（C-C基元趋化因子配体2）、CX3CL1（CX3C趋化因子配体1）及其受体趋化因子CX3CR1（CX3C趋化因子受体1）的基因表达水平在FZHY组表达均显著低于Model组（P值均<0.01）（图4）。

2.4 扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠SAM特异性高表达基因表达的影响

鉴于SAM是驱动纤维化的关键巨噬细胞亚群，分析RNA-seq数据发现扶正化瘀胶囊显著下调其标志物CD9和TREM2及促纤维化配体SPP1（分泌型磷蛋白1）、GPNMB（非转移性黑色素瘤糖蛋白B）、TGF-β1、PDGFβ、TNFSF12和受体CSF1R（集落刺激因子1受体）和NOTCH2的表达（P值均<0.05）（图5）。PCR结果进一步证实CD9和TREM2以及TGF-β1、PDGFβ和TNFSF12 mRNA在Model组中显著升高，而扶正化瘀胶囊干预则显著逆转了Model组的这种升高趋势（P值均<0.05）（图6）。

2.5 扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠肝组织中CD9和TREM2表达的影响

对各组肝组织连续切片进行免疫组织化学染色，结果显示：Con组未观察到明显的棕黄色染色区域；而在Model组的炎性浸润区域，可见大量棕黄色阳性信号，表明CD9和TREM2的表达显著增加。相比之下，FZHY组肝组织仅可见少量浅棕黄色区域。此外，Model组CD9和TREM2蛋白表达水平较Con组均显著升高（P值均<0.05）（图7）。

2.6 扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠肝组织中ATF3表达的影响

与Con组相比，Model组中ATF3蛋白和mRNA表达均显著升高（P值均<0.05）；而FZHY组ATF3蛋白和mRNA均显著低表达（P值均<0.01）（图8）。

2.7 扶正化瘀胶囊对促炎BMDM细胞中SAM标志物及ATF3表达的影响

与Con组相比，Model组中TREM2表达明显增加，而扶正化瘀胶囊抑制了LPS和TGF-β1诱导的BMDM细胞TREM2的表达（图9）。与Con组比较，Model组ATF3的蛋白和mRNA表达均增加（P值均<0.01），而FZHY组较Model组ATF3蛋白和mRNA显著低表达（P值均<0.05）（图10）。

3 讨论

扶正化瘀胶囊乃上海中医药大学自主研发的抗肝纤维化有效验方，其基于肝纤维化“气阴两虚、瘀血阻络、肝失所养”之基本病机而创制，具备扶助正气、活血祛瘀、益精养肝之功效，可显著改善患者症状并有效防治并发症^［14］。

MAFLD及其进展期MASH已成为全球公共卫生的重要挑战。流行病学数据显示，中国现有脂肪性肝纤维化患者约5 000万例^［15］。为模拟高热量饮食等代谢紊乱因素对肝纤维化的影响，本研究采用高脂饮食联合低剂量CCl₄腹腔注射的复合模型。相较于高脂或西方饮食，该模型可在较短时间内诱发显著脂肪变性、炎症及气球样变，并避免长期化学诱导所致的高病死率^［16］。其基因表达及免疫紊乱特征亦与人类MASH较为一致^［17-18］，是复现MAFLD/MASH全病程的可靠工具。实验结果显示，扶正化瘀胶囊可显著改善模型小鼠肝功能，减少肝脂质沉积和胶原积聚，有效缓解MAFLD肝纤维化。值得注意的是，与前期高脂高反式脂肪酸饮食诱导的模型^［10］相比，扶正化瘀胶囊在本研究采用的饮食联合化学诱导模型中表现出更为综合的改善脂代谢、抗炎及抗纤维化作用。这可能与两种模型的病理特征及药物干预时机不同有关。

为深入探究扶正化瘀胶囊改善MAFLD肝纤维化的机制，本研究进一步通过RNA-seq分析发现，扶正化瘀胶囊干预后显著抑制趋化因子信号通路，下调单核/巨噬细胞趋化轴CCL2、CX3CL1及其受体CX3CR1的表达，提示其通过阻断单核/巨噬细胞肝脏募集发挥抗纤维化作用。巨噬细胞是肝纤维化的关键驱动者，活化后释放大量促炎及促纤维化因子，激活HSC^［19］。其中，SAM被证实为促纤维化核心亚群，在脂肪性肝细胞及纤维化瘢痕周围富集，其丰度与疾病严重程度呈正相关^［20-21］。SAM高表达TGF-β、TNFSF12、PDGFβ等促纤维化基因，可直接激活HSC并增强TGF-β介导的胶原沉积^［22-23］。已有研究证实，减少SAM数量或阻断其分化可显著缓解肝纤维化^［23-24］。本研究发现，扶正化瘀胶囊显著下调SAM标志物及其关键促纤维化配体的表达，提示扶正化瘀胶囊可能通过调控SAM抑制肝纤维化进展。

转录因子ATF3兼具应激应答与免疫调控双重功能。最新研究表明，ATF3可直接上调CD9和TREM2，驱动髓系巨噬细胞向SAM分化^［25］。ATF3在肝纤维化患者及模型小鼠的受损肝细胞和活化HSC中异常高表达，沉默ATF3可显著抑制HSC活化及纤维化基因表达^［26］。此外，ATF3通过上调CXC趋化因子配体14增强TGF-β信号，加速胶原沉积^［27］。本研究首次发现：扶正化瘀胶囊在HFD联合CCl₄小鼠模型中显著下调ATF3表达。为模拟纤维化微环境，笔者采用LPS联合TGF-β1诱导BMDM向促炎表型分化，结果显示，扶正化瘀胶囊含药血清可同步抑制BMDM中ATF3与TREM2的表达。综上，扶正化瘀胶囊可能通过抑制ATF3阻断巨噬细胞向SAM极化，进而阻断SAM-HSC促纤维化轴，发挥抗肝纤维化效应。

综上，本研究首次揭示扶正化瘀胶囊通过下调转录因子ATF3，减少SAM数量及其促纤维化配体表达，从而缓解MAFLD肝纤维化，为临床干预提供了新的分子靶点。然而，研究主要聚焦SAM及其通路，未涉及其他潜在细胞类型及信号网络；扶正化瘀胶囊调控ATF3的上游机制亦未阐明。后续需多维度验证，以全面揭示其抗纤维化机理。

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基金资助

上海市青年科技英才扬帆计划项目(23YF1448200)