乙型肝炎病毒基因组整合的研究进展

Research advances in hepatitis B virus genome integration

摘要

乙型肝炎病毒（HBV） DNA整合是慢性乙型肝炎（CHB）实现功能性治愈和阻断肝癌发生所必须克服的核心障碍。在病毒逆转录过程中，占总量5%～10%双链线性DNA随机插入宿主染色体，形成持续存在的整合DNA（iDNA）并持续表达乙型肝炎病毒表面抗原，驱动B细胞与T细胞免疫耗竭，从而维持机体的免疫耐受状态。整合DNA贯穿整个感染自然史，并可能通过增强子促进潜能不确定的克隆性增生，逐步累积癌前突变，最终发展为肝细胞癌。长期核苷（酸）类似物或干扰素治疗虽可抑制病毒复制，减少HBV DNA整合，但现有手段仍难以彻底清除既有的iDNA。因此，未来亟需发展能够精准靶向整合断点、表观遗传沉默iDNA或清除整合克隆的创新策略，从而显著提升CHB的功能性治愈率，并从根源上降低肝细胞癌的发生风险。

Abstract

HBV DNA integration （iDNA） is the core barrier that must be overcome to achieve functional cure for chronic hepatitis B （CHB） and to prevent the occurrence of hepatocellular carcinoma （HCC）. During reverse transcription， 5%　—　10% of viral genomes are converted into double-stranded linear DNA that is randomly inserted into host chromosomes， generating stable iDNA and continuously producing HBsAg， thereby driving B- and T-cell immune exhaustion and locking the host in an immune-tolerant state. The process of iDNA runs throughout the entire natural history of HBV infection， and the viral enhancers it carries can promote clonal hyperplasia of indeterminate potential， accumulate pre-neoplastic mutations， and ultimately lead to HCC. Although long-term nucleos（t）ide analog or interferon therapy can suppress viral replication and reduce the formation of new integrations， existing therapies still fail to eliminate existing iDNA. Therefore， there is an urgent need for innovative strategies that can precisely target integration breakpoints， epigenetically silence iDNA， or eradicate integrated clones， so as to significantly increase the functional cure rate of CHB and fundamentally reduce the risk of HCC.

Graphical abstract

关键词

慢性乙型肝炎 / HBV DNA整合 / 癌，肝细胞

Key words

Chronic Hepatitis B / HBV DNA Integration / Carcinoma， Hepatocellular

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）感染仍是全球公共卫生面临的重大挑战，我国慢性HBV感染者约占全球总量的1/3。世界卫生组织估计，全球乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen， HBsAg）血清流行率为3.2%，而中国一般人群HBsAg流行率高达5.86%，约涉及7 500万人，明显高于全球平均水平^［1］。作为肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的首要病因，HBV感染的防控形势依然严峻：尽管预防性疫苗可有效阻断新发感染，但慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B， CHB）至今仍无法根治。

1 HBV结构与复制周期

HBV属于嗜肝DNA病毒科，其病毒颗粒包裹着约3.2 kb的松弛环状双链DNA（relaxed circular DNA， rcDNA）基因组，该基因组由病毒自身编码的衣壳蛋白包裹。HBV基因组包含4个启动子区，驱动4个高度重叠的开放阅读框进行转录翻译，最终编码7种病毒蛋白：HBsAg（包括大、中、小3种形式）、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen， HBcAg）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B viruse antigen， HBeAg）、HBV聚合酶及HBV X蛋白。

HBV颗粒先与肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽受体高亲和结合并脱去外膜，核衣壳随之进入细胞质；随后衣壳解体，rcDNA被递送至细胞核。在核内，rcDNA借助宿主DNA修复酶系“修复”为共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA， cccDNA）。cccDNA以游离微染色体形式长期存留，既转录产生编码结构蛋白和调节蛋白的亚基因组mRNA，也合成超过基因组全长度的前基因组RNA（pregenomic RNA， pgRNA）；pgRNA与病毒聚合酶一起被新生的核心颗粒包裹，在衣壳内部逆转录生成rcDNA或双链线性DNA（double-stranded linear DNA， dslDNA），经包膜后出芽释放。cccDNA的持久存在与dslDNA随机整合产生的iDNA，共同构成HBV难以根除的分子基础，两者持续提供病毒抗原，维持慢性感染状态^［2］。

2 HBV DNA整合机制

在逆转录过程中，HBV聚合酶以pgRNA为模板，先在其3′端的ε茎环结构内合成一段DNA寡核苷酸作为引物，负链延伸的同时，RNA酶H降解大部分pgRNA，仅保留其5′端带帽的片段。这些RNA寡核苷酸［含直接重复序列（direct repeatsequence， DR）1］作为正链引物，通常转移并结合至负链上的DR2区域启动合成，最终形成占90%～95%的rcDNA。若DR2互补效率因突变降低，引物可直接在DR1延伸，形成5%～10%的dslDNA。dslDNA是HBV DNA整合的首选底物，其入核后，借助宿主非同源末端连接等修复通路随机插入染色体（图1）。此外，肝脏炎症期氧化应激造成的肝细胞DNA断裂更为其提供了“现成入口”^［3］。

基于rcDNA与dslDNA这两大底物，学界归纳出6种整合范式：（1）“单链缺口”模型：rcDNA正链存在缺口，宿主DNA聚合酶在基因组复制时“跳读”至邻近HBV正链的5′单链区，随后发生重组，形成病毒-宿主融合；（2）DR介导的位点特异性重组模型：病毒DR1或DR2与宿主基因组中同源序列发生位点特异性重组，无需大片段同源性，实现精准插入；（3）“微同源”模型：宿主DNA与HBV rcDNA之间仅需3～8 bp的微同源序列即可引导聚合酶切换模板，重组断点即由该微同源区决定；（4）“滚入”模型（dslDNA专用）：dslDNA的游离末端直接“侵入”宿主DNA的单链断裂位点，通过链置换合成建立宿主-病毒连接；（5）“staggered黏端插入”模型：rcDNA负链在衣壳组装前脱离复制复合体；宿主DNA产生交错断裂形成黏性末端，不完整的病毒基因组嵌入后，两侧留下12 bp的“非病毒-非宿主”DR。（6）非同源末端连接/微同源末端连接依赖模型：dslDNA先去除末端的聚合酶蛋白与5′帽结构，随后借助宿主非同源末端连接或微同源末端连接插入DNA双链断裂位，其中微同源末端连接的插入方向由微同源序列决定^［4］。值得注意的是，上述机制并非互斥；整合一旦建立，局部基因组不稳定性及转座子活性仍可造成二次重排或“再易位”，从而持续重塑病毒-宿主基因组景观。

3 整合HBV DNA的分布特征

HBV dslDNA可整合至宿主所有染色体的任意位点，但其插入并非完全随机，表现为显著富集于转录活跃的基因组区域。肝细胞分裂过程中，携带特定iDNA的子代细胞可能因获得生长优势而发生克隆性扩增，逐步演变为癌前病变结节，最终进展为HCC。其中，人类TERT（端粒酶逆转录酶基因）及组蛋白甲基转移酶基因MLL4（KMT2B）是最常见的热点整合位点^［5］。HBV DNA整合片段通常保留从DR1至DR2的完整区域，涵盖HBsAg全编码序列，因而主要表达表面抗原蛋白。近期研究进一步揭示，相较于cccDNA来源的HBsAg，整合来源的HBsAg分泌效率显著降低，其分子机制主要是整合片段的核心启动子功能缺陷，导致增强子Ⅰ对preS1/preS2启动子的激活作用失衡，引发表面抗原大蛋白（L-HBsAg）过量表达，进而抑制表面抗原的整体分泌效率^［6］。然而，这些滞留在细胞内的L-HBsAg是否反向重塑整合位点附近的染色质微环境，尚需进一步验证。

4 HBV DNA整合的发生时相

HBV DNA整合事件贯穿慢性HBV感染的全过程。在慢性感染自然史的4个时期中，肝组织内均可检测到HBV cccDNA与iDNA^［7］。甚至在感染早期（包括儿童阶段）即可在肝组织和血清中检出iDNA^［8］。值得注意的是，急性HBV感染期同样可检出病毒DNA整合^［9］。然而，cccDNA与整合HBV DNA的相对丰度在不同感染阶段存在显著差异。HBeAg阳性期以cccDNA为主，而HBeAg阴性期则表现为整合HBV DNA占主导。郭海涛教授团队^［10］的研究阐明了这一转变的机制：免疫耐受期病毒大量复制产生dslDNA，部分发生整合，此阶段HBsAg主要来源于cccDNA；经历免疫清除期后，携带cccDNA的肝细胞被免疫系统清除而减少，而含iDNA的肝细胞不易被清除，同时新生肝细胞受HBV感染并形成新的整合；在HBeAg阴性期，携带整合HBV DNA的肝细胞得以存活，且整合片段所含的增强子区可促进肝细胞异常克隆性扩增，此时HBsAg主要来源于整合的HBV DNA。最新观点认为，整合HBV DNA的肝细胞比未整合的肝细胞更容易发生再次整合事件。

HBV DNA整合不仅是病毒持续感染的表现，更可能是一种主动参与肝脏疾病进程的机制。随着cccDNA池在免疫压力下被逐步减小，整合HBV DNA因其不易被免疫系统识别清除的特性，逐渐在疾病进程中发挥驱动作用。

5 整合HBV DNA对机体的影响

整合HBV DNA对机体的影响主要体现在致癌与诱导免疫耐受两方面（图1）：

5.1 致癌作用

HBV DNA整合是HCC发生的关键分子事件。CHB向HCC进展的过程中，携带整合的肝细胞克隆所占比例逐渐增加，当整合事件发生在HCC相关基因（如TERT启动子区或MLL4基因区）附近或内部时，可启动致癌级联反应，从HCC原始细胞扩增，进展为具有致癌整合的细胞克隆性增殖，最终发展为HCC^［5，11］。新近研究亦发现，新的HBV整合相关致癌基因如卷曲螺旋结构域含有蛋白91，其通过HBx蛋白C-末端截短突变/卷曲螺旋结构域含有蛋白91/乳酸脱氢酶A信号轴发挥促癌作用^［12］。然而HBV插入所致癌症相关基因的遗传学改变及致病机制仍远未阐明。

5.2 免疫耐受

整合HBV DNA的持续转录可导致HBsAg过量表达，进而诱导机体产生免疫耐受。一方面CHB患者体内HBsAg特异性B细胞分化缺陷，无法产生抗-HBs抗体。HBsAg特异性和整体B细胞中积累了CD21^–CD27^–非典型记忆B细胞，这些细胞高表达包括程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）在内的抑制性受体，在信号传导、归巢及抗体产生等方面表现异常，促进了PD-1高表达非典型记忆B细胞的产生，并损害了B细胞的免疫反应^［13］。另一方面，在慢性HBV感染过程中，由于持续暴露于表面抗原和炎症刺激，免疫检查点分子（PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、淋巴细胞活化基因3）常呈高水平且共表达状态，介导T细胞的功能耗竭^［14］。

CHB功能性治愈的核心标志是血清HBsAg的消失。HBsAg由cccDNA和整合到宿主基因组中的整合HBV DNA共同编码，且后者的转录不受核苷（酸）类似物抑制，导致基于此类药物的治疗难以实现HBsAg血清学清除^［15］。

HBsAg的持续表达所造成的免疫耐受，已成为CHB实现功能性治愈的主要障碍之一。未来的抗病毒治疗策略应着眼于整合片段的清除或抑制，同时通过激活机体免疫或阻断PD-1或淋巴细胞活化基因3等途径以实现免疫耐受的“松绑”，才有可能打破由HBV DNA整合所维持的耐受闭环。

6 抗病毒治疗对HBV DNA整合的影响

现有抗病毒药物在降低病毒载量的同时，亦可减少整合HBV DNA水平。一项关于富马酸替诺福韦二吡呋酯的随机双盲、安慰剂对照临床试验表明，为期3年的治疗可显著降低CHB患者肝内整合型与非整合型HBV DNA的载量^［16］。本研究团队观察到恩替卡韦治疗48周可使免疫清除期的CHB患者肝内HBV整合位点总数明显下降，且断点集中分布于HBV基因组nt1 600～1 900区域^［17］。核苷（酸）类似物治疗通过缩小cccDNA池以减少新整合事件的发生，长期治疗可使cccDNA与整合HBV DNA水平持续下降^［18］。干扰素治疗亦具有减少病毒整合的作用，研究显示实现功能性治愈的患者，其肝内整合HBV DNA的数量及其转录水平均显著低于未治愈组^［19］。然而，目前尚缺乏评估免疫耐受期CHB患者接受核苷（酸）类似物治疗获益的临床研究^［20］，因此早期启动抗病毒治疗能否有效阻断HBV DNA整合并降低远期HCC风险，仍有待进一步验证。

近年来，以RNA干扰（RNA interference， RNAi）和反义寡核苷酸为代表的新型抗病毒药物已相继进入临床试验阶段，并展现出确切的疗效与良好的安全性。RNAi药物ARC-520的Ⅰb期临床试验结果显示，该药可实现HBsAg与HBV RNA的持续显著下降，部分患者肝组织HBsAg阳性染色比例降至10%以下^［21］。尽管该研究未直接探讨ARC-520对HBV DNA整合的影响，但治疗后HBsAg显著下降，提示ARC-520可能减少了HBV DNA整合来源的HBsAg。另一项反义寡核苷酸药物Bepirovirsen的Ⅱb期试验表明，每周300 mg治疗24周可使9%～10%的慢性HBV感染者实现持续的HBsAg与HBV DNA消失^［22］。这一比例远高于核苷（酸）类似物治疗12个月后不足5%的HBsAg清除率，提示反义寡核苷酸类药物亦可能通过靶向iDNA转录的mRNA而降低其病毒学贡献。综上所述，这些新型疗法为攻克HBV DNA整合这一功能性治愈的关键障碍带来了新希望。

7 小结

HBV DNA整合是CHB功能性治愈和肝癌防控必须攻克的关键障碍。病毒逆转录产生的5%～10% dslDNA随机插入宿主染色体，优先整合至转录活跃区，可即时激活致癌基因或导致基因组不稳定。其整合片段持续表达的HBsAg会诱导B细胞与T细胞功能耗竭，形成免疫耐受，使得即便通过核苷（酸）类似物沉默cccDNA仍难以实现HBsAg阴转。尤为关键的是，HBV DNA整合贯穿感染全程，在HBeAg阴性期因cccDNA被免疫清除而iDNA占比反超，成为HBsAg主要来源，并借助其增强子序列赋予肝细胞克隆扩增优势，逐步累积癌前突变。长期核苷（酸）类似物治疗可通过抑制病毒复制减少新整合事件，而干扰素治愈者的整合数量及转录活性均显著降低。新型抗病毒药物如RNAi与反义寡核苷酸可能同时靶向cccDNA和iDNA来源的HBsAg转录本，为“双途径阻断”提供了可能。未来亟需开发能靶向整合断点、表观沉默iDNA或特异性清除整合克隆的新策略，从而将降低肝癌风险与提升功能性治愈率从具有“统计学意义”切实转化为“临床现实”。

参考文献

[1] YAN RY, SUN MH, YANG HY, et al. 2024 latest report on hepatitis B virus epidemiology in China: Current status, changing trajectory, and challenges[J]. Hepatobiliary Surg Nutr, 2025, 14(1): 66-77. DOI: 10.21037/hbsn-2024-754 .

[2] MA LL, CHEN SZ, WANG HY, et al. Hepatitis B virus integration and hepatocarcinogenesis[J]. Liver Res, 2025, 9(3): 189-198. DOI: 10.1016/j.livres.2025.09.002 .

[3] ZHANG MM, CHEN H, LIU H, et al. The impact of integrated hepatitis B virus DNA on oncogenesis and antiviral therapy[J]. Biomark Res, 2024, 12(1): 84. DOI: 10.1186/s40364-024-00611-y .

[4] BOUSALI M, PAPATHEODORIDIS G, PARASKEVIS D, et al. Hepatitis B virus DNA integration, chronic infections and hepatocellular carcinoma[J]. Microorganisms, 2021, 9(8): 1787. DOI: 10.3390/microorganisms9081787 .

[5] ZOULIM F, CHEN PJ, DANDRI M, et al. Hepatitis B virus DNA integration: Implications for diagnostics, therapy, and outcome[J]. J Hepatol, 2024, 81(6): 1087-1099. DOI: 10.1016/j.jhep.2024.06.037 .

[6] GU ZQ, JIANG QQ, ABULAITI A, et al. Hepatitis B virus enhancer 1 activates preS1 and preS2 promoters of integrated HBV DNA impairing HBsAg secretion[J]. JHEP Rep, 2024, 6(9): 101144. DOI: 10.1016/j.jhepr.2024.101144 .

[7] POLLICINO T, CAMINITI G. HBV-integration studies in the clinic: Role in the natural history of infection[J]. Viruses, 2021, 13(3): 368. DOI: 10.3390/v13030368 .

[8] CHEN Y, DONG Y, WEI SZ, et al. Genomic integration of hepatitis B virus into human hepatocytes in early childhood cirrhosis[J]. Liver Int, 2025, 45(4): e70080. DOI: 10.1111/liv.70080 .

[9] KIMBI GC, KRAMVIS A, KEW MC. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(41): 6416-6421. DOI: 10.3748/wjg.v11.i41.6416 .

[10] LAU DT, KIM ES, WANG ZL, et al. Differential intrahepatic integrated HBV DNA patterns between HBeAg-positive and HBeAg-negative chronic hepatitis B[J]. medRxiv, 2025. DOI: 10.1101/2025.02.28.25322668 . [Preprint]

[11] LI CL, HSU CL, LIN YY, et al. HBV DNA integration into telomerase or MLL4 genes and TERT promoter point mutation as three independent signatures in subgrouping HBV-related HCC with distinct features[J]. Liver Cancer, 2024, 13(1): 41-55. DOI: 10.1159/000530699 .

[12] LI MG, WU SS, LUO HQ, et al. HBV DNA integration gene CCDC91 is oncogenic and a potential therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J]. Commun Biol, 2025, 8(1): 1079. DOI: 10.1038/s42003-025-08369-1 .

[13] BURTON AR, PALLETT LJ, MCCOY LE, et al. Circulating and intrahepatic antiviral B cells are defective in hepatitis B[J]. J Clin Invest, 2018, 128(10): 4588-4603. DOI: 10.1172/JCI121960 .

[14] YU F, ZHU Y, LI SH, et al. Dysfunction and regulatory interplay of T and B cells in chronic hepatitis B: Immunotherapy and emerging antiviral strategies[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2024, 14: 1488527. DOI: 10.3389/fcimb.2024.1488527 .

[15] MARRAPU S, SONI JR, KAMAL K, et al. Hepatitis B functional cure: Current and future perspective[J]. World J Hepatol, 2025, 17(10): 110107. DOI: 10.4254/wjh.v17.i10.110107 .

[16] PAN DZ, SOULETTE CM, AGGARWAL A, et al. Effects of tenofovir disoproxil fumarate on intrahepatic viral burden and liver immune microenvironment in patients with chronic hepatitis B[J]. Gut, 2025, 74(4): 628-638. DOI: 10.1136/gutjnl-2024-332526 .

[17] ZHANG MY, ZHANG HK, CHENG XM, et al. Liver biopsy of chronic hepatitis B patients indicates HBV integration profile may complicate the endpoint and effect of entecavir treatment[J]. Antiviral Res, 2022, 204: 105363. DOI: 10.1016/j.antiviral.2022.105363 .

[18] TADDESE M, GRUDDA T, BELLUCCINI G, et al. Transcription of hepatitis B surface antigen shifts from cccDNA to integrated HBV DNA during treatment[J]. J Clin Invest, 2025, 135(6): e184243. DOI: 10.1172/JCI184243 .

[19] GAO N, GUAN GW, XU GL, et al. Integrated HBV DNA and cccDNA maintain transcriptional activity in intrahepatic HBsAg-positive patients with functional cure following PEG-IFN-based therapy[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2023, 58(10): 1086-1098. DOI: 10.1111/apt.17670 .

[20] KILANY MM, SONNEVELD MJ, FELD JJ, et al. Management of immune-tolerant chronic hepatitis B[J]. Hepatology, 2025. DOI: 10.1097/HEP.0000000000001407. DOI: 10.1097/HEP.0000000000001407 .

[21] YUEN MF, WONG DK, SCHLUEP T, et al. Long-term serological, virological and histological responses to RNA inhibition by ARC-520 in Chinese chronic hepatitis B patients on entecavir treatment[J]. Gut, 2022, 71(4): 789-797. DOI: 10.1136/gutjnl-2020-323445 .

[22] YUEN MF, LIM SG, PLESNIAK R, et al. Efficacy and safety of bepirovirsen in chronic hepatitis B infection[J]. N Engl J Med, 2022, 387(21): 1957-1968. DOI: 10.1056/nejmoa2210027 .

基金资助

国家自然科学基金(82361148722)

国家重点研发计划(2023YFC2308600)

国家重点研发计划(2024YFE0213800)

吉林省自然科学基金自由探索重点项目(YDZJ202401427ZYTS)

吉林省肝脏代谢重点实验室(YDZJ202502CXJD002)

吉林省卫生人才计划(JLSWSRCZX2025-098)